Ｖｏｌ．２５Ｎｏ．１２００６
李华芝
李秀艳
徐亚同
（华东师范大学资源与环境学院环境科学与技术系上海，２０００６２）
摘要该文综述了荧光原位杂交技术的发展、技术原理及其在环境微生物落研究中的应用，还探讨了该技术在应用中存在的问题，并对其应用前景进行了展望。
关键词
荧光原位杂交
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微生物是生态系统的重要组成部分，在各种元素的生物进化循环中起着关键作用。因此，研究微生物的落结构，借此了解微生物和环境的关系尤为重要。长久以来，微生物落结构的调查方法一直是建立在分离和培养的方法上，这种方法不但费时费力，而且不能精确地反映混合菌的组成和多样性，对于一些培养条件要求较苛刻或未被培养的细菌往往不能达到预期效果［１］。因此用传统培养方法所得出的调查结果不能准确反映微生物落的组成情况，建立和发展一种不依赖微生物培养的方法来进行微生物落结构研究是非常必要的。上世纪８０年代末至９０年代以来，分子生物学技术开始被广泛应用于微生物落结构分析，且发展迅速，研究的焦点集中在具有保守序列的１６ＳｒＲＮＡ上。研究方法包括分子杂交法、ＰＣＲ法、ＳＳＣＰ法、ＤＧＧＥ法、ＴＧＧＥ法、
ＲＦＬＰ法、ＥＲＩＣ－ＰＣＲ法和克隆基因文库分析法等，
具有很高的灵敏性，与传统的培养方法或其它不依赖培养技术的方法相比显示出明显的优越性，推动了微生物落结构研究的快速发展。但是，这些基于
ＰＣＲ的方法可能会在扩增反应中引入误差，降低所
得信息的精确度。荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）作为一种不依赖ＰＣＲ的分子分析技术是以上各种分子标记技术的有益补充，它结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性信息，可以在自然或人工的微生物环境中监测和鉴定不同的微生物个体，同时对微生物落进行评价。目前，ＦＩＳＨ技术广泛应用于微生物分子生态学和环境微生物物学中，已成为微生物落研究的重要技术手段，对环境中复杂的混合微生物落进行及时监控和准确鉴定也变得越来越重要，为污染治理和防治提供了新的思路和方法。
１荧光原位杂交技术的发展
１９６９年，Ｐａｒｄｕｅ等［２］和Ｊｏｈｎ［３］两个研究小组开发
了原位杂交技术，用放射性同位素标记的ＤＮＡ或２８ＳｒＲＮＡ与爪蟾卵细胞制备物进行杂交，进行显微
放射自显影检测。这一技术可以在保持细胞形态完整的条件下，检测出细胞核酸序列，自此，原位杂交技术在染体进化、肿瘤病人和白血病人的染体分析以及多种细胞遗传学研究方面得到应用。１９８８年，Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ等［４］首次将ＦＩＳＨ技术引入细菌学研究中，使用放射性标记ｒＲＮＡ寡核苷酸探针检测微生物。随着荧光标记的发展，非同位素染料逐渐代替
基金项目：国家高技术研究发展８６３计划专项资助（２００３ＡＡ６０１０２０）
净水技术
ＷＡＴＥＲＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ１６－－
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了放射性标记。１９８９年，Ｄｅｌｏｎｇ［５］首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。与放射性探针相比，荧光探针更安全，具有较好的分辨力，不需要额外的检测步骤。此外，可用不同激发和散射波长的荧光染料标记探针，在一步反应中同时检测几个靶序列。在短短的十几年中，由于ＦＩＳＨ技术的灵敏性和快捷性使其成为微生物系统发育学、微生物生态学、微生物诊断学和环境微生物学研究的有力工具。２荧光原位杂交技术的原理
荧光原位杂交是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶ＤＮＡ分子或ＲＮＡ分子杂交，通过
在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪（ＣｏｎｆｏｃａｌＬａｓｅｒＳｃａｎｎｉｎｇＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＣＬＳＭ）下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的ＤＮＡ区域或ＲＮＡ分子在染体或其它细胞器中的定位。
ＦＩＳＨ技术的目标分子通常是１６ＳｒＲＮＡ，因为它在微生物体内具有较高的拷贝数，分布广泛、功能稳定，而且在系统发育上具有适当的保守性。根据待测微生物体内１６ＳｒＲＮＡ中某段特异性序列，设计相应的寡核苷酸探针，就可实现对目标微生物的原位检测，而选取在分子遗传性质上保守性不同的特异序列，就可在不同水平（如属、种等）上进行检测。目前，公共和商业数据库中已发布的１６ＳｒＲＮＡ序列逐渐增多，因此，基于１６ＳｒＲＮＡ的ＦＩＳＨ技术的应用也越来越广泛，对环境样品中微生物的原位研究也越来越方便和准确。除１６ＳｒＲＮＡ外，还可以２３ＳｒＲＮＡ或ｍＲＮＡ等作为研究的目标分子。ＦＩＳＨ技术成功应用的关键在于设计和获得具有高灵敏性和专一性的寡核苷酸探针。
３荧光原位杂交技术的应用
ＦＩＳＨ技术已广泛地应用于微生物生态学和环境微生物学的研究中，其在环境微生物落研究中的应用主要表现在以下两个方面。
３．１环境样品微生物多样性的研究
研究不同的样品时发现显微镜下可见的微生物９９％以上通过常规方法不能被培养，由于培养条件与自然条件的差异，实际上培养所得到的只是自然环境中的少部分微生物，而且往往加入了浓度远高于自然状况的营养物质，其结果是在新的选择压力下落结构通常会发生变化，适应丰富营养条件的菌种成为优势种，取代了自然条件下的优势种。由于核酸序列可以提供遗传距离、分子杂交探针等信息，可进一步用于鉴定、监测自然生态系统中的微生物。基于核酸抽提和ＰＣＲ扩增等技术存在一定程度的偏差，而ＦＩＳＨ技术可以将整体微生物清晰地呈现出来而不需要额外的抽提和扩增等易引起偏差的步骤，精确性更好。所以，ＦＩＳＨ技术被广泛应用于环境微生物多样性的研究，ＳｉｍｏｎＮａｔｈａｌｉｅ等［６］在２００２年利用ＦＩＳＨ技术研究海水中细菌和有害藻类种之间的相互作用；ＡｒａｙａＲｕｂｅｎ等［７］在２００３年对溪流中和水中生物膜上的微生物落进行了ＦＩＳＨ研究。ＭｃｎａｍａｒａＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒＪ等利用ＦＩＳＨ技术对美国卡罗莱纳州南部溪流沉积物中可培养和不可培养的细菌落进行了分析［８］。
应用ＦＩＳＨ技术不仅能研究微生物落结构的特征，还可以跟踪微生物种的动态变化。ＬｉｕＪ等［９］２００２年利用ＦＩＳＨ技术监测了河流中微生物落的动态变化，并利用此技术得到了一些在人工条件下很难培养的菌种以及一些新的微生物信息。借助ＦＩＳＨ方法，我们不仅可以更准确地了解不同环境下微生物落中各种功能菌的组成比例，而且对不同功能菌的相互作用有了更直观的认识。研究表明，自然界中在空间上聚集在一起的不同微生物类大都在代谢上互惠互利［９］。
３．２污水处理中微生物多样性的研究
Ａｒｄｅｒｎ和Ｌｏｃｋｅｔｔ［１０］在１９１４年发明了活性污泥污水处理法，然而在废水处理过程中微生物生态学特性一直没有得到深入研究。而研究微生物个体、落多样性及其动态变化对提高处理系统的控制能力具有重要的意义。常规的方法是通过检测特异底物转化率来研究活性污泥中重要功能菌的活性，如耗氧速率、硝化、反硝化、磷吸收和释放、Ｆｅ３＋的还原等。ＦＩＳＨ技术能提供处理过程中微生物的数量、空间分布和原位生理学等信息。放射自显影和ＦＩＳＨ（ＭＡＲ－ＦＩＳＨ）结合被用于研究废水处理系统微生物活性、数目和对特异有机底物的消耗。１６ＳｒＲＮＡ为靶序列的ＦＩＳＨ检测技术被用于检测活性污泥及生物膜微生物落结构和数目及其空间分布，同时对特异菌进行空间定位和原位生理学的研究。３．２．１微生物落组成及空间分布的研究
ｒＲＮＡ测序和ＦＩＳＨ结合的落分析广泛用于监测生物反应器或废水处理设施中的微生物多样性。应用共聚焦激光扫描显微镜（ＣＬＳＭ）的ＦＩＳＨ技
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术可以对生物膜和活性污泥絮体的特异种进行空间分布研究。Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ等［１１］应用ＣＬＳＭ－ＦＩＳＨ研究了厌氧反应器的生物膜中的乙酸氧化细菌、脱硫微菌属、产甲烷细菌、硫酸盐还原细菌的分布。Ａｍａｎｎ［１２］等根据ＰＣＲ扩增的ｒＲＮＡ序列设计寡核苷酸探针，用ＦＩＳＨ技术诊断活性污泥中的微生物落结构。Ｓｃｈｒａｍｍ［１３］等在流化床硝化反应器和活性污泥系统中研究了亚硝酸细菌和氨氧化细菌的数量和空间分布。Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ等［１４］研究了ＵＡＳＢ反应器中高温和中温颗粒污泥的厌氧微生物落，揭示了微生物的多样性和空间分布，对其原位生理学和功能进行了探讨。ＬｅｅＴＪ等［１５］利用ＦＩＳＨ技术研究了活性污泥中聚磷酸盐积累型细菌（ＰＡＢｓ）和糖原积累型细菌（ＧＡＢｓ）的数量和空间分布。
３．２．２原位生理学和功能性研究
Ｎｉｅｌｓｅｎ等［１６］对工业废水处理厂活性污泥的细菌表面疏水性进行了原位检测，应用ＦＩＳＨ技术结合细胞表面微球体（ＭＡＣ）分析，研究了丝状细菌的胞外聚合物（ＥＰＳ）。Ｓｃｈｒａｍｍ等［１７］将ＦＩＳＨ和微传感器结合，同时分析微生物落结构和代谢活性，揭示了厌氧微生物在有氧环境中的缺氧微生态位。近年来，绿荧光蛋白（ＧＦＰ）分子被应用到微生物生态学的研究中，将不同的基因插入微生物的质粒或染体ＤＮＡ，表达的绿荧光蛋白分子能在单细胞水平可视化和监测启动子活性或基因中表达。Ｍｏｌｌｅｒ等［１８］研究了生物膜的微生物空间分布、启动子诱导及其表达的时序进程，同时对菌间的相互影响进行了分析。
３．２．３特殊菌种的研究
在污水处理过程中，硫酸盐还原菌与产甲烷细菌存在着生存竞争，因此，硫酸盐还原菌的研究受到了较多的关注。Ｓｃｈｒａｍｍ等人［１９］利用ＦＩＳＨ技术发现，即使在未检测到硫酸盐浓度降低的情况下，在污泥中也能检测到硫酸盐还原菌的存在；ＣｅｃｉｌｉａＭ等人［２０］利用ＡＲＣ９１５Ａ，ＳＲＢ３８５，ＤＳＶ６９８和ＤＳＳ６５８等探针发现，产甲烷菌主要分布在颗粒污泥的内部，而硫酸盐还原菌则分布在外层；Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ等人［２１］也得到类似结论；Ａｍａｎｎ等人［２２］的研究表明，形态差异明显的脱硫弧菌（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｖｕｌｇａｒｉｓ）和乙酸氧化脱硫单胞菌（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｓａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ）在荧光显微镜下可以分辩得很清楚。
４荧光原位杂交技术存在的缺陷４．１检测的假阳性结果
４．１．１自身荧光
ＦＩＳＨ技术的应用最显著的问题是微生物的自身荧光。许多霉菌和酵母菌如假单胞菌属、军团菌属、蓝细菌属和古细菌如产甲烷菌等一些细菌中存在这样的荧光特性。尽管自身的背景荧光有利于复染，但是降低了信噪比，同时掩盖了特异的荧光信号。在细胞遗传学和免疫学研究领域，进行数字图像处理时通过逐渐减少像数可以成功消除组织自身荧光。通过分析样品的自身背景荧光和避免其对Ｆ选金工艺
ＩＳＨ检测的影响是很困难的，应用传统的表面荧光显微镜则很难检测到信号，而应用共聚焦激光扫描显微镜则能获得较好的效果。微生物的培养基、固定方法和封闭剂对荧光的信号强度均有很大的影响。Ｓｏｒｅｎｓｅｎ等［２３］认为使用狭窄波段的滤镜和信号放大系统能降低自身背景荧光。Ｇｒａｆ等［２４］在研究白念珠菌（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）时发现不同的封固剂和激发波长在单一的菌株内对自身背景荧光强度也有影响。因此，在检测未知混合菌时要进行防止假阳性的发生。
４．１．２缺乏特异性
ＦＩＳＨ检测的精确性和可靠性主要依赖于寡核苷酸探针的特异性，因此探针的设计和评价十分重要。在每次ＦＩＳＨ检测中都设置阳性对照，同时把与靶序列相似具有几个错配碱基的探针作为阴性对照。阴性对照探针的错配碱基数量和位置十分重要，通常在１８个碱基的寡核苷酸探针中一个错配碱基是足够鉴别不同的微生物细胞。因此，即使未获得系统发育上十分接近的非靶细菌的ｒＲＮＡ序列，靶细菌也能够很快被检测到。对于一些未被培养的微生物，首先应该用杂交（如点杂交）分析探针的特异性，以确定探针设计的合理性，否则就要重新分离菌株，然后重新设计探针。另外，探针的特异性和灵敏性也取决于杂交条件，杂交和洗脱温度、变性剂的浓度等。
４．２检测的假阴性
４．２．１穿透力不足
细胞壁的结构影响探针的穿透力，可能导致杂交信号强度降低。革兰氏阴性菌通透性较好，即使是多聚核苷酸探针也能很好的穿透到细胞内。革兰氏阳性菌必须进行特殊的固定和前处理，以提高探针的渗透力。ＦＩＳＨ技术在革兰氏阳性球菌、棒状状杆
荧光原位杂交技术在微生物落结构研究中的应用１８
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菌属、放线菌属、芽胞杆菌属和李斯特杆菌属中得到了广泛的应用［２５］。
４．２．２更高的靶或探针序列结构
由于ｒＲＮＡ形成的三维结构，并不是所有的序列都能平等地接近探针。在ｒＲＮＡ中存在发夹、颈环结构和ＲＮＡ－蛋白质的复合体，导致寡核苷酸探针的差别感受性而无法接近靶序列，阻碍了杂交，这也就是在杂交中即使将ＲＮＡ或ＤＮＡ变性也不能获得理想结果的原因。探针设计不合理形成的自身退火或发夹结构也能导致杂交信号降低。采用ＰＮＡ探针可能解决上述问题，提高杂交效果，从而避免ＦＩＳＨ检测的假阴性。
４．２．３低ｒＲＮＡ含量和光褪
虽然细菌细胞中ｒＲＮＡ含量在正常情况下非常丰富，但其含量的高低对杂交也有较大的影响。不同种属ｒＲＮＡ含量变化较大，即使是同一菌株的不同生理状态其含量也不同，休眠的细胞或代谢不活跃的细胞可能导致信号强度降低或假阴性。此外，当细胞呈现不规则形状或形成链状和紧密的体时，微生物的定量可能会很困难。使用高亮度的荧光染料Ｃｙ３或Ｃｙ５和多重探针标记，以及应用信号放大系统或多聚核苷酸探针均可增强杂交信号。由于许多荧光染料在激发后很快就发生光熄灭，因此最好使用狭窄波段的滤镜核光稳定的荧光染料，防褪的封固剂也是十分重要的。
４．２．４细菌探针的使用
使用细菌探针是控制因方法学问题而导致假阴性结果的最好手段。如果在ＦＩＳＨ技术中用普通的探针杂交就能得到满意的结果，那么微生物固定方法、封闭剂、探针渗透力和细菌细胞ｒＲＮＡ含量将不是限制性因素。然而最近有研究表明，由于使用普通的探针而丢失了许多细菌。因此，分析复杂的微生物落时，使用一组细菌探针以得到更全面的观点是必要的。为了控制真细菌类探针与细菌１６ＳｒＲＮＡ或细胞成分而不是核酸的非特异性结合，可以使用补充探针如ＮＯＮ３３８，在ＦＩＳＨ中这种探针不会产生任何信号。
５荧光原位杂交技术的发展前景
荧光原位杂交是目前从细胞水平上分析微生物落结构的常用分子生态学方法，可用于确定细胞中特异性转录物定位及其表达的相对水平。与微生物的原位杂交和功能研究结合是ＦＩＳＨ技术进一步发展的方向，如进行复杂环境中原位基因表达和代谢水平的研究。另外，与生物传感器结合也将是ＦＩＳＨ技术在环境微生物落研究中的又一技术手段，如在线监测活性污泥絮体或生物膜中特异的化合物等。常规在线分析结合ＦＩＳＨ技术，能监测生物膜微生物落组成变化及微生物代谢活性，还能揭示影响因子与生物相动态变化的相互关系。结合基因分析的ＦＩＳＨ技术对于复杂微生物落的结构、功能分析也是十分有利的。最近开发的多彩ＦＩＳＨ（ＭｕｌｔｉｃｏｌｏｒＦＩＳＨ，ＭＦＩＳＨ）技术可以通过多种标记的探针和荧光染同时检测多个靶序列，对不同的种属进行鉴定。ＰＮＡ探针具有稳定、不易降解和较高的杂交亲和力等特性，检测细菌细胞的ｒＲＮＡ具有较高的灵敏性，即使是细菌死亡一段时间后也可能被检测到。由此可见，ＰＮＡ探针将会进一步推动ＦＩＳＨ技术在环境微生物学中的应用。
由于ＦＩＳＨ技术存在如样品自身产生荧光、探针特异性不足、低ｒＲＮＡ含量以及杂交后荧光标记见光褪等不足之处，并且只能用来检测事先估计到其存在、已知其目标基因序列并为之设计好引物的类。所以在进行微生物落研究时应结合传统的培养、镜检等方法及现代分子生物学的多种方法，可为环境微生物落研究提供更多的信息。Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ［２６］等利用共聚焦激光扫描显微镜与ＦＩＳＨ技术得到了不同菌种在颗粒污泥内部成层分布的高清晰照片。Ｏｒｐｈａｎ等［２
７］利用ＦＩＳＨ与次级离子质谱结合（ＳＩＭＳ）对厌氧条件下的甲烷氧化细菌进行了鉴定。因此，随着技术的不断进步，ＦＩＳＨ的准确性和灵敏度将进一步提高，必将在环境微生物落结构研究领域得到更加充分的应用，同时也会促进工程实践的快速发展，对我国高浓度有机工业废水的污染控制作出贡献。
参考文献
１ＷａｎｇｅｒＭ，ＡｍａｎｎＲ，ＬｅｍｍｅｒＨ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｂｉｎｇａｃｔｉｖａｔｅｄｓｌｕｄｇｅｗｉｔｈｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｉｎａｄｅｑｕａｃｙｏｆｃｕｌ－
ｔｕｒｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９３，５９：１５２０～１５２５
２ＰａｒｄｕｅＭＬ，ＧａｌｌＪＧ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｏｆｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅＤＮＡｔｏｔｈｅＤＮＡｏｆｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌｐｅｐａｒａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ
ＵＳＡ，１９６９，６４：６００～６０４
３ＪｏｈｎＨ，ＢｉｒｎｓｔｉｌｅｌＭ，ＪｏｎｅｓＫ．ＲＮＡ：ＤＮＡｈｙｂｒｉｄｓａｔｔｈｅｃｙｔｏｇｅ－ｎｅｔｉｃａｌｌｅｖｅｌ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９６９，２２３：５８２～５８７
１９
－－
Ｖｏｌ．２５Ｎｏ．１２００６
４
ＧｉｏｖａｎｎｏｎｉＳＪ，ＤｅＬｏｎｇＥＦ，ＯｌｓｅｎＧＪ，ｅｔａｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｇｒｏｕｐ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｏｂｅｓｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｉｎｇｌｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８８，１７０：７２０～７２６５
ＤｅＬｏｎｇＥＦ，ＷｉｃｋｈａｍＧＳ，ＰａｃｅＮＲ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓｔａｉｎｓ：
ｒｉ－ｂｏｓｏｍａｌＲＮＡｂａｓｅｄｐｒｏｂｅｓｆｏｒｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｉｎｇｌｅｍｉｃｒｏ－ｂｉａｌｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，６５：５５５４～５５６３６
ＳｉｍｏｎＮａｔｈａｌｉｅ，ＢｉｅｇａｌａＩｓａｂｅｌｌｅＣ，Ｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆａｔｔａｃｈｍｅｎｔｏｆｐｏ－ｔｅｎｔｉａｌｌｙｔｏｘｉｃｂａｃｔｅｒｉａｔｏＡｌｅｘａｎｄｒｉｕｍｔａｍａｒｅｎｓｅ［Ｊ］．ＡｑｕａｔｉｃＭｉ－ｃｒｏｂｉａｌＥｃｏｌｏｇｙ，２００２，２８：２４９～２５６７
ＡｒａｙａＲｕｂｅｎ，ＴａｎｉＫａｔｓｕｊｉ，ＴａｋａｇｉＴａｔｓｕｙａ，ＢａｃｔｅｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｃｏｍｍｕｎｉｔｙｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｓｔｒｅａｍｗａｔｅｒａｎｄｂｉｏｆｉｌｍｆｒｏｍａｎｕｒｂａｎｒｉｖｅｒｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄＤＧＧＥａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＥｃｏｌｏｇｙ，２００３，４３：１１１～１１９８
ＭｃＮａｍａｒａＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒＪ，ＬｅｍｋｅＭｉｃｈａｅｌＪ，ＬｅｆｆＬａｕｒａＧ．Ｃｕｌ－ｔｕｒａｂｌｅａｎｄｎｏｎ－ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅｆｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｉｎｓｅｄｉｍｅｎｔｓｏｆａＳｏｕｔｈＣａｒｏｌｉｎａ
ｓｔｒｅａｍ［Ｊ］．Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，２００２，４８２：１５１～１５９９ＬｉｕＪ，ＬｅｆｆＬＧ，ＴｅｍｐｏｒａｌｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅｂａｃｔｅｒｉｏｐｌａｎｋｔｏｎｏｆａＮｏｒｔｈｅａｓｔＯｈｉｏ（ＵＳＡ）Ｒｉｖｅｒ［Ｊ］．Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，２００２，４８９：１５１～１５９１０ＡｒｄｅｒｎＥ，ＬｏｃｋｅｔｔＷＴ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆｓｅｗａｇｅｗｉｔｈｏｕｔｔｈｅａｉｄｏｆｆｉｌｔｅｒｓ［Ｊ］．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ，１９１４，３３：５２３～５３９１１
ＤｏｍｉｎｇｕｅｓＭＲ，ＡｒａｕｊｏＪＣ，ＶａｒｅｓｃｈｅＭＢＡ，ｅｔａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃａｎａｅｒｏｂｉｃｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｎｓｏｒｔｉａｕｓｉｎｇｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）［Ｊ］．ＷａｔｅｒＳｃｉＴｅｃｈｎｏｌ，２００２，４５（１０）：２７３３１２
ＡｍａｎｎＲＩ，ＳｎａｉｄｒＪ，ＷａｇｎｅｒＭ，ｅｔａｌ．Ｉｎｓｉｔｕｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎａｎａｔｕｒａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９６，１７８：３４９６～３５００１３
ＳｃｈｒａｍｍＡ，ＤｅＢｅｅｒＤ，ＷａｇｎｅｒＭ，ｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｃ－ｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎｓｉｔｕｏｆＮｉｔｒｏｓｏｓｐｉｒａａｎｄＮｉｔｒｏｓｐｉｒａｓｐｐ．ａｓｄｏｍｉｎａｎｔ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｉｎａｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇｆｌｕｉｄｉｚｅｄｂｅｄｒｅａｃｔｏｒ［Ｊ］．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９８，６４：３４８０～３４８５１４
ＳｅｋｉｇｕｃｈｉＹ，ＫａｍａｇａｔａＹ，ＯｈａｓｈｉＡ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｃｏｎ－ｖｅｎｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｅｓｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃａｎｄｔｈｅｒ－ｍｏｐｈｉｌｉｃｕｐｆｌｏｗａｎａｅｒｏｂｉｃｓｌｕｄｇｅｂｌａｎｋｅｔｇｒａｎｕｌａｒｓｌｕｄｇｅｓ［Ｊ］．ＷａｔｅｒＳｃｉＴｅｃｈｎｏｌ，２００２，４５（１０）：１９～２５１５
ＬｅｅＴＪ，ＫａｗａｈａｒａｓａｋｉＭ，ＭａｔｓｕｍｕｒａＭ，ｅｔａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍ－ｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆａｃｔｉｖａｔｅｄｓｌｕｄｇｅｓｄｏｍｉｎａｔｅｄｗｉｔｈｐｏｌｙｐｈｏｓ－ｐｈａｔｅ－ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｇｌｙｃｏｇｅｎ－ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２，２３：７４７～７５５１６
ＮｉｅｌｓｅｎＪＬ，ＭｉｋｋｅｌｓｅｎＬＨ，ＮｉｅｌｓｅｎＰＨ．Ｉｎｓｉｔｕｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙｏｆｐｒｏｂｅｄｅｆｉｎｅｄ
ｂａｃｔｅｒｉａｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｓｌｕｄｇｅ［Ｊ］．ＷａｔｅｒＳｃｉＴｅｃｈｎｏｌ，２００１，４３（６）：９７～
１０３１７
ＳｃｈｒａｍｍＡ，ＳａｎｔｅｇｏｅｄｓＣＭ，ＮｉｅｌｓｅｎＨＫ，ｅｔａｌ．Ｏｎｔｈｅｏｃ－ｃｕｒｅｎｃｅｏｆａｎｏｘｉｃｍｉｃｒｏｎｉｃｈｅｓ，ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｕｌｆａｔｅｒｅｄｕｃ－ｔｉｏｎｉｎａｅｒａｔｅｄａｃｔｉｖａｔｅｄｓｌｕｄｇｅ［Ｊ］．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９９，６５：４１８９～
４１９６１８ＭｏｌｌｅｒＳ，ＳｔｅｒｎｂｅｒｇＣ，ＡｎｄｅｒｓｅｎＪＢ，ｅｔａｌ．Ｉｎｓｉｔｕｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓ－ｓｉｏｎｉｎｍｉｘｅｄ－ｃｕｌｔｕｒｅｂｉｏｆｉｌｍｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎｃｏｍｍｕｎｉｔｙｍｅｍｂｅｒｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９８，６４：７２１～
７３２１９ＳｃｈｒａｍｍＡ，ＳａｎｔｅｇｏｅｄｓＣＭ，ＮｉｅｌｓｅｎＨＫ，ｅｔａｌ．Ｏｎｔｈｅｏｃ－ｃｕｒｅｎｃｅｏｆａｎｏｘｉｃｍｉｃｒｏｎｉｃｈｅｓ，ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｕｌｆａｔｅｒｅｄｕｃ－ｔｉｏｎｉｎａｅｒａｔｅｄａｃｔｉｖａｔｅｄｓｌ
ｕｄｇｅ［Ｊ］．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９９，６５：４１８９～
vobu４１９６２０ＣｅｃｉｌｉｓＭ，ＳａｎｔｅｇｏｄｅｓＬａｒｓＲＤ，ＧｉｊｓＨ，ｅｔａｌ．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｓｕｌ－ｆａｔｅ－ｒｅｄｕｃｉｎｇａｎｄｍｅｇｈａｎｏｇｅｎｉｃｂａｃｔｅｒｉａｉｎａｎａｅｒｏｂｉｃａｇｇｒｅｇａｔｅｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｍｉｃｒｏｓｅｎｓｏｒａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎａｌｙｓｅｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ．Ｅｎ－ｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ，１９９９，６５：４６１８～
４６２９２１ＳｅｋｉｇｕｃｈｉＹＹ，ＫａｍａｇａｔａＫ，ａｋａｍｕｒａＡ，ｅｔａｌ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｕｓｉｎｇ１６ＳｒＲＮＡＴａｒｇｅｔｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｒｉｖｅａｌｓｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｓａｎｄｓｅｌｅｃｔｅｄｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｂａｃ－ｔｅｒｉａｉｎｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃａｎｄｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｓｌｕｄｇｅｇｒａｎｕｌｅｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ，１９９９，６５：１２８０～
１２８８２２ＡｍａｎｎＲＩ，ＬｕｄｗｉｇＷ，ＳｃｈｌｅｉｆｅｒＫＨ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｎｓｉｔｕｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｅｌｌｓｗｉｔｈｏｕｔｃｕｌｔｉｖａ－ｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ，１９９５，５９：１４３～212型参比电极
１６９２３ＳｏｒｅｎｓｅｎＡＨ，ＴｏｒｓｖｉｃＶＬ，ＴｏｒｓｖｉｃＴ，ｅｔａｌ．Ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌｈｙ－ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｏｆＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｃｅｌｌｓｗｉｔｈｔｗｏｎｅｗｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｏｂｅｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ－ｃｒｏｂｉｏｌ，１９９７，６３：３０４３～３０５０引道结构图
２４ＧｒａｆＢ，ＧｏｂｅｌＵＢ，ＡｄａｍＴ．Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｆｕｎｇｉ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｓｅｓ，１９９８，４１：３９～
４６２５
ＫｒｉｍｍｅｒＶ，ＭｅｒｋｅｒｔＨ，ｖｏｎＥｉｆｆＣ，ｅｔａｌ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳｔａｐｈｙｌｏ－ｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓａｎｄＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍ－ｐｌｅｓｂｙ１６ＳｒＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ－ｂｉｏｌ，１９９９，３７：２６６７～
２６７３２６
ＳｅｋｉｇｕｃｈｉＹＹ，ＫａｍａｇａｔａＫ，ａｋａｍｕｒａＡ，ｅｔａｌ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｕｓｉｎｇ１６ＳｒＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｒｅ－ｖｅａｌｓｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｓａｎｄｓｅｌｅｃｔｅｄｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｂａｃｔｅ－ｒｉａｎｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃａｎｄｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｓｌｕｄｇｅｇｒａｎｕｌｅｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉ－ｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ，１９９９，６５：１２８０～
１２８８２７ＯｒｐｈａｎＶＪ，ＨｏｕｓｅＣＨ，ＨｉｎｒｉｃｈｓＫＵ，ｅｔａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅａｒｃｈａｅａｌｇｒｏｕｐｓｍｅｄｉａｔｅｍｅｔｈａｎｅｏｘｉｄａｔｉｏｎｉｎａｎｏｘｉｃｃｏｌｄｓｅｅｐｓｅｄｉｍｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，９９（１１）：７６６３～
７６６８收稿日期：２００５－４－１
第一作者简介：李华芝（１９７９－），女，硕士研究生，主要从事环境微生物技术及其应用研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｕａｚｈｉｌｉ２００３＠１６３．ｃｏｍ
荧光原位杂交技术在微生物落结构研究中的应用
以水资源的可持续利用
支持经济社会的可持续发展
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透射电镜样品制备２０－－
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