实验二十五 微量克氏（Kjeldahl）定氮法
成曦 031141006
一． vobu实验目的
1． 掌握克氏定氮法测定蛋白质含量的原理和方法。
2． 学会使用克氏定氮仪。
二． 实验原理
克氏定氮也称凯氏定氮。样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解氨（消化），氨又和硫酸作用，变成硫酸铵。然后景强碱碱化使硫酸铵分解放出氨，借蒸气将氨蒸至硫酸中，根据此酸被中和的程度，即可计算出样品的含氮量，若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH + H2SO4 →2 CO2 + 3 SO2 + 4 H2O + NH3
2 NH3 + H2服务器硬件检测SO4风门执行器 → (NH4)2SO4
(NH4)2SO4 +2 NaOH → 2 H2O + Na2SO4 + 2 NH3↑
bbi-142
反应（1）（2）在克氏烧瓶内完成，反应（3）在克氏蒸馏装置中进行（如图），其特点是将蒸气发生器、整流器及冷凝器三个部分融为一体。由于蒸汽发生器体积小，节省能源，本仪器使用方便，效果良好。为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，及硫酸钾以提高溶液之沸点，收集氨可用硼酸（加混合指示剂）溶液，氨与溶液中的氢离子结合生成铵离子，使溶液中的氢离子浓度降低，指示剂颜发生变化，然后用强酸滴定。 三． 实验器材
1． 未知牛血清蛋白
2． 克氏定氮仪。
3． 电炉
4． 消化架
5． 锥形瓶100ml（×3）
精准灌溉系统海棠6． 量筒100ml（×1）
7． 表面皿Ф5cm（×3）
8． 酸式滴定管25ml（×1）（侧管为2ml，可读至0.02ml）
9． 克氏烧瓶50ml（×3）
10． 小漏斗Ф4ml（×3）
11． 玻璃珠
四． 实验试剂
1． 未知牛血清蛋白1ml
2． 浓硫酸（A.R.）
3． 硫酸钾—硫酸铜混合液：硫酸铜3份与硫酸钾1份（质量比）混合磨成粉末
4． 50%氢氧化钠溶液:：50g氢氧化钠溶于蒸馏水，稀释至100ml
5． 2%硼酸溶液：2g硼酸溶于蒸馏水，稀释至100ml
6． 混合指示剂：0.1%甲基红乙醇溶液和0.1%甲烯蓝乙醇按体积比4:1混合
7． 0.01mol/L标准盐酸溶液：用恒沸盐酸准确稀释
五． 操作
1． 消化
将两个50ml克氏烧瓶编号，一只烧瓶内加1.0ml蒸馏水，为空白实验；另一烧瓶内加1.0ml样液（牛血清蛋白）。然后加硫酸钾—硫酸铜混合物约20mg及浓硫酸2ml。烧瓶口插一小漏斗（冷凝），将烧瓶置通风橱内的消化架或电炉上加热消化。开始时应控制火力，勿使瓶内液体冲至瓶颈，待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解释放出白烟后，适当加强火力，直至消化液透明，并呈淡绿为止，（约2—3小时）。冷却，准备蒸馏。
2，定氮仪的洗涤。
开启开关乙，使冷水流入蒸汽发生器D内球体2/3量后关闭开关乙。将煤气灯或酒精灯放到蒸汽发生器下面加热，此时开关甲和丙处于关闭状态。蒸汽发生器产生的蒸汽由小孔K经B管通入反应室C的液体中，将其中的氮带出，经E而进入冷凝管F，冷凝后从出口J进入吸收瓶中。自来水自L通入，经G管进入冷凝器，再通过H进入M。其后分为两路：当开关乙开启时可流入蒸汽发生器D，另一路通过I向外流出。操作时关闭开关丙，开启开关乙，使水进入D，当液面占据圆球约一半体积时，关闭开关乙。开关甲除在加消化液等液体时，应常关闭。蒸馏完毕，停止加热。开启开关乙，使水流入D，当液面距小孔K约3cm时，关闭开关乙。开启开关丙，D瓶内的水向外流出，C瓶内的废液也随之由小孔K流入D瓶。 用蒸汽洗涤反应室约10min后，移去锥形瓶，放上另一个盛硼酸-指示剂混合液的锥形瓶，将瓶倾斜，以保证冷凝管末端连接的小玻璃管完全浸于液体内。继续蒸馏1~2min。观察锥形瓶内溶液是否变，如不变，则反应室内部已干净。移动三角瓶使混合液离开管口约1cm，继续通气1min，最后用水冲洗管外口，移开煤气灯，准备蒸馏。
3，蒸馏。
开启开关丙，放掉蒸汽发生器中的热水，然后关闭开关丙，开启开关乙，使冷水流入蒸汽发生器D内球体2/3量后关闭开关乙。这一步操作对加样时避免样品经出样口K抽出反应室时很关键的。开启开关甲，将消化好的样品液自漏斗A加入反应室，通过B管加至C瓶底部，关闭开关甲。另取一只锥形瓶，加20ml硼酸溶液和2滴混合指示剂，将锥形瓶斜接于冷凝管下端。取50%氢氧化钠溶液10ml放入小漏斗中，微开开关甲，使氢氧化钠溶液慢慢流入反应室，当未完全流尽时，关闭开关甲，向小漏斗加入约3ml蒸馏水，再微开开关甲，使氢氧化钠全部流入反应室，关闭开关甲，剩余的蒸馏水留在小漏斗中作水封。将酒精灯移到蒸汽发生器下面加热，锥形瓶中溶液由葡萄紫变成鲜绿，自变起开始计时，蒸馏5min，然后移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，继续蒸馏1min。并用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外围，移去锥形瓶，用表面皿覆盖，准备滴定。
4，滴定。
用0.01mol/L HCL溶液滴定锥形瓶中的硼酸液至呈淡葡萄紫，记录所耗HCL溶液量。
5，计算：
式中 m：样品含氮的质量，即100ml样品中含氮量（mg）；
A：滴定样品消耗的HCL溶液体积（ml）；
B：滴定空白消耗的HCL溶液体积（ml）；
弹性夹头 V：相当于未稀释样品的体积（ml）；
c：盐酸物质的量浓度（mol/L）；
14.008：每摩尔氮原子质量（g/mol）；
100：100ml样品。
计算所得结果为样品总量，如欲求蛋白氮含量要减去非蛋白氮。要进一步求得样品中蛋白质的含量，用蛋白氮乘以6.25即得。
| HCL V1(ml) | HCL V2 (ml) | V2-V1 （ml） |
样品组（A） | 6.50 | 8.55 | 2.05 |
空白组（B） | -（未变为绿，没滴定） |
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注意事项
（1） 定氮仪的各连接处应使玻璃对玻璃外套橡皮管绝对不漏气。
（2） 所用橡皮管、塞须经处理。
（3） 蒸馏过程中切忌火力不稳，避免风吹，否则很容易就发生倒吸现象。使实验结果错误。
讨论：
1， 实验中克氏定氮仪的洗涤很重要，否则实验会有很大的偏差。
2， 蒸馏器的蒸汽是从自来水发生的，自来水中含有的氮也可能会影响测定。所以每次测定后都要充分洗涤，必要时可从M的上口加入硫酸少许，使水酸化。只有空白值低而稳定时，才能作样品蒸馏。
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