实验二总氮量的测定——凯氏定氮法
实验目的
学习凯氏定氮法的原理和操作技术
实验原理
常用凯氏定氮法测定天然有机物（如蛋白质、核酸及氨基酸等）的含氮量。
含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。甘氨酸的消化过程可表示如下： CH2NH2COOH+H2SO4 + 3H2SO4→2CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3
2NH3 + H2SO4→（NH4）2SO4
浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液 中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中的总氮量。
实验器材
1、50ml消化管或100ml凯氏烧瓶
2、凯氏定氮蒸馏装置或改进型凯氏定氮仪
人脸识别门3、50ml容量瓶
4、3ml微量滴定管
5、分析天平
6、烘箱
7、电炉8、1000ml蒸馏烧瓶
9、小玻璃珠10、远红外消煮炉
实验试剂
1、消化液（过氧化氢：浓硫酸：水=3：2：1）200ml
2、粉末硫酸钾—硫酸铜混合物16g
K2SO4与CuSO4.5H2O以3：1配比研磨混合。
3、30%氢氧化钠溶液1000ml
4、2%硼酸溶液500ml
5、标准盐酸溶液（约0.01mol/L）600ml
6、混合指示剂（田氏指示剂）50ml
由50ml 0.1%甲烯蓝乙醇溶液与200 ml0.1%甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕瓶中备用。这种指示剂酸性时为紫红，碱性时为绿。变范围很窄且灵敏。
7、市售标准面粉和富强粉各2g
操作方法
1、凯氏定氮仪的构造和安装
凯氏定氮仪由蒸汽发生器、反应管及冷凝器3部分组成。 图1.2.2 微量凯式蒸馏装置
1.热源
2. 烧瓶
3. 玻璃管
4. 橡皮管5．玻璃杯 6. 棒状玻塞 7. 反应室 8. 反应室外壳 9. 夹子 10. 反应室中插管 11. 冷凝管 12. 锥形瓶 13. 石棉网
蒸汽发生器包括电炉及一个1—2L（升）容积的烧瓶。蒸汽发生器借橡皮管与反应管相连，反应管上端有一个玻璃杯，样品和碱液可由此加入到反应室中，反应室中心有一长玻璃管，其上端通过反应室外层与蒸汽发生器相连，下端靠近反应室的底部。反应室外层下端有一开口，上有一皮管夹，由此可放出冷凝水及反应废液。反应产生的氨可通过反应室上端细管及冷凝器通到吸收瓶中，反应管及冷凝器之间借磨口连接起来，防止漏气。 安装仪器时，先将冷凝器垂直地固定在铁支台上，冷凝器下端不要距离实验台太近，以免放不下吸收瓶。然后将反应管通过磨口连接与冷凝器相连，根据仪器本身的角度将反应管固定在另一铁支台上。这一点务须注意，否则容易引起氨的散失及反应室上端弯管折断。然后将蒸汽发生器放在电炉上，并用橡皮管把蒸汽发生器与反应管连接起来。安装完毕后，不得轻易移动，以免仪器损坏。
2、样品处理
某一固体样品中的含氮量是用100g该物质（干重）中所含氮的克数来表示（%）。因此在定氮前，应先将固体样品中的水分除掉。一般样品烘干的温度都采用105℃，因为非游离的水都不能在100℃以下烘干。
在称量瓶中称入一定量磨细的样品，然后置于105℃的烘箱内干燥4小时。用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。
若样品为液体（如血清等），可取一定体积样品直接消化测定。
二波罗蜜精确称取0.1克左右的干燥面粉作为本实验的样品。
3、消化
取4个100 ml凯氏烧瓶或50 ml消化管并标号。各加1颗玻璃珠，在1及2号瓶中各加样品0.1克。催化剂（K2SO4—CuSO4.5H2O）200mg，消化液5ml。注意加样品时应直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。在3及4号瓶中各加0.1ml蒸馏水和与1及2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。每个瓶口放一漏斗，在通风橱内的电炉上消化②。
在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿为止③。消化完毕，等烧瓶中溶物冷却后，加蒸馏水10ml（注意慢加，随加随摇）。冷却后将瓶中溶物倾入50ml 的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并入量瓶。用水稀释到刻度，混匀备用④。4、蒸馏
卡门涡街效应
（1）蒸馏器的洗涤蒸汽发生器中盛有用几滴硫酸酸化的蒸馏水。关闭皮管夹，将蒸汽发生器中的水烧开，让蒸汽通过整个仪器。约15分钟后，在冷凝器下端放一个盛有5ml2%硼酸溶液和1—2滴指示剂混合液的锥形瓶。位置倾斜如图，冷凝器下端完全浸没在液体中，继续蒸汽洗涤1—2分钟，观察锥形瓶内的溶液是否变，如不变则证明蒸馏装置内部已洗涤干净。向下移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约1cm，继续通蒸汽1分钟。用水冲洗冷凝管口后用手捏紧橡皮管。此时由于反应室外层蒸汽冷缩，压力减低，反应室内凝结的水可自动吸出进入反应室外层。最后打开皮管夹，将废水排出。
（2）蒸馏取50ml锥形瓶数个，各加5ml硼酸和1—2滴指示剂，溶液呈紫，用表面皿覆盖备用。
用吸管取10ml消化液，细心地由蒸馏器小玻杯注入反应室，塞紧棒状玻塞。将一个含有硼酸和指示剂的锥形瓶放在冷凝器下，使冷凝器下端浸没在液体内。
用量筒取30%的氢氧化钠溶液10ml放入小玻璃杯，轻提棒状玻璃塞使之流入反应室（为了防止冷凝管倒吸，液体流入反应室必须缓慢）。尚未完全流入时，将玻璃塞盖紧，向玻璃杯中加入蒸馏水约5ml。再轻提玻璃塞，使一半蒸馏水慢慢流入反应室，一半留在玻璃杯中作水封。加热水蒸汽发生器，沸腾后夹紧皮管夹，开始蒸馏。此时锥形瓶中的酸溶液由紫变成绿。自变时起记时，蒸馏3—5分钟。移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管约1cm，并用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外面。继续蒸馏1分钟，移开锥形瓶，用表面皿覆盖锥形瓶。
蒸馏完毕后，须将反应室洗涤干净，在小玻璃杯倒入蒸馏水，待蒸汽很足、反应室外层温度很高时，一手轻提棒状玻璃塞使冷水流入反应室，同时立即用另一只手捏紧橡皮管，则反应室外层内蒸汽冷缩，可将反应室中残液自动吸出，再用蒸馏水自玻璃杯倒入反应室，重复上述操作。如此冲洗几次后，将皮管夹打开，将反应室外层中废液排出。再继续下一个蒸馏操作。
待样品和空白消化液均蒸馏完毕后，同时进行滴定。
（3）滴定全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫为滴定终点。
（4）计算
监控摄像机主板c为标准盐酸溶液摩尔浓度；
V1为滴定样品用去的盐酸溶液平均ml数；
V2为滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均ml数；
W为样品重量（g）。
14为氮的相对量子质量。
若测定的样品含氮量部分只是蛋白质，则，
directdraw样品中蛋白质含量（%）= 总氮量 × 6.25
若样品中除有蛋白质外，尚有其他含氮物质，则需向样品中加入三，然后测定未加三的样品及加入三后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而
计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。
蛋白氮=总氮—非蛋白氮
蛋白质含量（g%）= 蛋白氮×6.25
关闭起重装置思考题
1、何谓消化？如何判断消化终点？
2、在实验中加入粉末硫酸钾—硫酸铜混合物的作用是什么？
3、固体样品为什么要烘干？
4、蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中？
5、如何证明蒸馏器洗涤干净？
6、本实验应如何避免误差？
○1进行实验时可让部分同学用标准面粉，部分同学用富强粉进行测定。
○2也可在“远红外消煮炉”内进行消化。
○3并非所有样品消化液透明时消化液作用即已完成，另外消化液的颜亦常因样品成分的不同而异。因此，每测一新样品时，最好先实验一下需多少时间才能使样品中的有机氮全部变成无机氮全部变成无机氮。以后即以此时间为标准。本实验至消化液呈透明淡绿时即消化完全，约需2—3小时。
④本实验可分为两次完成，第一次进行消化，第二次进行蒸馏。
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