T4 DNA Ligase
使 用 说 明 书
TaKaRa Code： D2011A
机器人定位技术包 装 ：
T4 DNA Ligase（350 U/μl） 25,000 Units
10×T4 DNA Ligase Buffer 1 ml
保 存 ： -20℃
●制品说明
本酶催化相邻DNA链的5’-P末端和3’-OH末端以磷酸二酯键结合的反应，需ATP作辅酶。本酶不仅可以催化粘性末端之间或平滑末端之间的DNA的连接，也可以催化DNA与RNA之间以及少数RNA之间的连接。 ●酶贮存溶液
Tris-HCl（pH 7.5） 10 mM
KCl 50 mM
DTT 1 mMMOSFET裸片
EDTA 0.1 mM
Glycerol 50 %
●起 源： Escherichia coli carrying the plasmid that enable highly expression of T4 DNA
Ligase gene。
●活性定义
在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hin d III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。
本酶的1 U相当于ATP-PPi交换反应中0.008 Weiss Unit。
●纯 度
1）2,000 U的本酶和1 μg的λ-Hin d III片段在37℃下反应16小时，DNA的电泳谱带不发生变化。 2）2,000 U的本酶和1 μg的Supercoiled pBR322 DNA在37℃下反应16小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
3）2,000 U的本酶和1 μg的16S，23S rRNA在37℃下反应16小时，RNA的电泳谱带不发生变化。
●用 途
安装网2）DNA片段和Linker或Adaptor DNA的连接。
声音定位系统
●使用注意
连接反应因末端碱基顺序的不同而反应速度各异，一般有下列倾向：
突出末端：Hin d III＞Pst I＞Eco R I＞Bam H I＞Sal I
平滑末端：Hae III＞Alu I＞Hin c II＞Sma I
Eco R V＞Sca I＞Pvu II＞Nru I
其中连接Hin d III末端的速度约为连接Sal I末端速度的10～40倍；
而连接Hae III末端的速度约为连接Sma I末端速度的5～10倍。
●添附Buffer组成（保存：-20℃）
10×T4 DNA Ligase Buffer去鱼鳞机
Tris-HCl（pH 7.6） 660 mM
MgCl266 mM
DTT 100 mM
ATP 1 mM
* Buffer在融解时，如果出现少量沉淀属正常现象，请于37℃ 保温溶解后使用。
● 使用例
a-ga
DNA片段和载体DNA的连接
1. 在微量离心管中制备下列连接反应液。
10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 μl
DNA片段* 约0.3 pmol
载体DNA** 约0.03 pmol
T4 DNA Ligase 1 μl
dH2O up to 25 μl
* DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3～10倍。
** 平滑末端的载体与DNA片段进行连接时，应首先将载体进行去
磷酸化处理，以防止其自身环化。
2. 16℃过夜反应。
3. 加入2.5 μl（1/10量）的3 M CH3COONa（pH5.2）。
4. 加入62.5 μl（2.5倍量）的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
5. 离心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
6. 25～50 μl TE溶解，10～20 μl转化至100 μl的感受态细胞中。
V2010.02
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