大肠杆菌基因组DNA
3-DNA连接酶（Ligase）DNA连接酶能利用ATP或NAD+提供的能量催化多段DNA片段的3’-OH和5’-P
基团之间形成3’，5’-磷酸二酯键，把两个DNA片段连接在一起。OHPOHPHOPHOPPPOHHO连
接酶3-（1）大肠杆菌连接酶1.两种DNA连接酶只能连接粘性末端。（2）T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端，还
能连接齐平末端。DNA连接酶的分类3-（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3’端有游离的-OH，
5’端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：NAD+2.连接条件3-
连接酶反应的最佳温度是37?C。3.连接反应的温度1.最佳温度但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。2.实用温度
所以一般采用4~16?C。3-（一）粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。3-（
2）DNA片断与载体的连接依靠粘性末端3-3-ligasenick3-3、定向克隆法定义：DNA用两种不同
的限制性内切酶消化时，产生带有非互补粘性末端的片段，此种片段只能以一个方向插入用相同的两种内切酶消化的载体中。（1）两个非互补
粘性末端的定向克隆（2）一个粘端一个平末端的定向克隆（3）部分粘端填补的定向克隆3-两个非互补粘性末端的定向克隆5
’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’EcoRIBamH
IAATTCGGCCTAG5’-G3’-CTTAAGATCC-3’
G-5’EcoRIBamHIAATTCGGCCTAG载体DNA
DNA片断DNA连接酶3-EcoRIEcoRIBamHIHindIII分别用各个内切酶切后电泳，记录片断
数目和大小。EcoRIBamHIHindIIIMarker3-EcoRIEcoRIBamHIHin
dIII分别用各个内切酶切后电泳，记录片断数目和大小。EcoRIBamHIHindIIIMarker3-3
-大肠杆菌基因组DNA3-质粒
tvc转换器li:asinglecirculardouble-strandedDNA,withthecontourlengt
habout850timeslongerthanthecell.GenomicDNA3-1.带电荷的分子 在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。2.电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成
正比。3.电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。电泳的基本原理DNA的凝胶电泳3-4.摩擦系数主要与分子的 大小、形状以及介质的粘度有关。如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）：分子在电场中迁移的速度主要取
决于分子本身的大小和形状。形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关:分子量越大，移动越慢。5.3-Relaxedsu
percoiledIncreasingdegreeofsupercoiling相同分子量的DNA:闭合环状卷曲超螺旋迁
移最快，线性分子次之，伸展开环状最慢。3-3-3-琼脂糖凝胶电泳1.琼脂糖2.琼脂糖凝胶琼脂糖在水里（ 或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。是一种线性多糖聚合物，从海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖的浓度决
定凝胶的空隙（密度）。浓度高空隙小3-琼脂糖的浓度（%）分离DNA的片断大小（bp）0.30.71.4
50000—100020000—10006000—300空隙小，分辨率高：小分子较易通过，而大分子难通过；空隙
大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通过。3.琼脂糖凝胶的分辨力空隙大小决定其分辨分子大小的能力。3-优点是
蜜饯LH比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。聚丙烯酰胺凝胶浓度（%）分离DNA片断大小（bp）4.010.020.01000—100
500—2550—1聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳：1000—50000bp聚丙烯酰胺凝胶电泳：1—1000bp3-
凝胶染1.染料溴化乙锭。Ethidiumbromide（EB）3-EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但
不与琼脂糖结合。EB在300nm紫外光照射下能发红荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。荧光强度与DNA含量及大小
成正比。2.原理3-3-3-一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。DNA分子量M
太阳能小屋arker有许多公司的商品，使用非常方便。如?DNA的HindⅢ酶切物等。DNA分子量的估计MarkerMarker3-
UVP全自动凝胶成像分析系统3-3-我们配置1%的agrose（1）称取0.5g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL
家用水果榨汁机TAE，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为0.5％琼脂糖凝胶液（浓度可根据DNA片段大小配置）；（2）将有机玻璃内
槽放置于一水平位置，并放好样品梳子；向冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液中加入1μlGel-view试剂，轻轻摇匀后缓缓倒入有机玻璃内
槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)；待胶凝固后，取出梳子，并放在电泳槽内，加人电泳缓冲液至电泳槽中；3-
基因工程的四大要素工具酶toolenzymes目的基因interestedgene载体
vector受体细胞receiptcells3-重组DNA技术中常用的工具酶工
织物整理剂
具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5′磷酸基
和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接；
②缺口平移制作高比活探针；③DNA序列分析；④填补3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的
5??3?聚合、3??5?外切活性，而无5??3?外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3?末端标记等反转录酶①合成
cDNA；②替代DNA聚合酶I进行填补，标记等多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3′羟
基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基TaqDNA聚合酶PCR合成DNA片段3-限制性内切酶细菌的限制
-修饰系统（R-M系统）GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAA
GMeMeRestrictionModificationREcoRIMEcoRI限制与修饰系统的生物学意义1
保护自身DNA不被降解；2破坏外源DNA，防止DNA的转化，保证物种的遗传稳定性。3-第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用
大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ属
系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种
酶限制内切酶的命名EcoRI：EscherichiacoliRIHindIII：Haemophilusinf
luensaedIIISacI：StreptomycesachromagenesI3-核酸限制性内切酶的
类型及主要特性特性I类内切酶II类内切酶III类内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双
功能酶内切酶的蛋白结构3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+
ATP、Mg2+和SAM寄主特异性位点识别序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTG立体声音
C回文序
列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG3-切割位点在距离识别位点至少1000bp处
随机切开一条单链。位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3‘端24—26bp处酶催转换不能能能DNA易位作用能
不能不能甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能能能序列特异的
切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用3-I型限制性内切核酸酶有其特定的DNA识别序列，但酶在DNA上的切割位
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