一、USP方法
5.2.12抗IIa活性（20.0~35.0IU/mg）
5.2.12.1仪器：紫外可见分光光度计、低温循环槽、电子天平
5.2.12.2试液：
醋酸溶液：取冰乙酸42ml于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。 pH7.4聚乙二醇6000缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷6.08g和氯化钠8.77g于1000ml容量瓶中，加水500ml溶解后，加聚乙二醇6000 1.0g，用盐酸调节pH至7.4，加水稀释至刻度。
pH7.4缓冲溶液：称取三羟甲基氨基甲烷6.08g和氯化钠8.77g于1000ml容量瓶中，加水500ml溶解后，用盐酸调节pH至7.4，加水稀释至刻度。
pH 8.4缓冲溶液：称取三羟甲基氨基甲烷3.03g、氯化钠5.12g和乙二胺四乙酸二钠1.40g于500ml容量瓶中，加水250ml溶解后，用盐酸调节pH至8.4，加水稀释至刻度。
抗凝血酶III溶液：取1支抗凝血酶III，加水溶解成5Units/ml。用pH7.4聚乙二醇6000缓冲液稀释成0.5Unit/ml。
人凝血酶溶液：用水将人凝血酶复溶，用pH7.4聚乙二醇6000缓冲液稀释成5Units/ml。
显底物：选择适合凝血酶的阿米酚试验的显底物，用水稀释成浓度约3mmol/L。临用前用pH 8.4缓冲溶液稀释至0.5 mmol/L。
标准溶液：用pH 7.4缓冲溶液将USP依诺肝素钠活性标准品稀释为浓度0.015~0.070USPIU/ml之间的四个浓度梯度。
样品溶液：用pH 7.4缓冲溶液将依诺肝素钠样品稀释为与标准溶液浓度一致的浓度梯度。 5.2.11.3检测过程：取18折叠篮支检测管，B1、B2为空白；T1、T2、T3、T4为样品溶液，各双份平行；S1、S2、S3、S4为标准溶液，各双份平行。按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B方波信号发生器2的顺序，每管中加入抗凝血酶III的体积为V（20~50μl），和同样体积的pH 7.4缓冲溶液（空白）、标准溶液或样品溶液；混合，但不要产生气泡。于37℃温浴1分钟。向每管中加入2V人凝血酶溶液（40~100μl），
温浴1分钟。再加入5V显底物（100~250μl），4分钟后加入5V的醋酸溶液（100~250μl）终止反应。以B1为空白，用紫外可见分光光度计在405nm处测量光吸收。空白B2的吸收值相比B1不得超过±0.05。
对每个浓度系列，将光吸收回归，与样品溶液和标准溶液的浓度对数值作线性分析。然后以量平行线分析统计方法计算每mL中依诺肝素钠抗IIa因子IU活性。4个浓度溶液的计算值组合计算得到最终的平均值，然后计算可信限度。抗IIa因子用IU/mg表示，按干品计。两人结果的相对平均偏差不得超过5.0%。
5.2.13抗Xa因子活性（90~125IU/mg）
5.2.13.1仪器：紫外可见分光光度计、低温循环槽、电子天平
5.2.13.2试液：
醋酸溶液、pH7.4聚乙二醇6000缓冲液、pH7.4缓冲溶液、pH 8.4缓冲溶液同抗IIa因子检测。
抗凝血酶III：取1支抗凝血酶III，加水溶解成5Units/ml。用pH7.4聚乙二醇6000缓冲液稀释成1.0Unit/ml。
Xa因子溶液：用pH7.4聚乙二醇6000缓冲液稀释，使之在下述检测中405nm处光吸收每分钟增加不超过0.20，但要用体积为V的 pH7.4的缓冲液代替依诺肝素钠溶液。
显底物：选择适合Xa因子的阿米酚试验的显底物，用水稀释成浓度约3mmol/L。临用前用pH 8.4缓冲溶液稀释至0.5 mmol/L。
标准溶液：用pH 7.4缓冲溶液将USP依诺肝素钠活性标准品稀释为浓度0.076~0.180 USP IU/ml炼焦配煤之间的四个浓度梯度。
样品溶液：用pH 7.4缓冲溶液将依诺肝素钠样品稀释为与标准溶液浓度一致的浓度梯度。
5.2.13.3检测过程：取18支检测管，B1、B2为空白；T1、T2、T3、T4为样品溶液，各双份平行；S1、S2、S3、S4为标准溶液，各双份平行。按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2的顺序，每管中加入抗凝血酶III的体积为V（20~50μl），和同样体积的pH 7.4缓冲溶液、标准溶液或样品溶液；混合，但不
要产生气泡。于37℃温浴1分钟。向每管中加入2VXa因子溶液（40~100μl海马ゆう），温浴1分钟。再加入5V显底物（100~250μl），4分钟后加入5V的醋酸溶液（100~250μl）终止反应。以B1为空白，用紫外可见分光光度计在405nm处测量光吸收。空白B2的吸收值相比B1不得超过±0.05。
5.2.13.4计算
对每个浓度系列，将光吸收的回归，与样品溶液和标准溶液的浓度对数值作线性分析。然后以量平行线分析统计方法计算每mL中依诺肝素钠抗Xa因子IU活性。4个浓度溶液的活性对数值组合计算得到最终的几何平均值，同时计算可信限度。抗Xa因子用IU/mg表示，按干品计。两人结果的相对平均偏差不得超过2.0%。电解水杯
二、EP方法
5.2.14 抗FXa因子和抗FⅡa因子活性检测：（2人检测）
5.2.14.1.溶液的配制
5.2.14.1.1缓冲液的制备
5.2.14.1.1.1三羟甲基氨基甲烷的氯化钠缓冲液(pH 7.4)：
溶解三羟甲基氨基甲烷6.08g和氯化钠8.77g于纯化水500ml中，加牛血清蛋白10g。用盐酸（取浓盐酸85 ml用蒸馏水稀释到1000 ml加密存储，以下所用盐酸无特殊要求外，指此浓度盐酸）调节pH至7.4，用纯化水稀释到1000 ml。
5.2.14.1.1.2 三羟甲基氨基甲烷-EDTA缓冲液(pH 8.4)：
溶解氯化钠5.12g和三羟甲基氨基甲烷3.03g和EDTA二钠1.4g于纯化水250ml中。用盐酸调节pH至8.4，用纯化水稀释到500 ml。
5.2.14.1.2显底物的制备：
5.2.14.1.2.1显底物R1(N-α-苄氧基羰基-D-精氨酰基-L-甘氨酰基-L-精氨酸-4-硝基苯胺的二氢氯化物)：
显底物S-2765：用水溶解显底物成3mmol/L的溶液。临用前用三羟甲基氨基甲烷-EDTA缓冲液(pH 8.4)稀释成0.5mmol/L的溶液。
5.2.14.1.2.2显底物R2(D-苯基丙氨酰基-pipecolyl-L-精氨酸-4-硝基苯胺的二氢氯化物水溶液)：
显底物S-2238：用水溶解显底物成3mmol/L的溶液。临用前用三羟甲基氨基甲烷-EDTA缓冲液(pH 8.4)稀释成0.5mmol/L的溶液。
5.2.14.1.3牛Xa因子参照液的制备：
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