TaqMan 探针法实时荧光定量PCR 的应用和研究进展 姜文灿，岳素文，江洪，王成彬
姜文灿，温州医科大学检验医学院、生命科学学院2014级硕士研究生。主要研究方向为分子生物学技术。
[摘要] TaqMan 探针法实时荧光定量PCR 因其重复性好、特异性强、线性范围宽等特点在各个领域有着
金属丝的杨氏模量
广泛的应用，内标系统的引入进一步提升了该方法的灵敏度，增加了其可靠性和实用性。然而，这一技术也因为假阴性和假阳性问题存在着改进的空间。本文从TaqMan 探针法的简介、研究进展以及应用前景展开综述。
[关键词] 实时荧光定量PCR ；TaqMan 探针；引物二聚体；内标系统 [中图分类号] R446.6-3 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 2095-2775（2015）01-0797-09 Application and research progress of TaqMan probe real time PCR
[Abstract] TaqMan real-time PCR has been widely used in various fields because of its good repeatability, strong specificity, wide linear range, etc. Import of the internal control (IC) system further improved the sensitivity of this method, consequently increased its reliability and practicability. However, there are still some improve rooms for this technique because of the false negative and false positive problem. Here we proceed a review for TaqMan real-time PCR cover its introduction, research progress and applicative prospect.
[Key words] Real-time fluorescent quantitative PCR; TaqMan; primer dimer; IC
[作者简介] 姜文灿，2014级硕士研究生。主要研究方向为分子生物学技术
[作者单位] 325000 浙江温州 温州医科大学检验医学院、生命科学学院（姜文灿，王成彬）；100085 北京 北京泰格瑞分子检验有限公司（岳素文，江洪）
[通讯作者] 王成彬，E-mail ：wangcb301@126
聚合酶链式反应 ( Polymerase Chain Reaction, PCR ) 是在体外模拟体内核酸复制从而获取大量目的基因拷贝的技术，最早由Mullis [1]发明。其几何级数的放大模式，相比于普通信号叠加的检测方法灵敏度提升了上百万倍，同时又因操作简便，成为核心技术之一。实时荧光定量 PCR 是在传统 PCR 基础上加入信号系统达到实时监测 PCR 扩增的目的，继承了传统 PCR 高灵敏度和操作简便的特点，同时实现了对样本的定量检测。根据信号基团的不同，实时荧光定量 PCR 可以分为染料法和探针法。非特异的染料法成本较低，但面临着类似于普通 PCR 非特异性扩增产物干扰的假阳性问题[2]。探针法中使用的探针多是 TaqMan 探针，与染料法相比，在一定程度上避免了假阳性问题的出现。现阶段， TaqMan 探针技术在医药卫生、农业科学、生物科学、政治法律等方面得到了广泛的应用[3-6]。 1 TaqMan 探针法简介
1.1 原理 TaqMan 探针的基本原理是利用扩增过程中Taq 酶的5’核酸外切酶活性切割与靶序列结合的寡核苷酸探针，该探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团并被磷酸化以防止探针在PCR 过程中延伸[7]，当引物延伸至寡核苷酸结合位置时，Taq 酶可以将其切割成小片段，使报告基团和淬
灭基团分开并发出荧光（图1），经过检测伴随扩增产物增加过程中荧光强度的增长对样本进行定量分析。现阶段使用的荧光报告基团有HEX 、FAM 、ROX 、JOE 、VIC 等[8]，荧光淬灭基团主要有TAMRA 、BHQ 等。研究发现，BHQ 本身具有非常低的荧光背景，实用性
高于TAMRA[9]。
图1TaqMan水解探针作用机理图
为了实现定量，我们往往以PCR反应的第3～15个循环的荧光值作为荧光本底信号，以3～15个循环的荧光值增加量标准偏差的l0倍为荧光阈值，根据信号达到该荧光阈值的循环次数（Ct值）和标准曲线判定结果。Ct值和荧光阈值一般要经过15次测试才能确定[10]，标准曲线要借助外标准品的检测完成，而外标准品制备的方法有直接化学合成、从标本获取和使用纯化病毒产物制备三种，其中实用性最高的为第三种[11]。Stone等[12]提出标准品要具有强稳定性的特点，DNA也要高度纯化并得到精确稀释。此外，在反应过程中，理论上每经过3.3个热循环靶模板总量增加一个数量级，故而标准曲线的斜率应在-3.3附近[13]。
1.2反应体系和使用仪器TaqMan探针法需要在传统PCR扩增体系中加入特异性TaqMan探针，同时选择性加入内标系统，总体积50μl、40μl、30μl、25μl、20μl均可见，一般进行40~45个循环。同普通PCR，TaqMan探针法中各成分含量的变化也会影响实验结果，而实验结果需要通过Ct值和荧光增值
（Rn）获取，所以在检测前一般遵循Ct值最小、Rn最大的原则对体系进行优化[14]。此外，加入ROX染料可以校正背景荧光[15]；对于引物的合理性，可以通过产物电泳和熔解曲线分析来确定[16]。反应体系中使用的是不同荧光素标记的探针，因此检测的完成要借助多通道PCR扩增仪，比如ABI 7500扩增仪、罗氏公司的Lightcycler扩增仪、Stratagene Mx3005扩增仪、达安公司DA7600扩增仪、Bio-Rad I cycler扩增仪以及Axygen公司的Mx300P扩增仪[17-22]。其中Roche公司的荧光定量系统采用的是毛细玻璃管形式，升降温速度相对于普通管更快，反应时间也更短[23]。在这种反应管中加入牛血清蛋白（BSA）能减少玻璃壁对核酸聚合酶的吸附，起到保护Taq DNA聚合酶的作用，从而提高体系的扩增效率[24]，但这一方法并不适用于普通反应管。
聚氨酯生产工艺在对样本进行检测时，并非模板浓度越高扩增效率越高，浓度太高的模板会干扰PCR反应，使扩增效率降低[25]。试验中，我们也可能遇到样本收集不全面的问题，对此，曹冬梅等[26]在使用TaqMan探针进行伤寒沙门氏菌检测时，采用了模拟样本的方式，即在无感染样本中加入不同浓度的细菌，得到多种模拟阳性样品进行检测；此外，他们还使用日本PPS公司的E7001核酸提取仪获得了更多更纯的模板。而胡骑等[27]在对口蹄疫病毒进行检测时，使用的是ABI公司的Magmax Express核酸自动提取系统，这一系统为车载便携式，30min可以同时完成24份样本的提取，为核酸的获取提供了一种新的方法。
1.3 TaqMan探针法的特点TaqMan探针法巧妙的结合了PCR对核酸的高效扩增、探针技术的高特异性
和光谱技术的高敏感性，克服了常规PCR只能实现定性检测的不足[28]。该技术实行完全闭管式操作，不仅避免了传统PCR开盖引起的产物污染问题，减少了假阳性现象的出现，还避免了对环境的污染[29]。由于其操作简便，判断结果直观明了，整个检测过程只需要2~3h[30]。相比于传统PCR电泳的方法，该技术的检测结果以更客观的数据形式呈现，可对样本进行阳性、阴性和可疑的判定，从而确保结果的准确性[31]。其特异性有引物和探针双重保证，
进一步增
加了结果的可信度[32]；探针的加入还降低了体系的检测下限，使其灵敏度比普通PCR高1~2个数量级[33]。此外，TaqMan探针法还具有自动化程度高、重复性好的特点[34]，特别适用于保存时间长而无法进行病毒分离的大批量样本检测[35]。敖金霞等[36]在实时荧光定量PCR技术用于转基因检测的综述中指出，该技术不仅可以实现对靶模板的定量，而且具有实时准确的特点。颜善活等[20]应用TaqMan探针法进行肺炎链球菌检测时，提出其具有敏感性高、特异性强、药物影响小、检测速度快、人力花
费少、经济实惠等优点，为肺炎链球菌感染的诊断提供了一种新方法。为了进一步提高反应的灵敏度，王琳[37]在PCR反应体系中加入了探针增强液，但并未对此作出具体分析。
TaqMan 探针法线性范围宽，陶志华等[38]使用 TaqMan 探针法对HBV DNA实现了定量并进行了线性分析，结果显示该方法在104~1011 copy/ml 范围Ct值有很好的线性。施开创、孙庆歌[39,40] 在使用TaqMan探针法进行基因检测时也验证了其线性范围宽的特点。
客流分析数据
sero-0151在这一反应体系中，加入的探针识别步骤保证了该方法的特异性，因此我们可以采用多重PCR技术在一个反应管内同时完成对多个靶模板的分析[41]。董瑞玲等[31]针对登革热病毒的不同基因序列分别设计了引物和探针，建立双重PCR 反应体系实现了病毒的基因分型。赵冉等[42]则分别以四种肠道致病菌的基因保守序列为靶标，通过引物和探针的设计同时对四种细菌进行检测，大大提升了检测效率。翁学军等[43]也利用多种TaqMan探针建立了多重PCR检测呼吸道病毒的模式，并指出反应中所用酶的价格比较贵，增加了检测的成本，但该方法操作简便，可同时完成多种病毒检测，更加符合临床需求。多重PCR 增加了反应的复杂程度，因此其设计要遵循一些原则：①检测的灵敏度应达到或者接近单重PCR 水平；②避免引物对间的相互干扰；③避免靶模板之间的非特异性扩增；④保证引物对退火温度相近从而使目的片段有相近的扩增效率；⑤不同荧光基团之间无相互干扰并借助多通道扩增仪完成检测[44]。
1.4探针发展TaqMan探针之后，陆续出现了其它水解型探针（TaqMan-MGB、TaqMan-分子信标）和杂交探针（分子信标、双杂交探针、双链探针）以及探针标记引物（LUX引物、茎环引物、蝎型引物等），进一步推动了实时荧光定量PCR技术的发展。
TaqMan-MGB探针是在TaqMan探针基础上发展起来的一种水解型探针，在探针的3’端添加了可与靶模板和探针形成的螺旋小沟结合的MGB分子，提升了探针的Tm值，从而缩短了探针的长度，解决了检测中探针设计的难题[45]。另外，在实时荧光定量PCR早期，不能将荧光信号和背景荧光分开，无法判断产物量的变化[46]。对此，MGB探针3’端使用的是非荧光淬灭基团，与荧光报告基团距离也更近，降低了非特异性荧光背景，提升了检测的灵敏度[47]。同样针对背景荧光问题，分子信标（Molecular Beacon，MB）的概念在1996年由Tyagi等[48]提出，它是一种有着茎环结构的探针，其环部与靶模板完全配对，颈部由互补的序列组成，与靶序列无关；茎干部与靶模板杂交后环状区-目标分子双链结构之间的热力学关系，使分子信标的杂交特异性明显高于常规的线性探针，对靶序列中单个碱基的变化均可检测，适用于SNP分析[49]。在分子信标的基础上，KUHN等[50]利用基于肽核酸的分子信标，使双链DNA在不变性的条件下也能与MB结合，克服了常规分子信标只能与单链靶模板结合发光的问题。
TaqMan-MB是在分子信标及TaqMan探针的基础上设计的一种新型均相荧光探针[51]，该探针保留了分子信标的茎环结构和TaqMan探针的5’端互补序列，使荧光信号有构象变化和探针水解两个来源，降
低荧光本底的同时增加了检测过程中信号的强度；此外，这一结构还可避免探针和引物之间的聚合，增加了检测的特异性。
双杂交探针由罗氏公司发明，要结合Roche 公司的Lightcycler扩增仪应用，适用于病原体和未知突变点的检测，可进行熔解曲线分析。蝎型探针是在分子信标基础上发展起来的探针，对等位基因检测特异性强，可实现多重分析[52]。Amplisenor是一种复合探针技术，采用的半套式PCR扩增技术提升了其灵敏度，但中间阶段半套式引物的加入环节增加了污染的可能性[41]。二聚体突变引物在引物的5’端标记荧光基团并使用3’端标记淬灭基团的带有一个突变位点的互补
寡核苷酸，提升了检测的灵敏度并降低了成本，但面临着引物二聚体产生假阳性的问题[53]。
其他探针如双链探针、茎环引物等[54]虽然检测的灵敏度相比于TaqMan探针有所提升，但复杂的设计流程和高昂的检测成本限制了其应用范围。双链探针和双杂交探针的发光机理与分子信标相似，在退火过程中与靶模板结合发出荧光；LUX引物、Sunrise引物等是在分子信标的基础上发展起来的探针[55]，在延伸过程中结合到双链内发出荧光[56]。故水解探针和探针标记引物信号的采集应在延伸阶段，而杂交探针信号的采集应在退火阶段。此外，Cycling探针、Simple 探针和神奇荧光探针也得到了一些应用[56-58]。
2研究进展
数控分度头PCR用于样本分析时由于其指数放大环节的存在可以实现分子水平的检测，所以又被称为分子诊断[59]，然而其最大的缺点也源于非特异性的指数放大。虽然传统检测方法的非特异性也存在于PCR系统，但与指数放大产生的非特异性相比可以忽略，所以引物二聚体(Primer Dimer, PD)才是这一问题产生的根本原因。PCR中一对过量引物通过3’端聚合、互为模板和引物延伸产生的引物二聚体，使体系中形成PD与靶模板共用一对引物的竞争性反应模式。一对3’末端存在2~3个互补碱基的引物，经过十几个热循环就会产生大量PD掩盖靶模板的扩增[60]，经引物设计原则或软件优选的3’端尽量无互补的引物对一般从30个循环开始出现PD扩增[45]，限定了检测的灵敏度。在PCR反应中，由于扩增效率的不同和指数放大效应的存在，同样量的初始模板扩增产物量千差万别，因此常规PCR只能结合凝胶电泳实现定性检测而不能进行准确定量[55]。电泳的后处理增加了交叉污染的可能性，加入的染剂溴化乙锭又有致癌性，致使该技术不宜用于高通量样本检测[61]。
Higuchi等[62]首先提出使用荧光染料动态监测PCR产物信号的方法，根据信号进入指数增长期的热循环数与初始靶分子量负对数之间的线性关系实现定量。但这些染料中，EB可以抑制PCR酶[63]，随后使用的染料SYBR Green Ⅰ、Super Green和Pico Green等[64-66]也都会结合引物二聚体造成假阳性。
TaqMan水解探针技术最早在1991年由Cetus公司的Holland等[67]使用，探针5’端标记32P和T4多核苷激酶，3’端设计为不能延伸。在此之后，Heid等[68]于1996年首先报道了TaqMan PCR的原理和方法，同年，ABI公司推出5’端标记荧光基团3’端标记淬灭剂只能结合靶模板的TaqMan探针。探针的加
入绕过了引物二聚体产生的假阳性问题，但其干扰作用仍然存在，浓度较引物二聚体（Ct30）低十倍即对应Ct值在33之后的靶分子会被抑制产生假阴性[69]。在扩增反应中，一般Ct30对应的靶模板量在103数量级[70,71]，Ct33对应的靶分子数在102数量级，依此类推，数个靶分子需要38以上的热循环数才能进入指数扩增期，因此定量检测一般要进行40~45个热循环[72]。类似于普通竞争性双重PCR，与引物二聚体浓度差在10倍之内的靶模板不会被抑制，所以TaqMan探针法检测灵敏度比普通PCR和染料法高一个数量级[33]。配合热启动策略可以进一步提升体系的灵敏度和特异性[45]，辅助UDG酶和矿物油密闭等措施[73,74]，TaqMan探针法实时荧光定量PCR技术已基本达到临床要求。
Aqula等[75]于1991年正式提出热启动概念，而经典热启动是在反应开始时升温的过程中加入Taq DNA酶（即人工热启动），可以将PD的出现推后1~2个热循环。现阶段该方法也得到了发展，我们可以通过引物的改进实现热启动，如使用发卡结构引物、双链引物和热活性引物；也可以通过对dNTP的修饰实现；还可以采用针对Taq DNA聚合酶的策略，如单克隆抗体结合、琼脂糖包埋和变异Taq DNA聚合酶；此外，蜡包镁离子也是热启动策略之一[76,77]。
隔音仓不同于普通PCR和染料法中引物二聚体造成的假阳性问题，探针法中PD的竞争性抑制作用可以引起浓度低1个数量级的靶分子出现假阴性。但文献报道的主要是由PCR抑制剂和提取方法不当造成的假阴性[78]，假阴性率在1.5%~4.9%[79,80]。针对这一问题，可采用加入内标系统的方式来解决[81]；而根据其来源和反应模式不同，内标系统又可以分为竞争性和非竞争性两种。
竞争性内标一般是由靶模板经突变克隆产生的外源模板，与靶模板共用一对引物，应用不
同荧光素标记的水解探针实现定量，在排除假阴性问题的同时还提供了另一种定量的方法[82]。但在这一反应体系中，当内标基因和靶模板浓度相差十倍以上时，会出现竞争性抑制现象，使检测的灵敏度下降[83]；另外，竞争性内标的制作较为复杂费时[84]。
非竞争性内标系统中，多以管家基因作为内标基因[85]，分别设计针对靶模板以及内标基因的探针和引物，使其形成非竞争性双重PCR反应体系。虽有文献报道GAPDH、β-actin 和18s rRNA并非是最稳定的管家基因[86]，现阶段最常使用的内标基因还是这几种。类似于普通双重PCR，内标基因和靶模板的浓度差在10倍之内无抑制作用，但由于二者竞争性消耗底物，浓度差超过2~3个数量级时也会产生影响[87]。因此，可以选择经过提取之后Ct值在26~27之间的管家基因作为内标基因[88]，从而对Ct值在20-33之间的靶模板发挥内参照作用。研究发现，TaqMan探针法的灵敏度比普通PCR高一个数量级[89,90]，而加入内标系统之后灵敏度比普通PCR 高两个数量级[39,91]。究其原因，主要是在PCR 反应体系中，PD和靶模板间存在共用一对引物的竞争关系，二者浓度相差10倍时PD会抑制靶模板的扩增，故而未加入内标系统时检测灵敏度仅提升一个数量级。引入这一系统后另外添加了一对引物，引物间发生两两聚合，分散了与靶模板共用一对引物的引物二聚体形成过程，推后其开始指数扩增的循环数；同时体系中PD种类会有所增加，但新增PD不存在与靶模板共用一对引物的竞争关系，浓度与靶模板相差2~3个数量级时才出现干扰作用。因此，非竞争性内标系统的加入从整体上推后了PD抑
制作用出现的循环数，使体系的灵敏度相比于普通PCR提升近2个数量级。但内标系统的加入，增加了反应的复杂程度，若新增PD出现的热循环数很靠前，会加重体系中竞争性抑制现象，所以解决假阴性问题的根本措施在于引物的优化。
TaqMan 探针法中加入的特异性探针，理论上不会和污染核酸结合产生假阳性，但在Ct值很靠后的反应中，这一问题也会出现[34]并且假阳性率在0.5%~4.4%[92,93]，这要归因于引物和探针之间的聚合延伸，探针和这种非特异性扩增产物杂交、水解而显。探针3’端的磷酸化使其出现指数扩增的循环数较引物有所推后，但并非所有的探针都实现了磷酸化。另外，内标系统的加入，增加了探针和引物之间的碰撞机率，也会加重二者聚合的程度。不同于染料法中的熔解曲线分析[94]，由于反应过程中探针已发生水解无法恢复，TaqMan探针法只能采用产物电泳观察非特异性条带的方式排除假阳性，这无疑增加了操作流程和污染机率，所以，解决假阳性问题的关键在于探针的设计。为此，TaqMan-MB[51]在探针3’末端靶序列之后添加7~8个与首端互补的人工碱基使其形成类似于分子信标的茎环状结构，降低荧光信号基线的同时，也避免了引物和探针聚合产生的假阳性问题。在此基础上，我们还可以根据实际情况对TaqMan-分子信标的结构进行调整，从而配合整个PCR系统的优化改善其可靠性。
3应用及前景
3.1医药卫生方面的应用TaqMan探针法在医学和分子生物学领域已经得到了广泛应用，李秉鸿等[48]十多年前对该技术进行综述时就指出它在病原检测、基因表达研究和等位基因鉴定中的重要性。TaqMan探针法用于乙肝病毒检测时，除了可以实现定量外，还可以对HBV进行基因分型和YMDD突变检测，其测定结果与直接测序法符合率较高，并且操作相对简单[95]。国内这一技术用于肝炎检测的专利主要是关于乙肝基因分型和YMDD突变检测联合基因定量，单一针对HBV DNA定量的专利较少[96,97]。目前细菌全身感染诊断的金标准是血培养，但培养结果受多种因素的影响并且无法检测死亡细菌对人体的危害，引起漏诊现象。为了避免这一问题，吴亦栋等[98]使用TaqMan探针建立了检测细菌16s rRNA诊断新生儿败血症的方法，结果显示该方法灵敏高、特异性强，可以为新生儿败血症提供早期诊断依据。李云玖等[45]则以大肠杆菌糖苷酶基因为靶标设计了引物和探针，对血液中的大肠杆菌进行检测，证明该方法阳性检出率与文献报道相符；此外，他指出TaqMan探针法也适用于胆汁和其他体液中大肠杆菌的检测。传统寄生虫检测的方法主要有形态学、化学检测等，这些方法耗时长且灵敏度低。王明旭等[99]在进行松材线虫检测时，根据其DNA保守序列设计了探针和
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