一种MMP酶响应型肿瘤靶向多肽载体及其应用

一种mmp酶响应型肿瘤靶向多肽载体及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及一种mmp响应型肿瘤靶向多肽纳米载体和其在抗肿瘤领域的应用。

背景技术：

2.肺癌是严重影响国民身体健康和生活质量的癌症之一，据报道，我国肺癌发病率位居男性癌症发病率的首位，在女性体中，肺癌发病率位居第二，仅次于乳腺癌。而肺癌的死亡率在男性和女性患者中均位居所有癌症死亡率之首，由此可见肺癌对人类健康的危害之大。约85％的肺癌为非小细胞肺癌(non
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small cell lung cancer,nsclc)，其中约60％为肺腺癌(lungadenocarcinoma,luad)。肺腺癌常见于非吸烟者及女性，由于早期无明显症状，肺腺癌确诊患者多为中晚期，又由于转移和恶化、缺乏有效的靶点和策略导致肺腺癌患者预后较差、死亡率较高。因此，迫切需要深入研究导致肺癌转移与恶化的分子机制，为肺癌的提供新靶点、新策略。
3.基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,mmp)，是一个大家族，包括mmp1、mmp2、mmp3、mmp7、mmp9等，目前人们对mmp2的研究比较深入， mmp酶能够降解细胞外基质中的特定蛋白成分,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，其在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视。研究表明，在恶性肿瘤中，mmp2酶高表达，而在正常组织中低表达，其能够特异性识别并催化裂解pro-leu-gly-leu-ala-gly(plglag)氨基酸序列，从而使含有plglag序列的蛋白质或肽链断裂，这使得使用含plglag氨基酸序列的多肽作为纳米载体能够在肿瘤组织中释放药物。
4.肿瘤的发生与发展与原癌基因和抑癌基因的突变和表达异常密切相关，通过核酸药物沉默致癌基因或激活抑癌基因从而发挥抗肿瘤作用被广泛研究。其中研究最多的是核酸药物如sirna和mirna。
5.microrna(mirna)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小rna，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个mirna可以有多个靶基因，而几个 mirna也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个mirna来调控多个基因的表达，也可以通过几个mirna的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，mirna调节着人类三分之一的基因。mirna在进化上高度保守。 mirna高度的保守性与其功能的重要性有着密切的关系。mirna作为药靶，或是模拟这一分子进行新药研发，给人类疾病的提供一种新的手段。
6.使用mirna用于癌症的方法包括两类：(1)若肿瘤中的特定mirna过表达，则采取mirna抑制疗法；(2)若肿瘤中mirna表达被抑制，则采取 mirna替代疗法。但如何实现mirna的高效递送是癌症基因必须解决的问题之一。由于将核酸药物递送至肿瘤部位是其发挥抗肿瘤作用的前提，但由于核酸药物分子量大，电负性强，难以有效递送至肿瘤部位，且在体内易被降解，从而导致作用大幅降低。因此，需要使用特定的载体以提高核酸药物的递送效率、延长其在体内的滞留时间，从而达到更好的疗效。目前，用于核酸递送的载体主要有脂质体、有机聚合物、无机纳米颗粒等，虽然这些核酸递送载体被广泛研究，
但其仍存在诸多缺点，例如脂质体合成过程复杂且造价昂贵，难以批量生产或应用，有机聚合物递送靶向性差，无机纳米颗粒的生物可降解性差，容易在体内蓄积导致生物毒性等。将核酸靶向递送至部位是提高效果并降低毒副作用的重要手段。
7.其中，多肽类药物载体是重要的药物载体之一。可以根据不同的需求设计具有相应作用的肽段，使其具备所需的功能。细胞膜具有较强的负电性，因此，细胞膜穿透肽(cell-penetrating peptides,cpps)需要富含带正电的碱性氨基酸如赖氨酸、精氨酸的短肽，在生理条件下，cpps带正电荷，能够与带负电的核酸药物通过静电相互作用自组装形成非共价结合的纳米粒。例如，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,mmps)通常在肿瘤细胞中高表达，其能够特异性裂解pro-leu-gly-leu-ala-gly(plglag)肽段。在多肽链中引入 plglag肽段可使其可具备mmp酶响应性。再如，在多肽链中引入具有靶向性的肽段，可促进其靶向特定的细胞或细胞器等。
8.理想的多肽类核酸递送载体应当具备靶向肽、细胞膜穿透肽以及酶响应性肽等，使其具备多种生物学功能，能够实现对药物的高效靶向递送至肿瘤部位，并在肿瘤部位崩解释放核酸，从而发挥抗肿瘤作用。
9.因此，本发明设计了生物相容性好、可降解、具有肿瘤靶向性递送核酸性能的多肽，用于递送mirna，肿瘤。

技术实现要素：

10.基于此，本发明的目的是提供一种核酸递送多肽载体，由其制备的核酸药物具有生物生物相容性好、可降解、具有肿瘤靶向性的优点。
11.为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现。
12.本发明的第一目的是提供一种递送核酸药物的多肽载体。
13.一种递送核酸药物的多肽载体，其氨基酸构成如seq id no.1所示。
14.一种送核酸药物的多肽载体，其氨基酸构成如seq id no.2所示。
15.一种送核酸药物的多肽载体，其氨基酸构成如seq id no.3所示。
16.在其中一些实施例中，所述核酸药物为microrna药物。
17.本发明的第二目的是提供上述多肽载体在递送microrna药物中的应用。
18.本发明的第三目的是提供由肿瘤的核酸药物。
19.一种肿瘤的核酸药物，其包括上述任一种多肽载体和靶向肿瘤的 microrna药物。
20.在其中一些实施例中，所述肿瘤是mmp酶响应型肿瘤。
21.在其中一些实施例中，所述肿瘤是肺癌。
22.在其中一些实施例中，所述microrna药物可以是针对mmp酶响应型肿瘤的任一microrna，在其中一个实施例中，优选为mir-148a-3p mimics。
23.在其中一些实施例中，所述多肽载体与所述靶向肿瘤的microrna药物的质量比比例为30-100：1，进一步地，优选为50-90：1，更优选为50-80： 1。
24.本发明的第四目的是提供上述肿瘤的核酸药物的制备方法。
25.上述肿瘤的核酸药物的制备方法，包括以下步骤：
26.(1)将所述多肽载体溶解于pbs，得到多肽载体溶液；
27.(2)将靶向肿瘤的microrna药物溶解于无核酶水，得到microrna药物溶液；
28.(3)按照多肽载体与所述靶向肿瘤的microrna药物的比例为30-100：1 的比例，将多肽载体溶液与核酸药物溶液混合均匀，室温静置10-20 min，静置过程中，多肽与核酸通过体外自组装初步形成纳米颗粒；
29.(4)将制得的纳米颗粒通过梯度挤压得到粒径均一的纳米粒，获得核酸药物。
30.在其中一些实施例中，所述步骤(4)包括：先将所得纳米颗粒使用挤膜器挤压通过孔径为1μm碳酸脂膜，来回挤压过膜二十次，再以相同方法依次挤压通过孔径分别为400nm、200nm、100nm的碳酸脂膜。
31.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
32.本发明构建了一种可实现mir-148a-3p mimics高效靶向递送的体系。本发明所设计的合适的核酸递送载体特别是seq id no.3可以提高药物递送到肿瘤部位的效率，能提高对肿瘤的靶向性，另外，当药物递送到肿瘤部位之后，能够高效释放，确保治其在肿瘤部位发挥作用，可以减少因靶向性不强而导致的药物对正常组织毒副作用。
附图说明
33.图1：实施例1中纳米粒4r/mir148a-3p、rr19/mir148a-3p和rd24/mir
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148a-3p的表征。
34.图2：实施例2中多肽载药的纳米药物对mmp2酶的响应性释放。
35.图3：实施例3中rt-qpcr法测定使用不同多肽载体及lipo3000转染mir
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148a-3p后nci-h299细胞中mir-148a-3p表达水平变化。
36.图4：实施例5中纳米药物的体内抑瘤效果。
37.图5：实施例5中肿瘤及主要器官切片的he染结果。
具体实施方式
38.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
39.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harborlaboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
40.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和 /或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
41.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
42.实施例1：鉴定纳米粒4r/mir148a-3p、rr19/mir148a-3p和rd24/mir-148a
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3p的表征
43.本发明中的microrna为mir-148a-3p mimics。其序列如下：
44.mir-148a-3p-f 5
’‑
ucagugcacuacagaacuuugu-3’,(seq id no.4)
45.mir-148a-3p-r 5
’‑
aaaguucuguagugcacugauu-3’(seq id no.5)
46.本发明根据mmp酶响应型，设计了多条多肽，最后经过筛选获得效果比较好的三条不同氨基酸序列的多肽，分别命名为4r、rr19和rd24，其共同的主体部分为rrrrplglagrrrr，其中多肽4r为肽链主体两端均未连接靶向肽rgd，即4r的氨基酸序列为rrrrplglagrrrr(seq id no.1)；多肽rr19为肽链主体一端连接肿瘤靶向肽rgd，其氨基酸序列为rgdgsrrrrplglagrrrr(seq idno.2)；多肽rd24肽链主体两端均连接rgd，其氨基酸序列为 rgdgsrrrrplglagrrrrgsrgd(seq id no.3)。
47.本实施例中，核酸药物的制备如下：
48.(1)将多肽4r、rr19和rd24分别溶解于pbs缓冲液(ph7.2-7.4)，制成1μg/μl的多肽溶液。将mir-148a-3p溶解于无核酶水(depc水)，制成1 μg/μl的核酸溶液。分别按照质量比为核酸:多肽＝1:1、1:5、1: 10、1:20、1:30、1:50、1:60、1:90、1:100的比例将核酸溶液加入多肽溶液中，充分吹打混匀，立刻进行涡旋震荡2min，使核酸分别与所述三种多肽充分混合均匀。室温静置15min，使核酸与多肽通过体外自组装的方式，分别形成4r/mir148a-3p、rr19/mir148a-3p和rd24/mir-148a-3p纳米粒(nps)。
49.pbs缓冲液成分表
[0050][0051]
(2)将步骤(1)中所得纳米颗粒通过挤膜器梯度挤压得到粒径均一的纳米粒，即先将步骤(1)所得纳米颗粒使用挤膜器挤压通过孔径为1μm碳酸脂膜，来回挤压过膜二十次，再以相同方法依次挤压通过孔径分别为400nm、 200nm、100nm的碳酸脂膜。
[0052]
(3)将制备的纳米药物进行稀释五倍之后，使用马尔文粒径仪测定各组纳米粒的粒径和多分散系数(polydispersity index,pdi)。
[0053]
(4)分别将10μl各组纳米粒样品滴加至电镜铜网，静置10min后，使用吸水纸沿铜网边缘吸除多余液体，将铜网置于室温过夜晾干。按照透射电镜操作规程拍摄各组样品的电镜照片，以获知各样品纳米粒形态特征及粒径大小。
[0054]
马尔为粒径仪测定结果显示：当rd24:mir-148a-3p为50:1时， rd24/mir-148a-3p纳米粒平均粒径约为160nm，粒径分布均一，pdi为0.141 (图1a)，透射电镜图显示rd24/mir-148a-3p纳米粒近似于球形，且大小均一，纳米粒大小与粒径仪测定结果一致(图1b)。通过制备不同质量比的纳米例，并采用琼脂糖凝胶电泳法测定不同质量比时rd24对mir-148a-3p的包封率，结果显示，当rd24:mir-148a-3p为50:1时，包封率达到88％且趋于饱和(图1c)，而4r:mir-148a-3p为50:1和rr19:mir-148a-3p为 50:1时，其包封率与rd24相当，但粒径均一性较rd24差，pdi系数较大 (图1)。说明rd24能够有效地包裹mir-148a-3p并形
成粒径均一的纳米粒，且性能较4r和rr19优越。
[0055]
以下实施例中所用的所述纳米粒(核酸药物)质量比均为多肽载体： mir-148a-3p＝50:1，例如，rd24/mir-148a-3p-cy3纳米粒中，为rd24: mir-148a-3p为50:1所制备得到。
[0056]
实施例2：多肽载药的纳米药物对mmp2酶的响应性释放
[0057]
将肺腺癌细胞nci-h1299与人支气管上皮细胞beas-2b分别接种于六孔板，待细胞生长至95-100％汇合度时，提取两种细胞的总蛋白，采用westernblot方法检测其mmp2酶的蛋白表达水平。使用image j软件对蛋白条带进行灰度值分析，以gapdh作为内参进行定量统计，以计算肺腺癌细胞和正常支气管上皮细胞中mmp2酶的表达水平。差异western blot结果表明，与人支气管上皮细胞beas-2b比，肺腺癌细胞nci-h1299中mmp2表达水平显著增高(图2 a)。
[0058]
(2)将含cy3荧光标记的mir-148a-3p(mir-148a-3p-cy3)用于测定多肽载药的纳米药物对mmp2酶的响应性释放。分别制备rd24/mir-148a-3p-cy3、 rr19/mir-148a-3p-cy3、4r/mir-148a-3p-cy3纳米药物，将每种纳米药物分别加入两个透析袋中，每个透析袋中含100μg mir-148a-3p-cy3的纳米药物，体积为1ml，透析袋中分别为含50ng/ml mmp2酶和不含mmp2酶的释放介质 (pbs)，透析袋外侧均为25ml pbs,将其置于37℃摇床避光振摇，转速240 rpm。
[0059]
(3)分别于1h、2h、4h、8h、10h、12h、16h、24h、36h、48 h、60h、72h、96h取透析袋外的释放液，1ml/次，每次取样后，补充加入1ml相应的释放介质。
[0060]
(4)用pbs配制系列浓度梯度的mir-148a-3p-cy3溶液，通过荧光酶标仪测定各浓度的荧光强度，绘制荧光强度-浓度标准曲线，根据标准曲线计算各实验组各个时间点的mir-148a-3p-cy3浓度，从而计算其累计释放量。结果表明，在含有50ng/ml mmp2酶的释放介质中，rd24/mir-148a-3p-cy3纳米药物崩解释放mir-148a-3p-cy3的效率显著高于不含mmp2酶的释放介质，在含 mmp2酶介质中，24h时，释放率约为50％，36h时，释放率约为80％，而此时在不含mmp2酶介质中释放率仅为50％左右(图2b)。rr19/mir-148a-3p-cy3、 4r/mir-148a-3p-cy3纳米粒的释放效率与rd24/mir-148a-3p-cy3纳米药物的释放效率一致(图2c、d),说明本发明所设计的多肽均能与mir-148a-3p自组装形成纳米粒后，并能够在mmp2酶的作用下崩解，有效释放mir-148a-3p。
[0061]
实施例3：多肽包裹后细胞中mir-148a-3p表达量的测定
[0062]
将nci-h1299细胞接种于六孔板，待细胞生长至60％汇合度时，按照前述方法制备不同多肽包裹mir-148a-3p mimics的纳米粒进行转染，mir-148a-3pmimics终浓度为50nm转染48h后采用rt-qpcr法测定mir-148a-3p表达水平。结果参见图3，rt-qpcr结果表明rd24包裹后mir-148a-3p表达水平显著高于4r包裹组和rr19包裹组，并且效果明显好于阳性对照组lipo3000(图 3)。
[0063]
rt-qpcr扩增体系如下：
[0064]
(1)去除gdna
[0065]
按如下配制去除gdna反应体系，
[0066]
组分名称体积(μl)gdna clean reagent25
×
gdna clean buffer4
total rna根据rna浓度计算(1000ng)depc水补足至20μl
[0067]
去除gdna反应程序：42℃15min，4℃保存
[0068]
(2)按下表配制反应体系，进行逆转录反应
[0069]
组分名称体积(μl)步骤(1)反应液20evo m-mlv rtase enzyme mix2oligo dt(18t)primer(50um)2random 6mers primer25
×
rtase reaction buffer mix 18depc水6
[0070]
逆转录反应程序：37℃15min，85℃5s，4℃保存
[0071]
pcr反应体系
[0072][0073]
上游引物(f)5
’‑
tgggtatttgtttttgttgattg-3’(seq id no.6)
[0074]
下游引物(r)5
’‑
actacacttaaaccccctctaacc-3’(seq id no.7)
[0075]
pcr反应程序
[0076][0077]
实施例4：多肽包裹后细胞中不同microrna表达量的测定
[0078]
将nci-h1299细胞接种于六孔板，待细胞生长至60％汇合度时，使用不同多肽包裹不同microrna转染nci-h1299细胞,microrna终浓度为50nm,转染 48h后，rt-qpcr结果表明rd24包裹后microrna表达水平显著高于阳性对照组lipo3000(表4.1)，说明rd24多肽载体对肿瘤细胞的核酸递送效率显著高于lipo3000。
[0079]
表4.1多肽包裹后细胞中不同类型microrna表达量的测定
[0080][0081]
所有组与阳性对照lipo3000进行统计学分析比较，*p《0.05,**p《 0.01,***p《0.001。
[0082]
实施例5：纳米药物的体内抑瘤效果
[0083]
(1)将nci-h1299细胞进行批量培养扩增。将生长状态良好的细胞用胰酶消化，离
心，再用pbs缓冲液将细胞重悬并进行计数，按细胞悬液:基质胶＝1:1的比例将细胞与基质胶混合均匀。用1ml注射器将细胞悬液注射进入裸鼠的右侧腋下的皮下，2
×
106细胞/只。
[0084]
(2)观察异植瘤生长情况并记录裸鼠体重，测量异植瘤尺寸，异植瘤体积＝l
×
w2/2，其中l为肿瘤长度，w为肿瘤宽度。
[0085]
(3)当肿瘤体积达到约为100mm3时，开始分组进行注射给药，即将nci-h1299荷瘤小鼠随机分为五组，每组5只，分别为：盐水组，即空白对照组，仅通过尾静脉注射生理盐水；游离mir-148a-3p组，即通过尾静脉注射游离mir-148a-3p进行，20μg/只/次；4r/mir-148a-3p组、rr19/mir
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148a-3p组和rd24/mir-148a-3p组，即通过尾静脉分别注射4r/mir-148a-3p、 rr19/mir-148a-3p和rd24/mir-148a-3p进行，按mir-148a-3p计，20μgmir-148a-3p/只/次。每三天注射给药一次，共进行七次注射，每次注射给药前先测量小鼠体重及肿瘤体积,以探究不同多肽包裹mir-148a-3p对小鼠异种移植瘤的作用。结束后，获取肿瘤并进行称重，获取小鼠心、肝、脾、肺、肾等主要器官，和肿瘤组织一并制作组织切片进行he染。从肿瘤图片可以看出，游离mir-148a-3p组肿瘤大小与空白对照组无明显差异，而使用多肽载体包裹mir-148a-3p进行后肿瘤的生长被明显抑制，其中 rr19/mir-148a-3p组和rd24/mir-148a-3p组肿瘤显著小于4r/mir-148a-3p组 (图4a-c)，说明rgd能够促进mir-148a-3p进入肿瘤，从而抑制肿瘤生长。肿瘤相对体积的统计结果表明rd24/mir-148a-3p组肿瘤体积比对照组小约十倍，rr19/mir-148a-3p组对照组小约六倍，4r/mir-148a-3p组对照组小约三倍(图4a-c)。在过程中，各组小鼠体重无明显变化(图4d)。he染结果表明，注射游离mir-148a-3p或多肽包裹mir-148a-3p的纳米粒对小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要器官无明显副作用(图5)，说明mir-148a-3p和多肽载体均具有良好的生物安全性，其中，rd24载体的各项性能最为优越，对将来的临床应用具有很大潜力。
[0086]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：

1.一种递送核酸药物的多肽载体，其特征在于，其氨基酸构成如seq id no.1所示；或其氨基酸构成如seq id no.2所示；或其氨基酸构成如seq id no.3所示。2.权利要求1所述的多肽载体在递送microrna药物中的应用。3.一种肿瘤的核酸药物，其特征在于，包括权利要求1所述的多肽载体和靶向肿瘤的microrna药物。4.根据权利要求3所述的核酸药物，其特征在于，所述肿瘤是mmp酶响应型肿瘤。5.根据权利要求4所述的核酸药物，其特征在于，所述肿瘤是肺癌。6.根据权利要求3所述的核酸药物，其特征在于，所述microrna药物为mir-148a-3p mimics。7.根据权利要求3所述的核酸药物，其特征在于，所述多肽载体与所述靶向肿瘤的microrna药物的质量用量比为30-100：1。8.根据权利要求7所述的核酸药物，其特征在于，所述多肽载体与所述靶向肿瘤的microrna药物的质量用量比为50-90：1。9.权利要求3-7任一项所述肿瘤的核酸药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将所述多肽载体溶解于pbs，得到多肽载体溶液；(2)将靶向肿瘤的microrna药物溶解于无核酶水，得到microrna药物溶液；(3)按照多肽载体与所述靶向肿瘤的microrna药物的质量比比例为30-100：1的比例，将多肽载体溶液与核酸药物溶液混合均匀，室温静置10-20min,静置过程中，多肽与核酸通过体外自组装初步形成纳米颗粒；(4)将制得的纳米颗粒通过梯度挤压得到粒径均一的纳米粒，获得核酸药物。10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征是，所述步骤(4)包括：先将所得纳米颗粒使用挤膜器挤压通过孔径为1μm碳酸脂膜，来回挤压过膜二十次，再以相同方法依次挤压通过孔径分别为400nm、200nm、100nm的碳酸脂膜。

技术总结

本发明提供一种递送核酸药物的多肽载体，其氨基酸构成如SEQ ID NO.1所示；或其氨基酸构成如SEQ ID NO.2所示；或其氨基酸构成如SEQ ID NO.3所示。本发明还提供了上述多肽载体的应用以及相应的肿瘤的核酸药物，以及其制备方法。本发明所设计的核酸递送载体可以提高药物递送到肿瘤部位的效率，提高对肿瘤的靶向性，另外，当药物递送到肿瘤部位之后，能够高效释放，确保治其在肿瘤部位发挥作用，可以减少因靶向性不强而导致的药物对正常组织毒副作用。用。