一种芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法

一种芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法。

背景技术：

2.目前，基因重组表达技术在当今的生物科学研究及产业化中有着越来越广泛的应用。目前，基因重组表达的宿主生物有很多种，比如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母和哺乳动物细胞等。很多情况下，在利用这些宿主生物表达目的基因时需要先在大肠杆菌中构建一个正确插入目的基因的环状质粒载体，将该载体提纯、线性化后再转化宿主生物，目的基因通过同源重组整合到宿主生物的基因组中，根据筛选基因可获得稳定表达的克隆子。比如常用毕式酵母(pichia pastoris)的ppic9k载体(invitrogen)和中国仓鼠卵巢细胞cho的poptivec tm-topo载体(invitrogen)等均属此类。
3.中国专利申请案(中国专利申请号02116936.5、02117763.5和02123460.4)报道了三种无需克隆的线性化载体构建方法并且注重参与连接反应的末端的产生。每个发明中分别给出一种末端产生的方法，分别是以非对称性切割的限制性内切酶酶切产生末端、dna和rna杂交体的rna突出末端作为末端、切口酶及核酸外切酶作用产生末端。带有相应末端的相当于载体的片段和目的基因由t4dna连接酶催化产生连接反应从而构建无需克隆。
4.但是，现有表达载体的构建方法对连接反应效率较低且极易产生错误连接，同时在实际应用中受到一定的限制，未能进一步得到推广应用。
5.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有表达载体的构建方法对连接反应效率较低且极易产生错误连接，在实际应用中受到限制而未能推广。

技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法。
7.本发明是这样实现的，一种aocyp90b27基因，所述aocyp90b27基因的核苷酸序列为seq id no：1，即loc109833124。
8.atgggaatggagcttctcttaggaatctctacgctaatcatagctctcatcatcttcctcggtttccgtagtaacgataaactcgacggcaaatccctcaagctccctcctggaaacctcggcggctggcctctcatcggggacacaatccccttcatgcagccacattcctcggcctctctcggcactttcatggaccaacacatcgccaagtatgggaggatatttaggatgaatttgttggggaggcctacgattgtgtcggcggacccggagtttaatcggttcatactgcagagcgaggggaggctgttcgagaacagttgcccgacgagcatcgccgagattatggggcggtggtcgatgctggcgctggccggtgacatacataaggaaatgaggtctattgccgtcaactttatgaacaatgtcaagctccggacttattttctgcctgatgtagatgctcaggctgttaagattcttgattcttggaaggataatactactttctccgcgatggaacaagggaagaagtttgcgtttaatttgatggtgaagcaactgatgagcatggatcctggaatgcctgagacggagcagttgaggagcgagtacgttttctttatgaaggggatggcttctattcctttgaatttgccatggacagccttca
gaagggccttgcagtcgagatccgcaatcctgaagattatgggacaaaagctagacgagagagtgcgaaaacttcaagagggagtccaaggactcgaagaagacgatctccttgcatcggtcgcaaagcacccacatctaacgagagatcagattcttgatttgatactgagcatgctcttcgctggtcacgagacctcatctgctgccatctcgttagctatttacttcctgcagtcctcgcccaaagtcctgcaacagttgcgagaagagcacactaagattgcgaatcagaagaaggaacgaggcgaaactggattgaattgggatgattacaagcaaatggagttcacccattgtgttattaatgaaactctaaggctgggaaacattgtgaagttcttgcacagaaaggcccttaaagatgtgcagttcaaaggatatgatattccatgtggttgggaagtagtgccaataatctctgcagcacatttggattcagcaatttacgatgacccacaaatttacaacccctggagatgggagacgatctttgcgacgatgacgaagaacagcaacgtaatgtcgttcagcgggggccctcggctttgcccgggagcagagctggcgaagctggagatggcggtgtttcttcaccatttggtgcagaggttcgagtgggagctggccgagcacgactatcctgtttccttccctttccttggattccccaagcaactccccatcaagattcgtgctcttaagtaa。
9.本发明的另一目的在于提供一种应用所述的aocyp90b27基因构建得到的芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体。
10.本发明的另一目的在于提供一种应用所述的芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体的芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法，所述芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法包括以下步骤：
11.步骤一，aocyp90b27基因的克隆：以多年生芦笋根部组织提取总rna，以芦笋cdna为模板进行cds扩增，测序，比对；
12.步骤二，aocyp90b27片段克隆：以送测序的pet-aocyp90b27 t载体为模板，用引物进行片段扩增，并将扩增产物进行胶回收；
13.步骤三，pcfp-aocyp90b27表达载体构建：对扩增片段和原始载体进行线性化，室温连接；将连接产物进行转化，培养，提取表达质粒；
14.步骤四，pcp-aocyp90b27-gpd terminator载体构建：利用模板进行扩增，线性化，连接转化，培养，提取最终的表达质粒。
15.进一步，所述步骤一中的rna的提取包括：
16.以多年生芦笋根部组织根据天根rna提取试剂盒说明书提取总rna，根据天根反转录试剂盒制备cdna于-20℃保存备用。
17.进一步，所述步骤一中的aocyp90b27基因的克隆包括：
18.以芦笋cdna为模板，根据aocyp90b27 cds设计特异性扩增引物aocyp90b27 f(5
’‑
atgggaatggagcttctctt-3’)和aocyp90b27 r(5
’‑
ttacttaagagcacgaatc-3’)进行cds扩增，扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃复性30s，72℃延伸1min30s，72℃终延伸10min。扩增产物进行胶回收，并连接到t载体进行测序后，将测序结果与原序列进行核苷酸序列比对。
19.进一步，所述步骤二中的aocyp90b27片段克隆包括：
20.以送测序的pet-aocyp90b27 t载体为模板，用引物pcfp-aocyp90b27ecori f(seq id no：2
[0021]5’‑
cctagcttcatcgatgaattcatgggaatggagctt-3’)和pcfp-aocyp90b27 xmai r(seq id no：3
[0022]5’‑
gatggcaagctgatccccgggttacttaagagcacgaat-3’)进行片段扩增,扩增条件
为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min35s，72℃终延伸10min，扩增产物进行胶回收。
[0023]
进一步，所述步骤三中的pcfp-aocyp90b27表达载体构建包括：
[0024]
将步骤二扩增的基因片段和脉孢菌异源表达原始载体pcfp myc his用ecori-hf和xmai进行线性化，酶切过的载体和片段进行胶回收，回收产物凝胶电泳检测浓度，根据t4 dna ligase的连接说明书加入线性化的载体和片段，室温过夜连接；将连接产物转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞，培养，挑取单克隆进行菌液pcr，阳性克隆加等体积的60％甘油，用液氮速冻保存于-80℃，并提取表达质粒pcfp-aocyp90b27。
[0025]
进一步，所述酶切时间为3h，所述培养条件为37℃培养16h。
[0026]
进一步，所述步骤四中的cp-aocyp90b27-gpd terminator载体构建包括：
[0027]
以脉孢菌87-3菌株的gdna为模板，用引物terminatorxmai f(seq id no：4
[0028]5’‑
gcggatcctaaatcggttgcgtaccc-3’)和terminatorxmai r(seq id no：5
[0029]5’‑
gcgaattctggaaattacggtca-3’)进行粗糙脉孢菌ncgpd-1terminator扩增，扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸35s，72℃终延伸10min。扩增产物进行胶回收；将表达载体pcfp-aocyp90b27用xmai进行线性化，凝胶电泳检测回收产物的浓度；seq id no：6
[0030]
ncgpd-1terminator与线性化的表达载体根据同源重组试剂盒的说明书连接，转化进入大肠杆菌感受态细胞dh5α，培养，挑取单克隆进行菌液pcr，阳性克隆加等体积的60％甘油，用液氮速冻保存于-80℃，并提取最终的表达质粒。
[0031]
进一步，所述连接条件为37℃连接30min，所述培养条件为37℃培养16h。
[0032]
ncgpd-1terminator sequence：seq id no：6的核苷酸序列为：
[0033]
atcggttgcgtacccgcacggttatgaagtaatggtcttttcctagatatgaagaaaaaaaaagggcaatgattccgtgggattgaactcgagcatgttggatctcgggcagtcctgcttaaagtaaaataatatccgaactcaaatagataccaagttcacttccagttctgttcctagttgcgcattgtgatacgagttgttttctgtctcaataatgctgtgtatggatggttatcattccagttgaccgcgacatggtgctacccgtgggcgtgtgacgggtacaggtcgcaactgagtgcctcgggcctcctgcgacggtttagcaccagtgaagtgctcgaaacattgaaacaaaagccagccttcggtgagggtaagtatcaacaccgtatggtgaaaagtagatcaatactttgctaaccagatgtctttcttgatgtgacctactacaccttcaattgattgaccaaactctagcttgaccgtaatttcca。
[0034]
结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
[0035]
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
[0036]
1.aocyp90b27基因扩增体系优化
[0037]
在以cdna为模板进行aocyp90b27基因全长扩增过程中，因为单链的cdna不稳定，在基因序列中富含gc含量的序列内易形成“茎-环”结构，因此在pcr扩增体系中加入了2％的dmso(二甲基亚砜)，以去除基因序列中的“茎-环”结构，提高基因的扩增效率。
[0038]
2.表达载体的优化
[0039]
在pcfp-myc-his原始载体中，在多克隆酶切位点下游没有用来进行转录终止的终
止子，我们从kegg上到了粗糙脉孢菌内源性终止子三磷酸甘油醛脱氢酶(ncgpd-1)的终止子，并用r软件调取了粗糙脉孢菌基因组中ncgpd-1终止密码子下游500奔跑的序列作为终止子序列，并pcfp-aocyp90b27表达载体中基因序列的下游插入了ncgpd-1terminator序列，以终止转录的进行。
[0040]
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
[0041]
合成生物学一直以来都是研究植物代谢途径及代谢途径基因功能的热门领域。通过rt-pcr技术及优化的pcr扩增条件，从芦笋的总cdna中克隆到了芦笋胆固醇c-22羟化酶基因aocyp90b27的转录本全长，之后通过同源重组的方式将基因克隆到了粗糙脉孢菌异源表达载体pcfp-myc-his载体的ecori和xmai中间，最后将粗糙脉孢菌ncgpd-1terminator序列通过同源重组的方式插入到aocyp90b27基因下游的xmai位点，以达到优化转录终止的目的。
[0042]
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
[0043]
(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：
[0044]
本发明技术方案转化后将提供一种高效的异源表达载体构建方法，极大提高载体构建及蛋白转化效率。
[0045]
(2)本发明的技术方案填补了国内业内技术空白：
[0046]
pcfp-myc-his原始载体上没有转录终止元件终止子，在表达载体上加入终止子能提高异源表达时蛋白的表达效率。
附图说明
[0047]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0048]
图1是本发明实施例提供的芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法流程图。
具体实施方式
[0049]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0050]
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
[0051]
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
[0052]
本发明实施例提供一种aocyp90b27基因，所述aocyp90b27基因的核苷酸序列为seq id no：1，即loc109833124。
[0053]
atgggaatggagcttctcttaggaatctctacgctaatcatagctctcatcatcttcctcggtttccg
tagtaacgataaactcgacggcaaatccctcaagctccctcctggaaacctcggcggctggcctctcatcggggacacaatccccttcatgcagccacattcctcggcctctctcggcactttcatggaccaacacatcgccaagtatgggaggatatttaggatgaatttgttggggaggcctacgattgtgtcggcggacccggagtttaatcggttcatactgcagagcgaggggaggctgttcgagaacagttgcccgacgagcatcgccgagattatggggcggtggtcgatgctggcgctggccggtgacatacataaggaaatgaggtctattgccgtcaactttatgaacaatgtcaagctccggacttattttctgcctgatgtagatgctcaggctgttaagattcttgattcttggaaggataatactactttctccgcgatggaacaagggaagaagtttgcgtttaatttgatggtgaagcaactgatgagcatggatcctggaatgcctgagacggagcagttgaggagcgagtacgttttctttatgaaggggatggcttctattcctttgaatttgccatggacagccttcagaagggccttgcagtcgagatccgcaatcctgaagattatgggacaaaagctagacgagagagtgcgaaaacttcaagagggagtccaaggactcgaagaagacgatctccttgcatcggtcgcaaagcacccacatctaacgagagatcagattcttgatttgatactgagcatgctcttcgctggtcacgagacctcatctgctgccatctcgttagctatttacttcctgcagtcctcgcccaaagtcctgcaacagttgcgagaagagcacactaagattgcgaatcagaagaaggaacgaggcgaaactggattgaattgggatgattacaagcaaatggagttcacccattgtgttattaatgaaactctaaggctgggaaacattgtgaagttcttgcacagaaaggcccttaaagatgtgcagttcaaaggatatgatattccatgtggttgggaagtagtgccaataatctctgcagcacatttggattcagcaatttacgatgacccacaaatttacaacccctggagatgggagacgatctttgcgacgatgacgaagaacagcaacgtaatgtcgttcagcgggggccctcggctttgcccgggagcagagctggcgaagctggagatggcggtgtttcttcaccatttggtgcagaggttcgagtgggagctggccgagcacgactatcctgtttccttccctttccttggattccccaagcaactccccatcaagattcgtgctcttaagtaa。
[0054]
实施例1
[0055]
如图1所示，本发明实施例提供的芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法包括以下步骤：
[0056]
s101，aocyp90b27基因的克隆：以多年生芦笋根部组织提取总rna，以芦笋cdna为模板进行cds扩增，测序，比对；
[0057]
s102，aocyp90b27片段克隆：以送测序的pet-aocyp90b27 t载体为模板，用引物进行片段扩增，并将扩增产物进行胶回收；
[0058]
s103，pcfp-aocyp90b27表达载体构建：对扩增片段和原始载体进行线性化，室温连接；将连接产物进行转化，培养，提取表达质粒；
[0059]
s104，pcp-aocyp90b27-gpd terminator载体构建：利用模板进行扩增，线性化，连接转化，培养，提取最终的表达质粒。
[0060]
实施例2
[0061]
根据实施例1提供的芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法，进一步地，本发明实施例芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建过程如下：
[0062]
1、aocyp90b27基因的克隆
[0063]
1.1rna的提取
[0064]
以多年生芦笋根部组织根据天根rna提取试剂盒说明书提取总rna，根据天根反转录试剂盒制备cdna于-20℃保存备用。
[0065]
1.2aocyp90b27基因的克隆
[0066]
以芦笋cdna为模板，根据aocyp90b27 cds设计特异性扩增引物aocyp90b27 f和
aocyp90b27 r进行cds扩增，扩增产物进行胶回收，并连接到t载体送北京擎科科技有限公司进行测序，测序结果与原序列进行核苷酸序列比对，序列比对结果显示克隆基因与原序列结果一致，没有发生snp突变。
[0067]
2、异源表达载体构建
[0068]
2.1aocyp90b27片段克隆
[0069]
以送测序的pet-aocyp90b27 t载体为模板，用引物pcfp-aocyp90b27ecori f和pcfp-aocyp90b27 xmai进行片段扩增，扩增产物进行胶回收。
[0070]
2.2pcfp-aocyp90b27表达载体构建
[0071]
将2.1扩增的基因片段和脉孢菌异源表达原始载体pcfp myc his用ecori-hf和xmai进行线性化，酶切时间为3h，酶切过的载体和片段进行胶回收，回收产物凝胶电泳检测浓度，根据t4 dnaligase的连接说明书加入线性化的载体和片段，室温过夜连接。将连接产物转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞，37℃培养16h，挑取单克隆进行菌液pcr，阳性克隆加等体积的60％甘油，用液氮速冻保存于-80℃，并提取表达质粒pcfp-aocyp90b27。
[0072]
2.3pcp-aocyp90b27-gpd terminator载体构建
[0073]
以脉孢菌87-3菌株的gdna为模板，用引物terminatorxmai f和terminator xmai r进行粗糙脉孢菌ncgpd-1terminator扩增，扩增产物进行胶回收。将表达载体pcfp-aocyp90b27用xmai进行线性化，凝胶电泳检测回收产物的浓度。ncgpd-1terminator与线性化的表达载体根据同源重组试剂盒的说明书37℃连接30min，转化进入大肠杆菌感受态细胞dh5α，37℃培养16h，挑取单克隆进行菌液pcr，阳性克隆加等体积的60％甘油，用液氮速冻保存于-80℃，并提取最终的表达质粒。
[0074]
实施例3
[0075]
根据实施例1提供的芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法，进一步地，所述步骤s101中aocyp90b27基因的克隆包括：
[0076]
以芦笋cdna为模板，根据aocyp90b27 cds设计特异性扩增引物aocyp90b27 f(seq id no：7
[0077]5’‑
atgggaatggagcttctctt-3’)和aocyp90b27 r(seq id no：8
[0078]5’‑
ttacttaagagcacgaatc-3’)进行cds扩增，扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃复性30s，72℃延伸1min30s，72℃终延伸10min。扩增产物进行胶回收，并连接到t载体进行测序后，将测序结果与原序列进行核苷酸序列比对。
[0079]
实施例4
[0080]
根据实施例1提供的芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法，进一步地，所述步骤s102中aocyp90b27片段克隆包括：
[0081]
以送测序的pet-aocyp90b27 t载体为模板，用引物pcfp-aocyp90b27ecori f(seq id no：2
[0082]5’‑
cctagcttcatcgatgaattcatgggaatggagctt-3’)和pcfp-aocyp90b27 xmai r(seq id no：3
[0083]5’‑
gatggcaagctgatccccgggttacttaagagcacgaat-3’)进行片段扩增,扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min35s，72℃终延伸10min，扩增产物进行胶回收。
[0084]
实施例5
[0085]
根据实施例1提供的芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法，进一步地，所述步骤s103中的pcfp-aocyp90b27表达载体构建包括：
[0086]
将步骤二扩增的基因片段和脉孢菌异源表达原始载体pcfp myc his用ecori-hf和xmai进行线性化，酶切过的载体和片段进行胶回收，回收产物凝胶电泳检测浓度，根据t4 dna ligase的连接说明书加入线性化的载体和片段，室温过夜连接；将连接产物转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞，培养，挑取单克隆进行菌液pcr，阳性克隆加等体积的60％甘油，用液氮速冻保存于-80℃，并提取表达质粒pcfp-aocyp90b27为seq id no：9；
[0087]
pcfp-aocyp90b27载体序列：
[0088]
gctcagcccacgttgccattcggcagacggagccgaatcgtgctgactgttttgaaaatttaccgccggatggtgccgtctcggaaggccagcctgaggcgatctgtgtctggcatgtcgccgacgcggttaaggtccgcttttctggggcgcaaccccaccagccgccaatgggaagggccggtgtggcttgggtgcgagtgcctggattgcggcggtggtctgatcaaatcgtcgaatgctcgctgcatatcggaccgaacgaggccgcttatctttccctacaacacttcatctcgaccgacgtcgaacaaccggagcccagcagcggatggccctgtgcaacgtcgtaatccatggtcccccactcctgtctatgatgcattgcccgcatgctctgacttcacaacctcgtaacagaatgttcacaccaccagccgaccgtggttgcgcttggtcctgatggccccctgtccaagcaactggcgaccgtctggccattgctcccaacgaacgacaccatgcagccatgcatcagcacaccttccttgtcccttggcccatggcgagacgcccggagcgtcttcggggacatgtcatcgcggagatggcctcaagccatcgatggcaatcctgtagcaggcaggccatcgggacaagctctctgagccaatcatcacatcaccgtggtcaacacaggacaataaaaggcttctcgcagcccgccgtcctcttgggtaccggacttctgcatggtcatgaaagtacagcttcgacactaccactactactaccacctccagtctttgacacttcttcaccaccagatctcacccgaggtaccaaaacaggatctgatatcatcgatttaaagcaatggagcaaaagctcatttctgaagaggacttgaatgaaatggagcaaaagctcatttctgaagaggacttgaatgaaatggagcaaaagctcatttctgaagaggacttgaatgaaatggagcaaaagctcatttctgaagaggacttgaatgaaatggagcaaaagctcatttctgaagaggacttgaatgaaatggagagcttgggcgacctcacacaccaccaccatcatcatggcgcgcctagcttcatcgatgaattcatgggaatggagcttctcttaggaatctctacgctaatcatagctctcatcatcttcctcggtttccgtagtaacgataaactcgacggcaaatccctcaagctccctcctggaaacctcggcggctggcctctcatcggggacacaatccccttcatgcagccacattcctcggcctctctcggcactttcatggaccaacacatcgccaagtatgggaggatatttaggatgaatttgttggggaggcctacgattgtgtcggcggacccggagtttaatcggttcatactgcagagcgaggggaggctgttcgagaacagttgcccgacgagcatcgccgagattatggggcggtggtcgatgctggcgctggccggtgacatacataaggaaatgaggtctattgccgtcaactttatgaacaatgtcaagctccggacttattttctgcctgatgtagatgctcaggctgttaagattcttgattcttggaaggataatactactttctccgcgatggaacaagggaagaagtttgcgtttaatttgatggtgaagcaactgatgagcatggaccctggaatgcctgagacggagcagttgaggagcgagtacgttttctttatgaaggggatggcttctattcctttgaatttgccatggacagccttcagaagggccttgcagtcgagatccgcaatcctgaagattatgggacaaaagctagacgagagagtgcgaaaacttcaagagggagtccaaggactcgaagaagacgatctccttgcatcggtcgcaaagcacccacatctaacgagagatcagattcttgatttgatactgagcatgctcttcgctggtcacgagacctcatctgctgccatctcgttagctatttacttcctgcagtcctcgcccaaagtcctgcaacagttgcgagaagagcacactaagattgcgaatcagaagaaggaacgaggcgaaactggattgaattgggatgattacaagcaaatggagttcacccattgtgttattaatgaaactctaaggctgggaaacattgtgaagttcttgcacagaaaggcccttaaagatgtgcagttcaaaggatatgatattccatgtggttgggaagtagtgc
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tgtattaattgtagccgcgttctaacgacaatatgtccatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcaggttaacctggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagaccggcagat
[0089]
所述酶切时间为3h，所述培养条件为37℃培养16h。
[0090]
实施例6
[0091]
根据实施例1提供的芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法，进一步地，所述步骤s104中的cp-aocyp90b27-gpd terminator载体构建包括：
[0092]
以脉孢菌87-3菌株的gdna为模板，用引物terminatorxmai f(seq id no：4
[0093]5’‑
gcggatcctaaatcggttgcgtaccc-3’)和terminatorxmai r(seq id no：5
[0094]5’‑
gcgaattctggaaattacggtca-3’)进行粗糙脉孢菌ncgpd-1terminator扩增，扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸35s，72℃终延伸10min。
扩增产物进行胶回收；将表达载体pcfp-aocyp90b27用xmai进行线性化，凝胶电泳检测回收产物的浓度；seq id no：6ncgpd-1terminator与线性化的表达载体根据同源重组试剂盒的说明书连接，转化进入大肠杆菌感受态细胞dh5α，培养，挑取单克隆进行菌液pcr，阳性克隆加等体积的60％甘油，用液氮速冻保存于-80℃，并提取最终的表达质粒。
[0095]
所述连接条件为37℃连接30min，所述培养条件为37℃培养16h。
[0096]
pcfp-aocyp90b27-gpdterminator载体序列：
[0097]
gctcagcccacgttgccattcggcagacggagccgaatcgtgctgactgttttgaaaatttaccgccggatggtgccgtctcggaaggccagcctgaggcgatctgtgtctggcatgtcgccgacgcggttaaggtccgcttttctggggcgcaaccccaccagccgccaatgggaagggccggtgtggcttgggtgcgagtgcctggattgcggcggtggtctgatcaaatcgtcgaatgctcgctgcatatcggaccgaacgaggccgcttatctttccctacaacacttcatctcgaccgacgtcgaacaaccggagcccagcagcggatggccctgtgcaacgtcgtaatccatggtcccccactcctgtctatgatgcattgcccgcatgctctgacttcacaacctcgtaacagaatgttcacaccaccagccgaccgtggttgcgcttggtcctgatggccccctgtccaagcaactggcgaccgtctggccattgctcccaacgaacgacaccatgcagccatgcatcagcacaccttccttgtcccttggcccatggcgagacgcccggagcgtcttcggggacatgtcatcgcggagatggcctcaagccatcgatggcaatcctgtagcaggcaggccatcgggacaagctctctgagccaatcatcacatcaccgtggtcaacacaggacaataaaaggcttctcgcagcccgccgtcctcttgggtaccggacttctgcatggtcatgaaagtacagcttcgacactaccactactactaccacctccagtctttgacacttcttcaccaccagatctcacccgaggtaccaaaacaggatctgatatcatcgatttaaagcaatggagcaaaagctcatttctgaagaggacttgaatgaaatggagcaaaagctcatttctgaagaggacttgaatgaaatggagcaaaagctcatttctgaagaggacttgaatgaaatggagcaaaagctcatttctgaagaggacttgaatgaaatggagcaaaagctcatttctgaagaggacttgaatgaaatggagagcttgggcgacctcacacaccaccaccatcatcatggcgcgcctagcttcatcgatgaattcatgggaatggagcttctcttaggaatctctacgctaatcatagctctcatcatcttcctcggtttccgtagtaacgataaactcgacggcaaatccctcaagctccctcctggaaacctcggcggctggcctctcatcggggacacaatccccttcatgcagccacattcctcggcctctctcggcactttcatggaccaacacatcgccaagtatgggaggatatttaggatgaatttgttggggaggcctacgattgtgtcggcggacccggagtttaatcggttcatactgcagagcgaggggaggctgttcgagaacagttgcccgacgagcatcgccgagattatggggcggtggtcgatgctggcgctggccggtgacatacataaggaaatgaggtctattgccgtcaactttatgaacaatgtcaagctccggacttattttctgcctgatgtagatgctcaggctgttaagattcttgattcttggaaggataatactactttctccgcgatggaacaagggaagaagtttgcgtttaatttgatggtgaagcaactgatgagcatggaccctggaatgcctgagacggagcagttgaggagcgagtacgttttctttatgaaggggatggcttctattcctttgaatttgccatggacagccttcagaagggccttgcagtcgagatccgcaatcctgaagattatgggacaaaagctagacgagagagtgcgaaaacttcaagagggagtccaaggactcgaagaagacgatctccttgcatcggtcgcaaagcacccacatctaacgagagatcagattcttgatttgatactgagcatgctcttcgctggtcacgagacctcatctgctgccatctcgttagctatttacttcctgcagtcctcgcccaaagtcctgcaacagttgcgagaagagcacactaagattgcgaatcagaagaaggaacgaggcgaaactggattgaattgggatgattacaagcaaatggagttcacccattgtgttattaatgaaactctaaggctgggaaacattgtgaagttcttgcacagaaaggcccttaaagatgtgcagttcaaaggatatgatattccatgtggttgggaagtagtgccaataatctctgcagcacatttggattcagcaatttacgatgacccacaaatttacaacccctggagatgggagacgatctttgcgacgatgacgaagaacagcaacgtaatgtcgttcagcgggggccctcggctttgccccggagcagagctggcgaagctggagatggcggtgtttcttcaccatttggtgcagaggttcgagtgggagctggccgagcacgactatc
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[0098]
ncgpd-1terminator sequence：seq id no：6的核苷酸序列为：
[0099]
atcggttgcgtacccgcacggttatgaagtaatggtcttttcctagatatgaagaaaaaaaaagggcaatgattccgtgggattgaactcgagcatgttggatctcgggcagtcctgcttaaagtaaaataatatccgaactcaaatagataccaagttcacttccagttctgttcctagttgcgcattgtgatacgagttgttttctgtctcaataatgctgtgtatggatggttatcattccagttgaccgcgacatggtgctacccgtgggcgtgtgacgggtacaggtcgca
actgagtgcctcgggcctcctgcgacggtttagcaccagtgaagtgctcgaaacattgaaacaaaagccagccttcggtgagggtaagtatcaacaccgtatggtgaaaagtagatcaatactttgctaaccagatgtctttcttgatgtgacctactacaccttcaattgattgaccaaactctagcttgaccgtaatttcca。
[0100]
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
[0101]
粗糙脉孢菌因为生长周期较短，遗传造作技术较简易，一直被用于合成生物学中作为宿主材料，并且粗糙脉孢菌作为真菌，在代谢途径上与高等植物甾体皂苷代谢途径有部分重叠，易于被修饰基因型进行芦笋异源基因的表达及基因功能的验证。
[0102]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种aocyp90b27基因，其特征在于，所述aocyp90b27基因的核苷酸序列为seq id no：1。2.一种应用如权利要求1所述的aocyp90b27基因构建得到的芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体。3.一种应用如权利要求2所述的芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体的芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法，其特征在于，所述芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法包括以下步骤：步骤一，aocyp90b27基因的克隆：以多年生芦笋根部组织提取总rna，以芦笋cdna为模板进行cds扩增，测序，比对；步骤二，aocyp90b27片段克隆：以送测序的pet-aocyp90b27t载体为模板，用引物进行片段扩增，并将扩增产物进行胶回收；步骤三，pcfp-aocyp90b27表达载体构建：对扩增片段和原始载体进行线性化，室温连接；将连接产物进行转化，培养，提取表达质粒；步骤四，pcp-aocyp90b27-gpdterminator载体构建：利用模板进行扩增，线性化，连接转化，培养，提取最终的表达质粒。4.如权利要求3所述的芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法，其特征在于，所述步骤一中的rna的提取包括：以多年生芦笋根部组织根据天根rna提取试剂盒说明书提取总rna，根据天根反转录试剂盒制备cdna于-20℃保存备用。5.如权利要求3所述的芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法，其特征在于，所述步骤一中的aocyp90b27基因的克隆包括：以芦笋cdna为模板，根据aocyp90b27 cds设计特异性扩增引物aocyp90b27 f和aocyp90b27 r进行cds扩增，扩增产物进行胶回收，并连接到t载体进行测序后，将测序结果与原序列进行核苷酸序列比对。6.如权利要求3所述的芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法，其特征在于，所述步骤二中的aocyp90b27片段克隆包括：以送测序的pet-aocyp90b27 t载体为模板，用引物pcfp-aocyp90b27 ecori f和pcfp-aocyp90b27 xmai进行片段扩增，扩增产物进行胶回收。7.如权利要求3所述的芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法，其特征在于，所述步骤三中的pcfp-aocyp90b27表达载体构建包括：将步骤二扩增的基因片段和脉孢菌异源表达原始载体pcfp myc his用ecori-hf和xmai进行线性化，酶切过的载体和片段进行胶回收，回收产物凝胶电泳检测浓度，根据t4 dnaligase的连接说明书加入线性化的载体和片段，室温过夜连接；将连接产物转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞，培养，挑取单克隆进行菌液pcr，阳性克隆加等体积的60％甘油，用液氮速冻保存于-80℃，并提取表达质粒pcfp-aocyp90b27。8.如权利要求7所述的芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法，其特征在于，所述酶切时间为3h，所述培养条件为37℃培养16h。9.如权利要求3所述的芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法，其特征在于，所述步骤四中的cp-aocyp90b27-gpd terminator载体构建包括：
以脉孢菌87-3菌株的gdna为模板，用引物terminator xmai f和terminator xmai r进行粗糙脉孢菌ncgpd-1 terminator扩增，扩增产物进行胶回收；将表达载体pcfp-aocyp90b27用xmai进行线性化，凝胶电泳检测回收产物的浓度；ncgpd-1 terminator与线性化的表达载体根据同源重组试剂盒的说明书连接，转化进入大肠杆菌感受态细胞dh5α，培养，挑取单克隆进行菌液pcr，阳性克隆加等体积的60％甘油，用液氮速冻保存于-80℃，并提取最终的表达质粒。10.如权利要求9所述的芦笋胆固醇c-22羟化酶异源表达载体构建方法，其特征在于，所述连接条件为37℃连接30min，所述培养条件为37℃培养16h。

技术总结

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种芦笋胆固醇C-22羟化酶异源表达载体构建方法，所述AoCYP90B27基因的核苷酸序列为SEQIDNO：1；所述异源表达载体构建方法包括：以多年生芦笋根部组织提取总RNA，以芦笋cDNA为模板进行CDS扩增，测序，比对；以送测序的PET-AoCYP90B27T载体为模板，用引物进行片段扩增，并将扩增产物进行胶回收；对扩增片段和原始载体进行线性化，室温连接；将连接产物进行转化，培养，提取表达质粒Pcfp-AoCYP90B27；利用模板进行扩增，线性化，连接转化，培养，提取最终的表达质粒Pcp-AoCYP90B27-gpdterminator。gpdterminator。gpdterminator。