抗G蛋白α抗体的制作方法

抗g蛋白
α
抗体
技术领域
1.本发明涉及能够与g蛋白α结合的新的抗体或抗体片段。

背景技术：

2.g蛋白偶联受体(rcpg或英语为gpcr)是哺乳动物和整个动物界中的一个膜受体家族。g蛋白是由rcpg活化的异源三聚体蛋白(3个亚基：α、β和γ)。通过rcpg，g蛋白具有从细胞外部到细胞内部的信号转导作用(即，细胞对外部刺激作出反应)。通常描述的作用机制总结如下：
[0003]-在rcpg的未活化的静止状态中，g蛋白的α亚基与核苷酸gdp结合(与gdp结合的全g蛋白；
[0004]-在rcpg活化后，rcpg与g蛋白的α亚基结合并触发g蛋白的活化过程，包括两个步骤：1)从g蛋白运出gdp以产生空的g蛋白，以及形成未活化的rcpg/空g蛋白复合物，以及2)gtp的固定，这导致形成活化的gtp形式的g蛋白(与gtp结合的全g蛋白)。在第一步中，受体结合的g蛋白是在称为“空型”的形式。这种状态在文献中被描述为暂时的，因为这种状态描述了核苷酸gtp快速结合到g蛋白的α亚基上。此外，活化的g蛋白的β/γ亚基与α亚基分离；
[0005]-与gtp结合的全g蛋白的α亚基随后与效应物结合以将其活化。接着，效应物活化信号传导通路，从而产生细胞反应；
[0006]-然后，gtp被g蛋白的α亚基水解为gdp，并且α亚基与β/γ亚基重新结合以再次形成与gdp结合的全g蛋白(未活化状态)。
[0007]
鉴于rcpg参与许多信号传导通路，在现有技术中已经产生了用于研究rcpg活性的工具，其目的通常是鉴定具有潜在活性的这些受体的新配体。作为这些工具的示例，我们可以提到使用gtp的不可水解或可缓慢水解的放射性衍生物，特别是gtp-γ-s(当受体被活化时，gtp-γ-s与g蛋白α结合)。还有基于酶活性测量的重组系统，例如，荧光素酶，其表达由受体活化产生的第二信使控制。还合成了用于在细胞表面的水平上检测rcpg活化的抗体[1]。还可以参考专利ep2723764 b1，其提出了与g蛋白α和g蛋白β/γ之间的界面结合的纳米抗体，从而使rcpg/g蛋白的复合物得以稳定。
[0008]
然而，现有技术没有描述：当用ret配偶体对的成员标记抗体或抗体片段，并与用ret配偶体对的成员标记的gtp一起使用时能够产生ret信号。
[0009]
发明人已经开发了抗体或抗体片段，其通过使用ret配偶体对的成员标记的gtp执行ret方法用于检测rcpg活化。发明人还表明，这些抗体或抗体片段具有这些特性，因为其能够在非常特定的区域与g蛋白α结合。

技术实现要素：

[0010]
本发明的第一个目的涉及能够结合g蛋白α的抗体或抗体片段，其包含：
[0011]-重链可变结构域，其含有氨基酸序列seq id no：1的cdr1、氨基酸序列seq id no：2的cdr2、和氨基酸序列seq id no：3的cdr3；和
[0012]-轻链可变结构域，其含有氨基酸序列seq id no：4的cdr1、氨基酸序列dts(即，三个氨基酸asp thr ser)的cdr2、和氨基酸序列seq id no：5的cdr3。
[0013]
本发明的第二目的涉及与本发明第一目的的抗体或抗体片段竞争性结合g蛋白α的抗体或抗体片段。
[0014]
本发明的第三个目的涉及包含根据本发明的抗体或抗体片段的组合物。
[0015]
本发明的第四个目的涉及试剂盒(kit-of-parts)(法语trousse de r
é
actifs)，其包含(i)本根据发明的抗体或抗体片段或根据本发明的组合物和(ii)ret配偶体对的成员标记的gtp来源。
[0016]
本发明的第五个目的涉及编码根据本发明的抗体或抗体片段的核酸序列。
[0017]
本发明的第六个目的涉及包含根据本发明的核酸序列的载体。
[0018]
本发明的第七个目的涉及包含根据本发明的载体、或根据本发明的核酸序列的细胞。
[0019]
详细描述
[0020]
定义
[0021]
术语“抗g蛋白α的抗体”、“抗gα的抗体”或“能够结合g蛋白α的抗体”(或抗体片段)是可互换的，意指以足够亲和力结合g蛋白α的抗体(或抗体片段)，其通过靶向g蛋白α也作检测(例如，进行ret)、诊断和/或的试剂。
[0022]
术语“抗体”也称为“免疫球蛋白”，意指由两条各约50-70kda的重链(重链称为h链)和两条各约25kda的轻链(轻链称为l链)通过链内和链间二硫键结合一起组成的异四聚体。每条链由在n末端位置的可变区或结构域(轻链称为vl，重链称为vh)和在c末端位置的恒定区(由对于轻链称为cl的单个结构域以及对于重链称为ch1、ch2、ch3、ch4的三个或四个结构域组成)组成。每个可变结构域通常包含4个“铰链区”(称为fr1、fr2、fr3、fr4)和3个直接负责与抗原结合的区域，称为“cdr”(指cdr1、cdr2、cdr3)。抗体可以是，例如，哺乳动物抗体(如鼠抗体)、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[0023]“嵌合抗体”是指轻链和重链的可变区序列与轻链和重链的恒定区序列属于不同物种的抗体。出于本发明的目的，重链和轻链的可变区序列优选地是鼠源的，而重链和轻链的恒定区的序列属于非鼠物种。在这方面，对于恒定区，所有非鼠哺乳动物的物种都是可用的，特别是人、猴子、旧世界猪(猪科)、牛科、马科、猫科、犬科或鸟，该列表并非穷举。优选地，根据本发明的嵌合抗体包含人源的重链和轻链的恒定区序列以及鼠源的重链和轻链的可变区序列。
[0024]“人源化抗体”指抗体中参与识别抗原的区域的全部或部分序列(高变区或cdr：互补决定区)以及有时fr区(框架区)的某些氨基酸是非人源的，但是不参与识别抗原的恒定区和可变区的序列是人源的。
[0025]“人抗体”是指对于轻链的可变区和恒定区以及重链的可变区和恒定区两者仅包含人序列的抗体。
[0026]“抗体片段”是指通过酶切消化获得的或通过生物生产获得的免疫球蛋白的任何部分，其包含至少一个二硫键并且能够与完整抗体所识别的抗原结合，例如fab、fab'、f(ab')2、fab'-sh。木瓜蛋白酶对免疫球蛋白的酶切消化产生两个称为fab的相同片段(抗原结合片段)和片段fc(可结晶片段)。胃蛋白酶对免疫球蛋白的酶切消化产生片段f(ab')2和
分为若干肽的片段fc。f(ab')2由通过链间二硫键结合的两个fab'片段形成。fab部分由可变区以及ch1和cl结构域组成。fab'片段由fab区和铰链区组成。fab'-sh是指其中铰链区的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的fab'片段。
[0027]
术语“亲和力”是指在分子(例如，抗体或抗体片段)与识别的抗原(例如，抗原，如g蛋白α)之间所有非共价相互作用的力。亲和力通常由解离常数(kd)表示。解离常数(kd)可以通过公知的方法测量，例如，通过fret或spr。
[0028]
在本发明的意义上，“同一性”或“同源性”通过比较在比较窗口中对齐的两个序列进行计算。序列的比对可以确定在比较窗口中两个序列的共同位置(核苷酸或氨基酸)的数量。因此，将共同位置的数量除以比较窗口中的位置总数并乘以100以获得百分比同一性。可以手动或使用公知的软件确定序列的百分比同一性。
[0029]
在本发明的特定实施方案中，同一性或同源性对应于氨基酸残基的至少一个取代，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个取代，优选保守地进行至少一个氨基酸残基取代。“保守地进行氨基酸残基的取代”包括用具有相似特性的侧链的另一个氨基酸残基取代一个氨基酸残基。具有相似特性的侧链的氨基酸家族是公知的；我们可以提及，例如，碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、氨酸、组氨酸)。
[0030]
因此，同源抗体或抗体片段或“抗体或抗体片段的变体”(即，具有相同功能的抗体或抗体片段)具有可以在恒定区和/或可变区水平上被其他氨基酸取代的某些氨基酸，而不会失去与抗原结合的能力。这种取代优选在编码抗体或抗体片段的dna序列内进行，即取代本质上是保守的。本领域技术人员应用其一般知识用于确定可以进行的取代的数量和取代的位置，以保持抗体或抗体片段的功能。为了确定抗体或抗体片段的一种或多种变体与抗原特异性结合的能力，可以使用本领域技术人员熟知的并在现有技术中有描述的若干合适的方法。因此，抗体或抗体片段可以通过结合技术进行测定，例如elisa、亲和层析技术等。抗体或抗体片段的变体可以通过，例如，“噬菌体展示”方法(允许生成噬菌体文库)产生。已知有大量方法可用于生成“噬菌体展示”文库和靶向具有所需功能特征的抗体或抗体片段的变体。
[0031]“纯化的”和“分离的”指根据本发明的抗体或抗体片段在基本上不存在相同类型的其他生物大分子的情况下存在。如本文所用，术语“纯化的”优选表示相对于所有大分子而言，存在至少75重量％、更优选至少85重量％、甚至更优选至少95重量％以及最优选至少98重量％的抗体。
[0032]
术语“g蛋白”意指由称为g蛋白α、g蛋白β和g蛋白γ的三个亚基组成的异源三聚体蛋白。
[0033]
术语“g蛋白α”或“gα”意指g蛋白的α亚基。g蛋白α具有两个结构域，gtp酶结构域和α螺旋结构域。至少有20种不同的g蛋白α，其可分类至以下主要蛋白家族：gαs(已知可活化腺苷酸环化酶以增加camp的合成)、gαi(已知抑制腺苷酸环化酶)、gαolf(与嗅觉受体相关)、gαt(已知在视网膜中视觉信号的转导与视紫红质相关)、gαq(已知刺激磷脂酶c)或gα
12/13家族(已知调节细胞骨架、细胞连接和其他与细胞运动相关的过程)。g蛋白α可以选自g蛋白αi、g蛋白αo和/或g蛋白αz。g蛋白αi可以选自g蛋白αi1、g蛋白αi2和/或g蛋白αi3。g蛋白αi可以是人或动物来源的。
[0034]
有利地，根据本发明的抗体或抗体片段结合至g蛋白αi、g蛋白αo和/或g蛋白αz，例如根据本发明的抗体或抗体片段结合至g蛋白αi1、g蛋白αi2和/或g蛋白αi3。对于同工型1，人来源的g蛋白αi1携带标识符uniprot p63096-1，对于同工型2，带有标识符uniprot p63096-2。编码人来源的g蛋白αi1的基因称为“gnai1”(基因id：2770，ncbi)。
[0035]
术语“gtp”意指鸟苷三磷酸。
[0036]
术语“不可水解或可缓慢水解的gtp”意指不会水解或很少水解为gdp的gtp类似物。我们可以提及，例如，gtpγs(cas号37589-80-3)、gppnhp(cas号148892-91-5)或gppcp(cas号10470-57-2)。
[0037]
术语“用ret配偶体对的成员标记的不可水解或可缓慢水解的gtp”或“标记的不可水解或可缓慢水解的gtp”是可互换的，意指用ret配偶体对的供体成员标记的不可水解或可缓慢水解的gtp(“gtp-供体”)，或用ret配偶体对的接受体(accepteur)的成员标记的不可水解或可缓慢水解的gtp(“gtp-接受体”)。
[0038]
术语“ret”(是共振能量转移的缩写)意指能量转移技术，包括fret和bret。
[0039]
术语“fret”(是荧光共振能量转移的缩写)，意指两个荧光分子之间的能量转移。fret被定义为由能量供体和能量接受体之间的偶极-偶极相互作用产生的非辐射能量转移。这种物理现象要求这些分子之间具有能量相容性。这意味着供体的发射谱必须至少部分地与接受体的吸收谱重叠。根据理论，fret是取决于两个分子(供体和接受体)之间距离的方法：当这些分子彼此靠近时将发出fret信号。例如，抗体和其靶标之间的解离常数(kd)通过fret测量，如示例中所示。
[0040]
术语“bret”(是生物发光共振能量转移的缩写)，意指在生物发光分子和荧光分子之间的能量转移。
[0041]
根据本发明的抗体或抗体片段
[0042]
本发明的第一个目的涉及能够结合g蛋白α的抗体或抗体片段，其包含：
[0043]-重链可变结构域，其包含氨基酸序列seq id no：1的cdr1、氨基酸序列seq id no：2的cdr2、和氨基酸序列seq id no：3的cdr3；和
[0044]-轻链可变结构域，其包含氨基酸序列seq id no：4的cdr1、氨基酸序列dts(即三个氨基酸“asp thr ser”，即天冬氨酸、苏氨酸和丝氨酸三个氨基酸)的cdr2以及氨基酸序列seq id no：5的cdr3。
[0045]
重链可变结构域可以包含：
[0046]-与氨基酸序列seq id no：6具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同源性的fr1，
[0047]-与氨基酸序列seq id no：7具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同源性的fr2，
[0048]-与氨基酸序列seq id no：8具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同源性的fr3和/或
[0049]-与氨基酸序列seq id no：9具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至
少95％同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同源性的fr4。
[0050]
轻链可变结构域可以包含：
[0051]-与氨基酸序列seq id no：10具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同源性的fr1，
[0052]-与氨基酸序列seq id no：11具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同源性的fr2
[0053]-与氨基酸序列seq id no：12具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同源性的fr3和/或
[0054]-与氨基酸序列seq id no：13具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同源性的fr4。
[0055]
在根据本发明的抗体的一个具体实施方案中：
[0056]
·
重链可变结构域包含：
[0057]-氨基酸序列seq id no：6的fr1(即，与氨基酸序列seq id no：6具有100％同源性)、
[0058]-氨基酸序列seq id no：7的fr2、
[0059]-氨基酸序列seq id no：8的fr3和
[0060]-氨基酸序列seq id no：9的fr4；以及
[0061]
·
轻链可变结构域包含：
[0062]-氨基酸序列seq id no：10的fr1、
[0063]-氨基酸序列seq id no：11的fr2、
[0064]-氨基酸序列seq id no：12的fr3和
[0065]-氨基酸序列seq id no：13的fr4。
[0066]
在本发明的抗体的一个具体实施方案中，重链可变结构域可以与氨基酸序列seq id no：14具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源性，轻链可变结构域可以与氨基酸序列seq id no：15具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源性。
[0067]
因此，本发明涉及一种抗体或抗体片段，其中：
[0068]-重链可变结构域与氨基酸序列seq id no：14具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源性；
[0069]-轻链可变结构域与氨基酸序列seq id no：15具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源性；以及
[0070]-重链可变结构域的cdr1由氨基酸序列seq id no：1组成、重链可变结构域的cdr2由氨基酸序列seq id no：2组成、重链可变结构域的cdr3由氨基酸序列seq id no：3组成、轻链可变结构域的cdr1由氨基酸序列seq id no：4组成、轻链可变结构域的cdr2由氨基酸序列dts组成以及轻链可变结构域的cdr3由氨基酸序列seq id no：5组成。
[0071]
有利地，重链可变结构域由氨基酸序列seq id no：14组成(即，重链可变结构域与
氨基酸序列seq id no：14具有100％同源性)和轻链可变结构域由氨基酸序列seq id no：15组成。
[0072]
在参考dsv36s的示例中描述的抗体包含由氨基酸序列seq id no：14组成的重链可变结构域和由氨基酸序列seq id no：15组成的轻链可变结构域。
[0073]
根据上述第一目的的抗体或抗体片段在下文中称为“参考抗体或抗体片段”。
[0074]
本发明的第二个目的涉及与参考抗体或抗体片段竞争性结合g蛋白α的抗体或抗体片段，下文称为“竞争性抗体或抗体片段”。
[0075]
抗体或抗体片段与参考抗体或抗体片段竞争性结合g蛋白α的能力可以通过竞争性方法测定。“竞争性方法”包括测试抗体(或抗体片段)阻断参考抗体或抗体片段与抗原之间的结合、或与参考抗体或抗体片段竞争性结合抗原的能力。换言之，与参考抗体或抗体片段竞争的抗体同参考抗体或抗体片段结合至相同的表位，或结合的表位足够接近参考抗体或抗体片段识别的表位，从而因为空间位阻的原因阻止参考抗体或抗体片段与表位结合。
[0076]
许多类型的竞争性方法可以用于确定抗体或抗体片段是否同参考抗体或抗体片段进行竞争，例如：通过竞争性elisa测定、通过免疫荧光法(如通过fret或htrf(“均相时间分辨荧光”)测定)、通过免疫发光法、通过直接或间接夹心法、通过直接或间接固相放射免疫测定(ria)、通过直接或间接固相酶免疫测定(eia)、通过表面等离子共振技术(例如，biacore)、通过流式细胞术、通过荧光偏振(例如，在荧光肽和待测抗体之间)等。例如，竞争性elisa方法涉及使用与固体表面或细胞结合的纯化的抗原、结合未标记的抗原的待测试的抗体和标记的参考抗体或抗体片段。通常，参考抗体或抗体片段以非饱和浓度存在(相对于其对于g蛋白α的解离常数kd)，并且在待测抗体或抗体片段浓度逐渐增加时测量信号。当抗体过量存在时，其可以阻断或抑制(例如减少)参考抗体或抗体片段与抗原的特异性结合的至少40-45％、45-50％、50-55％、55％-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％或更多。在一些情况下，结合被抑制至少80至85％、85至90％、90至95％、95至97％或97％或更多。
[0077]
特别地，与参考抗体或抗体片段竞争性结合g蛋白α的抗体或抗体片段通过进行htrf测定或通过进行荧光偏振测定进行鉴定，优选通过htrf测定进行鉴定。当抗体或抗体片段与参考抗体或抗体片段竞争性结合g蛋白α时，抗体或抗体片段能够抑制由参考抗体或抗体片段产生的htrf信号。相反地，不与参考抗体或抗体片段竞争性结合g蛋白α的抗体或抗体片段不能抑制由参考抗体或抗体片段产生的htrf信号。
[0078]
根据本发明的竞争性抗体或抗体片段可以，例如通过执行实施例1中所述的操作方案利用参考抗体或抗体片段而获得。抗体dsv38s是根据本发明的竞争性抗体。
[0079]
在一个具体实施方案中，抗体dsv38s和/或抗体dsv36s被排除在根据本发明的竞争性抗体或抗体片段之外。
[0080]
如上定义的参考抗体或抗体片段和竞争性抗体或抗体片段在下文中统称为“根据本发明的抗体或抗体片段”。
[0081]
根据本发明的抗体或抗体片段可以结合至分离形式的g蛋白α和/或存在于膜环境中的g蛋白α，例如，根据本发明的抗体或抗体片段可以结合至携带一种或多种rcpg和一种或多种g蛋白α的膜制备物中存在的g蛋白α。对于根据本发明的能够结合g蛋白α的抗体而言，g蛋白α与rcpg复合不是必需的。
[0082]
根据本发明的抗体或抗体片段可以以fret测量的小于或等于20nm的解离常数
(kd)与g蛋白α结合。低于20nm的解离常数对于ret的合适性能是优选的。有利地，根据本发明的抗体或抗体片段可以以fret测量的小于或等于20nm的解离常数(kd)与g蛋白α结合，例如，亲和力常数小于或等于10nm、或小于或等于5nm，例如，从0至20nm(排除0)、从0至10nm(排除0)、从0至5nm(排除0)。通过fret测量根据本发明的抗体或抗体片段的kd的方法描述在实施例2中。
[0083]
根据本发明的抗体或抗体片段可用于在使用ret配偶体对的成员标记gtp的ret方法中。
[0084]
根据本发明的抗体或抗体片段在进行ret，特别是fret时特别有利，特别是用于检测g蛋白α的活化。因此，根据本发明的抗体或抗体片段可以与允许其检测的分子偶联。有利地，根据本发明的抗体或抗体片段可以用ret配偶体对的成员进行标记。
[0085]
例如，根据本发明的抗体或抗体片段可以通过执行实施例1中所述的操作方案获得。
[0086]
发明人还表明，根据本发明的抗体或抗体片段与g蛋白α的switchii结构域结合，更具体地与g蛋白α的肽215-294结合。
[0087]
根据本发明的抗体或抗体片段的标记
[0088]
根据本发明的抗体或抗体片段可以通过本领域技术人员熟悉的方法直接或间接标记，例如下文所述，但优选抗体通过共价键直接用ret配偶体对的成员标记。
[0089]
术语“ret配偶体对”意指由能量供体化合物(以下称为“供体化合物”)和能量接受化合物(以下称为“接受体化合物”)组成的对；当能量供体化合物和能量接受化合物彼此靠近并在供体化合物的激发波长下被激发时，这些化合物发射出ret信号。众所周知，要成为ret配偶体的两种化合物，供体化合物的发射光谱必须与接受体化合物的激发光谱部分重叠。例如，当使用荧光供体化合物和接受体化合物时称为“fret配偶体对”，或者当使用生物发光供体化合物和接受体化合物时称为“bret配偶体对”。
[0090]
可以通过本领域技术人员已知的常规方法，基于抗体或抗体片段上存在的反应性基团，使用ret配偶体对的成员(例如，当采用fret时为荧光化合物)进行直接标记抗体或抗体片段。例如，可以使用以下反应性基团：末端氨基基团、天冬氨酸和谷氨酸的羧酸基团、赖氨酸的胺基团、精氨酸的胍基团、半胱氨酸的硫醇基团、酪氨酸的酚基基团、氨酸的吲哚环、甲硫氨酸的硫醚基团、组氨酸的咪唑基团。
[0091]
反应性基团可以与抗体或抗体片段所携带的反应性基团形成共价键。抗体或抗体片段所携带的合适的反应性基团是本领域技术人员公知的，例如用马来酰亚胺基团官能化的供体化合物或接受体化合物将，例如，能够共价结合至由抗体或抗体片段携带的半胱氨酸所携带的硫醇基团。类似地，携带n-羟基琥珀酰亚胺酯的供体/接受体化合物将能够共价结合至抗体或抗体片段中存在的胺。
[0092]
根据本发明的抗体或抗体片段也可以用荧光或生物发光化合物间接标记，例如通过将自身与接受体/供体化合物共价结合的抗体或抗体片段引入测量介质中，该第二抗体或抗体片段特异性识别根据本发明的抗体或抗体片段。
[0093]
另一种很常规的间接标记方法包括：将生物素固定在待标记的抗体或抗体片段上，然后在用接受体/供体化合物标记的链霉亲和素存在下温育该生物素化的抗体或抗体片段。合适的生物素化的抗体或抗体片段可以通过本领域技术人员熟悉的技术制备；
c3)、gtpgn-辛基-c2(gtp-γ-n-辛基-c2)、gtpgn-辛基-c11(gtp-γ-n-辛基-c11)、gtpgn-辛基-c3(gtp-γ-n-辛基-c3)、gtpgo-已基-c2(gtp-γ-o-已基-c2)、gtpgo-已基-c3(gtp-γ-o-已基-c3)或gtp-gn-辛基-硫代琥珀酰亚胺基-c2(gtp-γ-n-辛基-硫代琥珀酰亚胺基-c2)，优选gtp-gn-辛基-硫代琥珀酰亚胺基-c2。
[0109]
根据本发明，标记的gtp是用荧光接受体化合物标记的不可水解或可缓慢水解的gtp，所述荧光接受体化合物选自gtpgn-辛基-cy5、gtpgn-辛基-af488、gtpgn-l15-荧光素、gtpgo-接头-cy5(p)或gtpgs-接头-cy5(r)。gtp也可以用非荧光接受体化合物(猝灭剂)标记。
[0110]
gtp-gn-辛基-硫代琥珀酰亚胺基-c2如下所示。
[0111][0112]
在本发明的一个具体实施方案中，gtp用荧光供体化合物标记，抗体或抗体片段用荧光接受体化合物或非荧光接受体化合物(猝灭剂)标记。在另一个具体实施方案中，gtp用荧光接受体化合物或非荧光接受体化合物(猝灭剂)标记，抗体或抗体片段用荧光供体化合物或发光供体化合物标记。
[0113]
上述其他标记的gtp及其制备方法描述于2019年1月30日提交的编号为fr1900856的法国专利申请中，通过引用并入本文。
[0114]
有利地，(i)是包含由氨基酸序列seq id no：14组成的重链可变结构域和由氨基酸序列seq id no：15组成的轻链可变结构域的抗体以及(ii)是gtp-gn-辛基-硫代琥珀酰亚胺基-c2。
[0115]
其他目的
[0116]
本发明的第五个目的涉及编码根据本发明的(参考的或竞争性的)抗体或抗体片段的核酸序列。
[0117]
本发明的第六方面涉及包含根据本发明的核酸序列的载体。任何适合产生抗体的载体类型都可以用于本发明的上下文中。具体地，载体是重组载体。载体将包含用于产生根据本发明的抗体所必需的核酸序列，例如启动子序列、调节序列等。合适的载体的制备方法在文献中广泛描述。
[0118]
本发明的第七个目的涉及包含根据本发明的载体或根据本发明的核酸序列的细胞。根据本发明的细胞可以通过文献中广泛描述的方法获得，例如通过用根据本发明的载体或核酸序列转染细胞克隆。本发明不限于特定的细胞类型。任何能够产生抗体的细胞都可以用于本发明的上下文中。这些细胞可以是真核细胞(如哺乳动物细胞，例如人细胞或小
鼠细胞)或原核细胞，例如细菌或酵母。
[0119]
本发明将通过下文给出的附图和实施例进一步说明。然而，这些实施例和这些附图在任何情况下都不应被解释为限制本发明的范围。
附图说明
[0120]
图1显示用于测量抗g蛋白αi1抗体的kd的fret反应方案。
[0121]
图2显示说明d2标记的抗体sc13533、dsv36s和dsv38s对人g蛋白αi1(或蛋白gai1)的亲和力的曲线。在存在g蛋白αi1的情况下，在存在和不存在核苷酸(gtpgs或gdp)的情况下，所有抗体都获得了非常显著的htrf信号。结果表明抗体dsv36s、dsv38s和sc13533能够结合g蛋白αi1。这些曲线使得计算这些不同抗体对蛋白gαi1的亲和力(kd)成为可能(表1)。
[0122]
图3是说明未标记的抗体dsv36s、dsv38s和sc13533抑制抗体sc13533-d2与人g蛋白i1结合的能力的曲线。从逻辑上讲，未标记的抗体sc13533已经完全抑制了用抗体sc13533-d2获得的htrf信号。相反，抗体dsv36s和dv38s不能抑制sc13533-d2产生的信号。这表明这2种抗体不与抗体sc 13533结合到g蛋白αi1的相同区域。总之，抗体dsv36s和dsv38s与抗体sc 13533识别不同的表位。
[0123]
图4显示商业抗体sc-13533、sc-56536和am05302pu-n抑制抗体dsv sc13533-d2与人g蛋白i1结合的能力。从逻辑上讲，未标记的抗体dsv sc13533已经完全抑制了用抗体sc13533-d2获得的htrf信号。此外，抗体sc-56536和am05302pu-n已经完全抑制了用抗体sc13533-d2获得的htrf信号。总之，商业抗体sc-13533、sc-56536和am05302pu-n都是抗体dsv 36s的非竞争性抗体。因此，所有这些抗体都与抗体dsv 36s识别不同的表位。
[0124]
图5显示商业抗体sc-13533、sc-56536和am05302pu-n抑制抗体dsv 3s-d2(在实验室中产生的)与人g蛋白i1结合的能力。从逻辑上讲，未标记的抗体dsv 3s完全抑制了用抗体dsv 3s-d2获得的htrf信号。此外，抗体sc-13533、sc-56536和am05302pu-n完全抑制了抗体dsv 3s-d2获得的htrf信号。总之，这些结果表明商业抗体sc-13533、sc-56536和am05302pu-n都是抗体dsv 36s的非竞争性抗体。因此，这同样适用于实验室产生的抗体dsv 3s。因此，所有这些抗体都与抗体dsv 36s识别不同的表位。
[0125]
图6是说明未标记抗体dsv36s和dsv38s抑制抗体dsv36s-d2与g蛋白αi1结合的能力的曲线。从逻辑上讲，未标记的抗体dsv36s已经完全抑制了抗体dsv36s-d2获得的htrf信号。抗体dsv38s也已经完全抑制了dsv36s-d2产生的信号。这表明这两种抗体结合在g蛋白αi1的相同区域上。总之，抗体dsv38s与抗体dsv36s竞争性结合g蛋白αi。
[0126]
图7显示了商业抗体dsv 36s、dsv 26s、dsv 3s和dsv 39s抑制抗体dsv36s-d2与人g蛋白i1结合的能力。从逻辑上讲，未标记的抗体dsv36s已经完全抑制了抗体dsv36s-d2获得的htrf信号。相反，抗体dsv 26s、dsv 3s和dsv 39s不能抑制dsv 36s-d2产生的信号。这表明这三种抗体并不与抗体dsv 36s结合在人g蛋白αi1的相同区域。总之，所有这些抗体都与抗体dsv 36s识别不同的表位。
[0127]
图8a和图8b显示了用于测量抗体dsv36s、dsv38s和sc13533对不同类型的g蛋白α的选择性的fret反应方案。
[0128]
图9是使用一对抗体抗twin-strep-tag-lumi4 tb/抗flag-d2获得的不同类型的g蛋白α的fret信号的图表，这可以验证质粒编码的全部g蛋白α确实在hek293中过表达。事实
上，用每一个g蛋白α中获得的htrf信号远大于使用阴性条件(“模拟(mock)”)获得的htrf信号，阴性条件对应于用对照质粒(其不编码任何蛋白标签flag+twin-strep-tag)转染的hek293。
[0129]
图10是说明抗体dsv36s、dsv38s和sc13533对不同类型的g蛋白α的选择性的图表。当蛋白gαi1、gαi2、gαi3、gαo和gαz过表达时，抗体dsv36s和dsv38s给出阳性htrf信号，但当蛋白gαs、gαq、gα12和gα13过表达时，抗体dsv36s和dsv38s不产生htrf信号。当蛋白gαi1和gαi3过表达时，抗体sc13533给出阳性htrf信号，但当蛋白gαi2、gαo、gαz、gαs、gαq、gα12和gα13过表达时，抗体sc13533不产生htrf信号。这些结果证实了抗体dsv36s和dsv38s识别g蛋白α上的相同表位(抗体dsv36s和dsv38s具有相同的选择谱，因而是竞争性的)。该表位不同于抗体sc13533识别的表位，抗体sc13533识别较少数量的g蛋白α。
[0130]
图11是说明当抗体dsv36s、dsv38s和sc13533在过表达rcpg的膜制备物中与荧光gtp类似物(gtpgn-辛基-c2-铕穴状化合物)组合时产生tr-fret信号的能力的图表。条件“gtpgs”代表测定的非特异性信号(ns)，其中过量未标记的gtpgs(100μm)抑制了gtpgn-辛基-c2-铕穴状化合物与g蛋白α的结合，因此阻止了fret信号的出现。条件“缓冲液”表示在gtpgn-辛基-c2-铕穴状化合物与d2标记的抗体dsv36s和dsv 38s之间可以获得中等但显著的fret信号。通过添加snc162(这会导致膜中过表达的dor受体被活化)，观察到这种fret信号的增加，这与荧光gtp类似物对抗体dsv36s和dsv38s识别的蛋白gαi1、gαi2、gαi3、gαo和gαz中的部分或全部的结合增加有关。相反地，尽管抗体sc13533具有结合蛋白gαi1和gαi3(这些蛋白在hek293细胞中内源性表达[2])的能力，但当抗体sc13533与gtpgn-辛基-c2-铕穴状化合物组合时，无论snc162存在与否，都不能给出任何fret信号。这些结果证明只有根据本发明的抗体能够产生fret信号。
[0131]
图12显示了抗体dsv 36s、dsv 26s、dsv 3s和dsv 39s在与荧光gtp类似物(gtpgn-辛基-c2-铕穴状化合物)组合时，在过表达未活化的rcpg的膜制备物中，产生tr-fret信号的能力。条件“非特异性信号”表明检测到在荧光gtp类似物和d2标记的抗体之间的弱的基线fret信号。条件“阴性对照”代表测定的非特异性信号，其中过量的未标记gtpgs(100μm)抑制了荧光gtp类似物与g蛋白α的结合，因此阻止了fret信号的出现。测量到的抑制是完全的，因为在“非特异性信号”和“阴性对照”条件下测量的htrf信号水平几乎相同。在添加荧光gtp类似物和抗体后，测量到fret信号的增加，该增加关联于gtp的荧光类似物与抗体dsv36s识别的蛋白gαi1、gαi2、gαi3、gαo和gαz中的部分或全部的结合增加。相反，尽管抗体dsv 26s、dsv 3s和dsv 39s具有结合hek293细胞中g蛋白αi的能力，但抗体dsv 26s、dsv 3s和dsv 39s在与gtpgn-辛基-c2-铕穴状化合物组合时不产生任何fret信号。总之，这些结果证明只有根据本发明所述的抗体能够产生fret信号。
[0132]
图13显示，在过表达未活化的rcpg的膜制备物中，抗体dsv 36s和sc-13533与荧光gtp类似物(gtpgo-接头-cy5(p))组合时产生tr-fret信号的能力。条件“非特异性信号”表明检测到在荧光gtp类似物和铽穴状化合物标记的抗体之间的弱的基线fret信号。条件“阴性对照”代表测定的非特异性信号，其中过量的未标记gtpgs(100μm)抑制了荧光gtp类似物与g蛋白α的结合，因此阻止了fret信号的出现。测量到的抑制是完全的，因为在“非特异性信号”和“阴性对照”条件下测量的htrf信号水平几乎相同。通过添加荧光gtp类似物和抗体，测量出fret信号的增加，其关联于荧光gtp类似物与抗体dsv36s识别的蛋白gαi1、gαi2、
gαi3、gαo和gαz中的部分或全部的结合增加。相反地，尽管抗体sc-13533具有结合蛋白gαi1和gαi3(这些蛋白在hek293细胞中内源性表达)的能力，但当抗体sc-13533与gtpgo-接头-cy5(p)组合时，抗体sc-13533不产生任何fret信号。总之，只有根据本发明所述的抗体能够产生fret信号。
[0133]
图14a和图14b显示可以同根据本发明的抗体一起使用的两种fret的图式(format)(图式2a和图式2b)。
[0134]
图15a和图15b显示使用检测对：gtpgn-辛基-c2+dsv36s-d2，根据图式2a对δ阿片rcpg进行活化测定。
[0135]
图16a和图16b显示使用检测对：gtpgn-辛基-c2+dsv36s-d2，根据图式2a对δ阿片rcpg进行活化测定。
[0136]
图17a和图17b显示使用检测对：gtpgn-辛基-c2+dsv38s-d2，根据图式2a对δ阿片rcpg进行活化测定。
[0137]
图18a和图18b显示使用检测对：gtpgn-辛基-c11+dsv36s-d2，根据图式2a对δ阿片rcpg进行活化测定。
[0138]
图19a和图19b显示使用检测对：gtpgo-己基-c2+dsv36s-d2，根据图式2a对δ阿片rcpg进行活化测定。
[0139]
图20a和图20b显示使用检测对：gtpgn-c2+dsv36s-d2，根据图式2a对δ阿片rcpg进行活化测定。
[0140]
图21a和图21b显示使用检测对：gtpgn-辛基-c2+dsv36s-d2，根据图式2a对rcpg多巴胺d2s进行活化测定。
[0141]
图22a和图22b显示使用检测对：gtpgn-辛基-c2+dsv36s-d2，根据图式2a对rcpg多巴胺d2s进行活化测定。
[0142]
图23a和图23b显示使用检测对gtpgn-辛基-c2+dsv36s-d2，根据图式2a对rcpg多巴胺d2s进行活化测定。
[0143]
图24a和图24b显示使用检测对：gtpgn-辛基-cy5+dsv36s-lumi4tb，根据图式2b对δ阿片rcpg进行活化测定。
[0144]
图25a和图25b显示使用检测对：gtpgn-辛基-af488+dsv36s-lumi4tb，根据图式2b对δ阿片rcpg进行活化测定。
[0145]
图26a和图26b显示使用检测对：gtp-gn-辛基-硫代琥珀酰亚胺基-c2+dsv36s-d2，根据图式2a对δ阿片rcpg进行活化测定。
具体实施方式
[0146]
实施例
[0147]
材料
[0148]
表达δ阿片受体(dor)的细胞膜制备物通过服务供应从euroscreen购得。
[0149]
抗体dsv36s、dsv38s、dsv 26s、dsv 3s和dsv 39s由cisbio bioassays产生并且可根据需要从cisbio bioassays获得(分别在参考号dsv36s、dsv38s、dsv26s、dsv 3s和dsv 39s下)。抗体dsv36s包含由氨基酸序列seq id no：14组成的重链可变结构域和由氨基酸序列seq id no：15组成的轻链可变结构域。抗体用兼容的荧光探针标记以用于tr-fret检测
(对接受体为红-d2或对供体为lumi4tb)。
[0150]
抗体sc13533和sc56536购自santa cruz biotechnology(参考号sc13533和参考号sc56536)。抗体am05302pu-n购自acris antibodies gmbh(参考号am05302pu-n)。
[0151]
抗twin-strep-tag的抗体购自iba lifesciences(参考号2-1517-001)，并用与tr-fret检测兼容的荧光探针(对供体为lumi4tb)进行标记。
[0152]
抗体抗flag-d2可从cisbio bioassays(参考号61fg2dlf)获得。
[0153]
核苷酸gdp和gtpγs购自sigma aldrich(各自的目录参考号为g7127和g8634)。
[0154]
δ阿片rcpg的激动剂(snc162)购自tocris biosciences(参考号1529)。
[0155]
适用于细胞培养的384孔低容量板(白底白板)和黑96孔板(黑底)购自greiner bio one(目录参考号分别为784075和665086)。
[0156]
用供体荧光团(铕穴状化合物)标记的不可水解/可缓慢水解的gtp类似物(gtpgn-辛基-c2)由cisbio bioassays合成。用接受体荧光团(cy5)标记的不可水解/可缓慢水解的gtp类似物(gtpgo-接头-cy5(p))购自jena bioscience(参考号nu-834-cy5)。
[0157]
在n末端与标签twin-strep-tag融合的人重组g蛋白αi1通过cisbio bioassays生产和纯化。
[0158]
编码n末端部分融合有标签twin-strep-tag和flag的各种人g蛋白gαi1、gαi2、gαi3、gαo、gαz、gαs、gαq、gα12和gα13的质粒，通过genecust公司合成和扩增(提供服务)。
[0159]
hek293细胞购自atcc。
[0160]
细胞实验中使用的试剂和介质、opti-mem介质、脂质体(lipofectamine)2000和聚鸟氨酸分别购自thermo fisher scientific(参考号51985-026和11668-019)和sigma aldrich(参考号p4957)。
[0161]
方法
[0162]
读取fret信号(htrf技术)
[0163]
htrf信号按以下配置在pherastar读取器(bmg labtech)上测量：
[0164]
·
模块：htrf(激发337nm，发射665nm和620nm)
[0165]
·
激发：激光，闪烁40次或灯，闪烁100次
[0166]
·
读取窗口：延迟：60μs
–
整合(int
é
gration)：400μs。
[0167]
处理htrf信号
[0168]
根据以下式从665nm和620nm处的原始信号计算htrf比率：
[0169]
htrf比率＝665nm处的信号/620nm处的信号*10000。
[0170]
实施例1：用于获得根据本发明的抗蛋白gαi1的抗体的操作方案
[0171]
小鼠的免疫
[0172]
在sf9昆虫细胞(感染了编码所述蛋白的杆状病毒)中产生重组的tst-g蛋白αi1(序列uniprot p63096-1的g蛋白αi1，通过tev接头而在n端带有标签twinstreptag(tst)(iba))，然后通过标签twinstreptag(tst)在亲和柱(strep-tactin superflow高容量树脂(iba，目录号：2-1208-002))上进行纯化。
[0173]
通过预先在含有gtpgs的缓冲液(hepes 20mm ph8、nacl 100mm、mgcl2 3mm、chaps 11mm、gtpgs 100μm)中稀释的tst-g蛋白αi1注射balb/c小鼠，进行免疫。初次注射后，以一个月为间隔进行三次加强注射。
[0174]
每次注射后十五天，从小鼠身上采集的血液样品可以验证免疫反应的存在。
[0175]
为此，建立elisa类型的测定。将预先在含有gtpgs的缓冲液中(tris hcl20mm ph8.5、nacl 140mm、edta 2mm、mgcl2 10mm、bsa 0.1％、gtpgs 1μm)稀释至20μg/ml的tst-g蛋白αi1，通过标签twinstreptag吸附在含有strep-xt(iba，目录号：2-4101-001)的96孔板上。为此，向每个孔中加入100μl的蛋白，然后在37℃下温育2小时，接着在含有0.05％tween20的1
×
pbs缓冲液中洗涤3次。
[0176]
然后，将以10至1亿的倍数(factor)进行连续稀释的血液样品以100μl/孔的水平加入，在37℃温育2小时。在含有0.05％tween20的1
×
的pbs缓冲液中通过三次洗涤步骤去除未与蛋白固定的抗体，然后使用与hrp(辣根过氧化物酶)(sigma#a0168，以1/10 000稀释在pbs、bsa 0.1％中)结合的二级抗小鼠fc抗体检测固定的抗体。在37℃温育1小时，然后在含有0.05％tween20的1
×
pbs缓冲液中洗涤3次后，将其底物tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，sigma#t0440)在室温下伴随搅拌温育20分钟之后，在450nm处通过比测定进行hrp检测。
[0177]
为了确保elisa测定检测到的抗体确实是针对g蛋白αi1而不是针对标签twinstreptag，将相同的血液样品在与过量的另一种带有标签twinstreptag的正交蛋白(snaptag-twinstreptag)进行预温育后，在elisa测定中进行测试。因此，抗标签的抗体固定在带标签的正交蛋白上，因此不固定在附着在孔底部的g蛋白αi1上；在这种情况下，没有检测到hrp信号或hrp信号减弱。
[0178]
选择在抗标签对照的情况中具有最佳抗体滴度和最少信号减弱的小鼠，以用于淋巴细胞杂交的下一步，也称为融合。回收小鼠脾脏，在聚乙二醇型的细胞融合催化剂的存在下，将从该脾脏获得的淋巴细胞和浆细胞的混合物在体外与骨髓瘤细胞系融合。使用缺乏酶hgprt(次黄嘌呤鸟苷磷酸核糖基转移酶)的突变的骨髓瘤细胞系以用于选择杂交细胞(称为杂交瘤)。这些细胞培养在含有次黄嘌呤、氨基蝶呤(甲氨蝶呤)和胸腺嘧啶的介质(hat介质)中，以去除未融合的骨髓瘤细胞，从而选择出目的杂交瘤。未融合的脾细胞因为不能在体外增殖，所以死亡。因此，只有杂交瘤存活下来。
[0179]
然后，在培养皿中培养这些杂交瘤。然后，对这些杂交瘤的上清液进行测试以评估杂交瘤产生抗g蛋白αi1的抗体的能力。为此，进行了如上所述的elisa测定。
[0180]
为了评价抗体与不同形式的g蛋白αi1(与gdp结合的全形式vs与gtpgs结合的全形式vs空形式)之间的选择性，在含有1μm的gdp、或1μm的gtpgs的缓冲液、或不含核苷酸的缓冲液中预温育的tst-g蛋白αi1的条件中，进行平行测定。然后，用有限的稀释步骤克隆出最佳的杂交瘤，用以获得杂交瘤克隆。
[0181]
然后，将目的杂交瘤的克隆注射到小鼠中(腹膜内注射)，以允许在腹水中大量产生抗体。
[0182]
然后，在具有蛋白a的树脂的柱上通过亲和层析纯化抗体。
[0183]
上述纯化的抗体与抗体dsv 36s竞争性结合g蛋白α的能力
[0184]
所有试剂均在缓冲液trishcl 50mm ph 7.4、mgcl2 10mm、bsa 0.1％、nacl 10mm中稀释。将g蛋白αi1制备为2
×
，以获得2.5nm的孔中的终浓度。将核苷酸gtpgs制备为2
×
，以获得10μm的孔中的终浓度。这两种试剂在同一种溶液中制备，在室温下预温育30分钟，然后分配到孔中。将上述纯化抗体制备为4
×
，使孔中的终浓度在0.01至1μm之间。将抗体
dsv36s-d2制备为4
×
，终浓度为10nm。将抗twin-strep-tag-lumi4 tb抗体制备为4
×
，以获得0.5nm的孔中的终浓度。
[0185]
将试剂如下分配在384孔板中：
[0186]
1.将10μl预温育的g蛋白αi1+gtpgs的混合物放入每个孔中。
[0187]
2.向每孔中加入5μl的纯化抗体。
[0188]
3.将板在室温下温育30分钟。
[0189]
4.将5μl的抗twin-strep-tag-lumi4 tb抗体和抗体dsv 36s-d2的混合物添加到每个孔中。
[0190]
在读取htrf信号之前，将板在室温下温育1小时。
[0191]
根据本发明的抗体能够抑制用抗体dsv 36s-d2获得的htrf信号。相反地，非根据本发明的抗体不能抑制由dsv36s-d2产生的信号。
[0192]
实施例2：测定d2标记的抗体sc13533、dsv 36s、dsv38s对g蛋白αi1的亲和力
[0193]
实验操作方案
[0194]
所有试剂均在缓冲液trishcl 50mm ph 7.4、mgcl2 10mm、bsa 0.1％、nacl 10mm中稀释。将g蛋白αi1制备为2
×
，以获得2.5nm的孔中的终浓度。将核苷酸gtpgs制备为2
×
，以获得100μm的孔中的终浓度。这两种试剂制备在同一种溶液中，在室温下预温育30分钟，然后分配到孔中。将抗体dsv36s-d2、dsv38s-d2和sc13533-d2制备为4
×
，使孔中的终浓度在0.01至10nm之间(取决于抗体)。将抗twin-strep-tag-lumi4 tb抗体制备为4
×
，以获得0.25nm的孔中的终浓度。
[0195]
将试剂如下分配在384孔板中：
[0196]
1)将10μl的预温育的g蛋白αi1+仅有缓冲液或gtpgs或gdp的混合物放入每个孔中，
[0197]
2)将5μl的d2标记的抗体dsv36s或dsv38s或sc13533加入到每个孔中，
[0198]
3)将5μl的抗twin-strep-tag-lumi4 tb抗体加入到每孔中。
[0199]
在读取htrf信号之前，将板在室温下温育24小时。
[0200]
反应方案如图1所示。
[0201]
结果
[0202]
图2显示了d2标记的抗体dsv36s、dsv38s和sc13533获得的结果。在存在g蛋白αi1的情况下，在存在和不存在核苷酸(gtpgs或gdp)的情况下，所有这些抗体都获得了非常显著的htrf信号。这些结果表明抗体dsv36s、dsv38s和sc13533能够结合g蛋白αi1。
[0203]
此外，获得的抗体滴定曲线可以计算这些不同抗体对g蛋白αi1的亲和力(kd)。这是使用graphpad prism软件对htrf数据应用“一个位点特异性结合”模型进行。获得的kd值显示在表1中。
[0204]
表1：
[0205][0206]
[0207]
kd值表示3种抗体对g蛋白αi1都具有极好的亲和力，无论蛋白状态如何，kd值都在0.1至1nm之间。
[0208]
然而，可以注意到，当g蛋白αi1与核苷酸(特别是gtpgs)结合时，抗体dsv36s和dsv38s给出更高的信号和更高的亲和力。与之相反，无论g蛋白αi1的状态如何，抗体sc13533都显示出相似的信号和相似的亲和力。这表明抗体sc13533与g蛋白αi1的结合方式与抗体dsv36s和dsv38s不同。
[0209]
实施例3：未标记的抗体dsv36s、dsv38s、sc 13533、sc56536和am05302pu-n抑制抗体sc13533-d2与g蛋白i1结合的能力
[0210]
实验操作方案
[0211]
所有试剂均在缓冲液trishcl 50mm ph 7.4、mgcl2 10mm、bsa 0.1％、nacl 10mm中稀释。将g蛋白αi1制备为2
×
，以获得2.5nm的孔中的终浓度。将核苷酸gtpgs制备为2
×
，以获得10μm的孔中的终浓度。这两种试剂制备在同一种溶液中，在室温下预温育30分钟，然后分配到孔中。将冷的抗体dsv36s、dsv38s和sc13533制备为4
×
，使孔中的终浓度在0.01至100nm之间。将抗体sc 13533-d2制备为4
×
，终浓度为10nm。将抗twin-strep-tag-lumi4 tb抗体制备为4
×
，以获得0.5nm的孔中的终浓度。
[0212]
将试剂如下分配在384孔板中：
[0213]
1)将10μl预温育的g蛋白αi1+gtpgs的混合物放入每个孔中，
[0214]
2)将5μl的未标记的抗体dsv36s或dsv38s或sc56536或am05302pu-n或sc13533加入到每孔中，
[0215]
3)将板在室温下温育30分钟，
[0216]
4)将5μl的抗twin-strep-tag-lumi4 tb抗体和5μl的抗体sc13533-d2加入到每孔中。
[0217]
在读取htrf信号之前，将板在室温下温育1小时。
[0218]
结果
[0219]
图3显示了用抗体dsv 36s、dsv 38s和sc 13533获得的结果。从逻辑上讲，未标记的抗体sc 13533完全抑制了使用抗体sc 13533-d2获得的htrf信号。与之相反，抗体dsv36s和dv38s不能抑制sc 13533-d2产生的信号。这表明这2种抗体不与抗体sc 13533结合到g蛋白αi1的相同区域。总之，抗体dsv36s和dsv38s与抗体sc 13533识别不同的表位。
[0220]
图4显示了用抗体sc13533、sc56536和am05302pu-n获得的结果。从逻辑上讲，未标记的抗体dsv sc13533已经完全抑制了用抗体sc13533-d2获得的htrf信号。此外，抗体sc-56536和am05302pu-n已经完全抑制了用抗体sc13533-d2获得的htrf信号。由于抗体sc 13533不与抗体dsv36s和dsv38s竞争，以及抗体sc56536和am05302pu-n能够抑制用抗体sc13533-d2获得的htrf信号，因此抗体sc-56536和am05302pu-n也是抗体dsv 36s的非竞争性的抗体。
[0221]
总之，在图3和图4中所示的结果表明商业抗体sc-13533、sc-56536和am05302pu-n都是抗体dsv 36s的非竞争性抗体。因此，所有这些抗体都与抗体dsv 36s识别不同的表位。
[0222]
实施例4：未标记的抗体dsv3s、sc56536、am05302pu-n和sc 13533抑制抗体dsv3s-d2与g蛋白i1结合的能力
[0223]
实验操作方案
[0224]
所有试剂均在缓冲液trishcl 50mm ph 7.4、mgcl2 10mm、bsa 0.1％、nacl 10mm中稀释。将g蛋白αi1制备为2
×
，以获得2.5nm的孔中的终浓度。将核苷酸gtpgs制备为2
×
，以获得10μm的孔中的终浓度。这两种试剂制备在同一种溶液中，在室温下预温育30分钟，然后分配到孔中。将冷的抗体dsv3s、sc56536、am05302pu-n和sc13533制备为4
×
，使孔中的终浓度在0.03至300nm之间。将抗体dsv36s-d2制备为4
×
，终浓度为10nm。将抗twin-strep-tag-lumi4 tb抗体制备为4
×
，以获得0.25nm的孔中的终浓度。
[0225]
将试剂如下分配在384孔板中：
[0226]
1)将10μl的预温育的g蛋白αi1+gtpgs的混合物放入每孔中，
[0227]
2)将5μl的未标记的抗体dsv 3s或sc56536或sc13533或am05302pu-n加入到每孔中，
[0228]
3)将板在室温下温育30分钟，
[0229]
4)将5μl的抗twin-strep-tag-lumi4 tb抗体和5μl的抗体dsv 3s-d2加入到每孔中。
[0230]
在读取htrf信号之前，将板在室温下温育1小时。
[0231]
结果
[0232]
图5显示了获得的结果。从逻辑上讲，未标记的抗体dsv 3s完全抑制抗体dsv 3s-d2获得的htrf信号。此外，抗体sc-13533、sc-56536和am05302pu-n已经完全抑制抗体dsv 3s-d2获得的htrf信号。总之，这些结果与实施例3中所示的结果相结合表明商业抗体sc-13533、sc-56536和am05302pu-n都是抗体dsv 36s的非竞争性抗体。因此，这同样适用于实验室制造的抗体dsv 3s。因此，所有这些抗体都与抗体dsv 36s识别不同的表位。
[0233]
实施例5：未标记的抗体dsv36s、dsv38s、dsv3s、dsv26s和dsv39s抑制抗体dsv36s-d2与g蛋白αi1结合的能力
[0234]
实验操作方案
[0235]
所有试剂均在缓冲液trishcl 50mm ph 7.4、mgcl2 10mm、bsa 0.1％、nacl 10mm中稀释。将g蛋白αi1制备为2
×
，以获得2.5nm的孔中的终浓度。将核苷酸gtpgs制备为2
×
，以获得100μm的孔中的终浓度。这两种试剂制备在同一种溶液中，在室温下预温育30分钟，然后分配到孔中。将冷的抗体dsv36s、dsv38s、dsv26s、dsv3s和dsv39s制备为4
×
，使孔中的终浓度在0.001至1μm之间。将抗体dsv36s-d2制备为4
×
，终浓度为10nm。将抗twin-strep-tag-lumi4 tb抗体制备为4
×
，以获得0.25nm的孔中的终浓度。
[0236]
将试剂如下分配在384孔板中：
[0237]
1)将10μl的预温育的g蛋白αi1+gtpgs的混合物放入每孔中，
[0238]
2)将5μl的未标记的抗体dsv36s、dsv38s、dsv26s、dsv3s和dsv39s加入到每孔中，
[0239]
3)将板在室温下温育30分钟，
[0240]
4)将5μl的抗twin-strep-tag-lumi4 tb抗体和5μl的抗体dsv36s-d2加入到每孔中。
[0241]
在读取htrf信号之前，将板在室温下温育1小时。
[0242]
结果
[0243]
图6显示了用抗体dsv36s和dsv38s获得的结果。从逻辑上讲，未标记的抗体dsv36s已经完全抑制了抗体dsv36s-d2获得的htrf信号。抗体dsv38s也已经完全抑制了dsv36s-d2
产生的信号。这表明这两种抗体结合在g蛋白αi1的相同区域上。图7显示了用抗体dsv36s、dsv26s、dsv3s和dsv39s获得的结果。从逻辑上讲，未标记的抗体dsv36s已经完全抑制了抗体dsv36s-d2获得的htrf信号。相反，抗体dsv 26s、dsv 3s和dsv 39s不能抑制dsv 36s-d2产生的信号。这表明这三种抗体并不与抗体dsv 36s结合在人g蛋白αi1的相同区域。
[0244]
总之，只有抗体dsv38s与抗体dsv36s竞争性结合g蛋白αi，因此共享相同的表位。
[0245]
实施例6：当g蛋白α在hek293细胞中过表达时，抗体dsv36s、dsv38s和sc13533对不同类型的g蛋白α的选择性
[0246]
第1天：用编码不同蛋白gαi1、gαi2、gαi3、gαo、gαz、gαs、gαq、gα12和人gα13的质粒转染hek293细胞
[0247]
在optimem介质中制备含有100万个hek细胞/ml的溶液。在optimem介质中制备含有150ng/孔的质粒和0.375μl的脂质体的质粒/脂质体混合物，30分钟之后，将质粒/脂质体混合物添加到具有黑底孔的96孔板。
[0248]
将试剂分配在适于细胞培养的黑微孔板的每个孔中：
[0249]
1)将50μl/孔的聚鸟氨酸在室温下温育30分钟，然后通过抽吸从每个孔中抽出溶液。
[0250]
2)将50μl的hek293制备物(细胞密度为50000个细胞每孔)添加到每个孔中
[0251]
3)将50μl的编码g蛋白的质粒+脂质体的混合物添加到每个孔中。
[0252]
将微孔板在37℃和5％co2(调节炉(regulated stove))下温育24小时。
[0253]
第2天：用于测量抗体dsv36s、dsv38s和sc 13533的选择性的htrf测定
[0254]
所有试剂均稀释在缓冲液trishcl 50mm ph 7.4、mgcl2 10mm、bsa 0.1％、triton
×
100 0.02％中。将抗体dsv36s-d2、dsv38s-d2和sc13533-d2制备为4
×
，使孔中的终浓度为10nm。将抗twin-strep-tag-lumi4 tb抗体制备为4
×
，以获得0.5nm的孔中的终浓度。将核苷酸gdp和gtpgs制备为4
×
，以获得10μm的孔中的终浓度。
[0255]
将试剂如下分配在384孔板中：
[0256]
1)吸出optimem培养介质，
[0257]
2)将25μl的缓冲液、或gdp或gtp添加到每个孔中，
[0258]
3)将25μl的缓冲液添加到每个孔中，
[0259]
4)将25μl的抗体dsv36s-d2或dsv38s-d2或sc13533-d2或抗flag-d2添加到每个孔中，
[0260]
5)将5μl的抗twin-strep-tag-lumi4 tb抗体加入到每孔中。
[0261]
在读取htrf信号之前，将微孔板在室温下温育20小时。
[0262]
反应方案如图8a和图8b所示。
[0263]
结果
[0264]
图9和图10显示了在该实验中获得的结果。
[0265]
使用一对抗体抗twin-strep-tag-lumi4 tb/抗flag-d2抗体可以验证质粒编码的所有g蛋白α确实在hek293中过表达。事实上，用g蛋白α中的每一个获得的htrf信号远大于使用阴性条件(“模拟(mock)”)获得的htrf信号，阴性条件对应于用对照质粒(其不编码任何蛋白标签flag+twin-strep-tag)转染的hek293细胞。
[0266]
所有g蛋白α的过表达都已得到验证，然后可以通过测量在这些用d2标记的抗体
dsv36s、dsv38s和sc 13533与抗twin-strep-tag-lumi4 tb抗体之间可能的fret，以确定抗体dsv36s、dsv38s和sc 13533的选择谱。当蛋白gαi1、gαi2、gαi3、gαo和gαz过表达时，抗体dsv36s和dsv38s给出阳性htrf信号，但当蛋白gαs、gαq、gα12和gα13过表达时，抗体dsv36s和dsv38s不产生htrf信号。当蛋白gαi1和gαi3过表达时，抗体sc13533给出阳性htrf信号，但当蛋白gαi2、gαo、gαz、gαs、gαq、gα12和gα13过表达时，抗体sc13533不产生htrf信号。这些结果证实了抗体dsv36s和dsv38s识别g蛋白α上的相同表位(抗体dsv36s和dsv38s具有相同的选择谱以及具有竞争性)。该表位不同于抗体sc13533识别的表位，抗体sc13533识别较少数量的g蛋白α。
[0267]
实施例7：抗体dsv36s、dsv38s、dsv 26s、dsv 39s、dsv 3s和sc13533在与过表达rcpg的膜制备物中与荧光gtp类似物结合时产生tr-fret信号的能力
[0268]
所有试剂均稀释在缓冲液trishcl 50mm ph7.4、mgcl2 10mm、bsa 0.1％、nacl 300mm和0.5μm gdp中。将表达dor受体的hek293膜制备为4
×
，使孔中的终量为10μg。将抗体dsv36s-d2、dsv38s-d2、sc13533-d2和抗flag-d2制备为4
×
，使孔中的终浓度为10nm。将用铕穴状化合物标记的gtpgn-辛基-c2制备为4
×
，以获得6nm的孔中终浓度。gtpgo-接头-cy5制备为4
×
，以获得50nm的孔中的终浓度。将核苷酸gtpgs和gdp制备为4
×
，以获得100μm的孔中的终浓度。将snc 162制备为4
×
，以获得10μm的孔中的终浓度。
[0269]
将试剂如下分配在384孔板中：
[0270]
1)将5μl的dor膜加入到每孔中，
[0271]
2)将5μl的用铕穴状化合物标记的gtpgn-辛基-c2、或5μl的gtpgo-接头-cy5加入到每孔中，
[0272]
3)将5μl的用d2标记的抗体dsv36s、或dsv38s、或sc13533、或dsv 26s、或dsv3s、或dsv 39s，或用铽穴状化合物标记的dsv 36s或sc13533添加到每个孔中，
[0273]
4)将5μl的缓冲液或snc 162或gtpgs添加到每个孔中。
[0274]
在读取htrf信号之前，将板在室温下温育20小时。
[0275]
反应方案如图8a所示。
[0276]
结果
[0277]
图11显示了当类似物gtpgn-辛基-c2-铕穴状化合物与抗体dsv36s-d2、dsv38s-d2和sc13533-d2组合时获得的结果。条件“gtpgs”代表测定的非特异性信号(ns)，其中过量的未标记的gtpgs(100μm)抑制gtpgn-辛基-c2-铕穴状化合物与g蛋白α的结合，因此阻止了fret信号的出现。条件“缓冲液”表明在gtpgn-辛基-c2-铕穴状化合物与用d2标记的抗体dsv36s和dsv 38s之间可以获得中等但显著的fret信号。通过添加snc162(这会导致膜中过表达的dor受体活化)，观察到这种fret信号的增加，这与荧光gtp类似物对抗体dsv36s和dsv38s识别的蛋白gαi1、gαi2、gαi3、gαo和gαz中的部分或全部的结合增加有关。相反地，尽管抗体sc13533具有结合蛋白gαi1和gαi3(这些蛋白在hek293细胞中内源性表达[2])的能力，但当抗体sc13533与gtpgn-辛基-c2-铕穴状化合物组合时，无论snc162存在与否，都不能产生任何fret信号。
[0278]
同样，图12显示，在过表达未活化的rcpg的膜制备物中，将类似物gtpgn-辛基-c2-铕穴状化合物与抗体dsv36s-d2、dsv26s-d2、dsv39s-d2和dsv3s-d2组合时获得的结果。条件“非特异性信号”表明检测到荧光gtp类似物和用d2标记的抗体之间的弱的基线fret信
号。条件“阴性对照”代表测定的非特异性信号，其中过量的未标记的gtpgs(100μm)抑制了荧光gtp类似物与g蛋白α的结合，因此阻止了fret信号的出现。测量到的抑制是完全的，因为在“非特异性信号”和“阴性对照”条件下测量的htrf信号水平几乎相同。在添加荧光gtp类似物和抗体后，测量fret信号的增加，其关联于gtp的荧光类似物与抗体dsv36s识别的蛋白gαi1、gαi2、gαi3、gαo和gαz中的部分或全部的结合增加。相反，尽管抗体dsv 26s、dsv 3s和dsv 39s具有结合hek293细胞中g蛋白αi的能力[2]，但抗体dsv26s、dsv3s和dsv39s在与gtpgn-辛基-c2-铕穴状化合物组合时不产生任何fret信号。
[0279]
图13显示，在过表达未活化的rcpg的膜制备物中，将类似物gtpgo-接头-cy5与抗体dsv36s-tb和sc13533-tb组合时获得的结果。条件“非特异性信号”表明检测到的在gtp的荧光类似物和用铽穴状化合物标记的抗体之间的弱的基线fret信号。条件“阴性对照”代表测定的非特异性信号，其中过量的未标记的gtpgs(100μm)抑制了荧光gtp类似物与g蛋白α的结合，因此阻止了fret信号的出现。测量到的抑制是完全的，因为在“非特异性信号”和“阴性对照”条件下测量的htrf信号水平几乎相同。通过添加荧光gtp类似物和抗体，测量出fret信号的增加，其关联于荧光gtp类似物与抗体dsv36s识别的蛋白gαi1、gαi2、gαi3、gαo和gαz中的部分或全部的结合增加。相反地，尽管抗体sc-13533具有结合蛋白gαi1和gαi3(这些蛋白在hek293细胞中内源性表达[2])的能力，但当抗体sc-13533与gtpgo-接头-cy5(p)组合时，抗体sc-13533不产生任何fret信号。
[0280]
总之，这些结果证明只有根据本发明的抗体能够产生fret信号。
[0281]
实施例8：通过使用标记的根据本发明的抗体进行fret来测量rcpg的活化
[0282]
材料
[0283]
表达研究中的受体和g蛋白αi的细胞膜制备物购自perkin elmer或euroscreen。下表列出了使用的不同样品的基细胞(fond celluaire)和参考号：
[0284]
表2：
[0285] 基细胞供应商参考号δ阿片hek293perkin elmer6110549400uaδ阿片cho-k1euroscreen服务多巴胺d2scho-k1euroscreen服务
[0286]
使用与tr-fret检测兼容的荧光探针(对红接受体为d2或对供体为lumi4 tb)标记抗体dsv36s。
[0287]
核苷酸gtp、gdp和gtpγs购自sigma aldrich(各自的目录参考号分别为g8877、g7127和g8634)。
[0288]
δ阿片rcpg的激动剂(snc162)和多巴胺d2s的激动剂(ppht)和δ阿片rcpg的拮抗剂(naltrindole)购自tocris(各自的目录参考号为1529和0740)。
[0289]
384孔低容量板，白白底，购自greiner bio one(目录参考号784075)。
[0290]
用供体或接受体荧光团标记的不可水解/可缓慢水解的gtp类似物(gtpgn-c2；gtpgn-c3；gtpgn-辛基-c2；gtpgn-辛基-c11；gtpgn-辛基-c3；gtpgo-已基-c2；gtpgo-已基-c3；gtp-gn-辛基-硫代琥珀酰亚胺基-c2；gtpgn-辛基-cy5；gtpgn-辛基-af488)由cisbio bioassays合成。
[0291]
用接受体荧光团gtpgo-接头-cy5(p)和gtpgs-接头-cy5(r)标记的不可水解/可缓
慢水解的gtp类似物购自jena bioscience，参考号分别为nu-834-cy5和nu-1610-cy5。
[0292]
方法
[0293]
试剂的制备：
[0294]
所有试剂均稀释在缓冲液trishcl 50mm ph 7.4、mgcl2 10mm、bsa 0.1％、nacl 10mm或100mm或300mm或500mm(浓度在每个图的图例中指定)、0或0.5或1μm的gdp(浓度在每个图的图例中指定)。将膜制备为4
×
，以分配1μg或10μg/孔(量在每个图的图例中指定)。将核苷酸gtpgs制备为6.67
×
(条件：非特异性信号)以获得100μm的孔中的终浓度。将测试化合物(激动剂或拮抗剂)制备为10
×
，以获得图表中所示的孔中的终浓度。用于检测的抗gαi抗体制备为4
×
，用于以下的孔中的终浓度：抗体dsv36s-d2(10nm)；抗体dsv36s-lumi4 tb(0.5nm或1nm)；抗体dsv38s-d2(10nm)。将用供体或接受体荧光探针标记的不可水解/可缓慢水解的gtp类似物制备为4
×
，以获得每个图的图例中所述的孔中的终浓度。
[0295]
384孔板中试剂的分布：
[0296]
·
表达rcpg和g蛋白αi的膜：5μl
[0297]
·
缓冲液或核苷酸gtpgs(用于非特异性信号的条件)：3μl
[0298]
·
不可水解/可缓慢水解的gtp类似物
–
供体或接受体：5μl
[0299]
·
抗gαi抗体-供体或接受体：5μl
[0300]
·
缓冲液或测试化合物(激动剂和/或拮抗剂)：2μl。
[0301]
用含有过量gtpgs(100μm)的孔测量非特异性信号(荧光背景噪声)。
[0302]
读取htrf信号
[0303]
将板在21℃下温育20小时(除非图中另有说明)，然后在如以下配置在pherastar读取器(bmg labtech)上测量htrf信号：
[0304]
·
模块：htrf(激发337nm，发射665nm和620nm)
[0305]
·
激发：激光，闪烁40次或灯，闪烁100次
[0306]
·
读取窗口：延迟：60μs
–
整合：400μs。
[0307]
处理信号
[0308]
根据以下式，从在665nm(对于红接受体-cy5)或520nm(对于绿接受体-af488或荧光素)和620nm处的原始信号计算htrf比率：
[0309]
htrf比率＝665nm处的信号或520nm处的信号/620nm处的信号*10000。
[0310]
测定图式
[0311]
图14a图示使用供体ret配偶体标记的不可水解/可缓慢水解的gtp类似物和用接受体ret配偶体标记的抗g蛋白α抗体的测定原理，其中用激动剂化合物活化rcpg，这诱导供体gtp类似物与g蛋白结合的增加，因此增加了ret信号(图式2a)。
[0312]
图14b图示使用接受体ret配偶体标记的不可水解/可缓慢水解的gtp类似物和用供体ret配偶体标记的抗g蛋白α抗体的测定原理，其中用激动剂化合物活化rcpg，这诱导接受体gtp类似物与g蛋白结合的增加，因此增加了ret信号(图式2b)。
[0313]
根据图式2a的在δ阿片rcpg(dor)上的活化测定：在激动剂的刺激下，在供体gtp和接受体抗g蛋白αi抗体之间的tr-fret信号增加
[0314]
首先，使用表达δ阿片rcpg和g蛋白αi的cho-k1细胞膜制备物，证明了供体gtp/接受体抗gαi抗体对通过结合g蛋白产生特异性tr-fret信号的能力。使用以下实验条件：
[0315]-图15a：gtpgn-辛基-c2(在孔中的终浓度为6nm)；dsv36s-d2(在孔中的终浓度为10nm)；10μg的cho-dor膜/孔；缓冲液：trishcl 50mm ph7.4；mgcl2 10mm；nacl 500mm；bsa 0.1％。
[0316]-图16a：gtpgn-辛基-c2(在孔中的终浓度为6nm)；dsv36s-d2(在孔中的终浓度为10nm)；10μg的cho-dor膜/孔；缓冲液：trishcl 50mm ph7.4；mgcl2 10mm；nacl 300mm；gdp 0.5μm；bsa 0.1％。
[0317]-图17a：gtpgn-辛基-c2(在孔中的终浓度为6nm)；dsv38s-d2(在孔中的终浓度为10nm)；10μg的cho-dor膜/孔；缓冲液：trishcl 50mm ph7.4；mgcl2 10mm；nacl 300mm；gdp 0.5μm；bsa 0.1％。
[0318]-图18a：gtpgn-辛基-c11(在孔中的终浓度为6nm)；dsv36s-d2(在孔中的终浓度为10nm)；10μg的cho-dor膜/孔；缓冲液：trishcl 50mm ph7.4；mgcl2 10mm；nacl 300mm；gdp 0.5μm；bsa 0.1％。
[0319]-图19a：gtpgn-己基-c2(在孔中的终浓度为6nm)；dsv36s-d2(在孔中的终浓度为10nm)；10μg的cho-dor膜/孔；缓冲液：trishcl 50mm ph7.4；mgcl2 10mm；nacl 300mm；gdp 0.5μm；bsa 0.1％。
[0320]-图20a：gtpgn-c2(在孔中的终浓度为6nm)；dsv36s-d2(在孔中的终浓度为10nm)；10μg的cho膜-dor/孔；缓冲液：trishcl 50mm ph7.4；mgcl2 10mm；nacl 300mm；gdp 0.5μm；bsa 0.1％。
[0321]
在大量的过量的gtpgs(100μm)不存在或存在的情况下对膜进行温育。在这两种条件下观察到的tr-fret信号的差异(htrf比率)表示，与接受体抗gαi抗体一起，类似物gtpgn-辛基-c2、gtpgn-辛基-c11、gtpgo-己基-c2、gtpgn-c2能够与g蛋白αi结合，产生tr-fret信号(图16a至图20a)。
[0322]
其次，用与上述相同的膜和实验条件，测试rcpg的激动剂调节与供体gtp结合的g蛋白α的比例的能力。由激动剂刺激产生的tr-fret信号(htrf比率)增加，指示与供体gtp结合的g蛋白α形式的比例增加(即，空形式的g蛋白α减少)。因此，被rcpg的激动剂活化的rcpg受体导致供体gtp与g蛋白结合，然后g蛋白改变为供体gtp形式(qui passe alors sous forme gtp-donneur)，导致tr-fret信号增加。这些结果显示在图15b、图16b、图17b、图18b、图19b和图20b中。此外，图16b显示了第二种条件，其中随着rcpg拮抗剂(纳曲吲哚)的浓度增加，通过固定浓度的rcpg的激动剂snc162(200nm)的活化被抑制。从tr-fret信号(htrf比率)的降低中观察到对这种活化的抑制。
[0323]
根据图式2a对rcpg多巴胺d2s(d2s)进行活化测定：在激动剂的刺激下，供体gtp和接受体抗g蛋白αi抗体之间的tr-fret信号增加
[0324]
首先，使用表达rcpg多巴胺d2s和g蛋白αi的cho-k1细胞膜制备物，证明了供体gtp/接受体抗gαi抗体对通过结合g蛋白产生特异性tr-fret信号的能力。使用以下实验条件：
[0325]-图21a：gtpgn-辛基-c2(在孔中的终浓度为6nm)；dsv36s-d2(在孔中的终浓度为10nm)；10μg的cho-d2s膜/孔；缓冲液：trishcl 50mm ph7.4；mgcl2 10mm；nacl 10mm；gdp 1μm；bsa 0.1％。
[0326]-图22a：gtpgn-辛基-c2(在孔中的终浓度为6nm)；dsv36s-d2(在孔中的终浓度为
10nm)；10μg的cho-d2s膜/孔；缓冲液：trishcl 50mm ph7.4；mgcl2 10mm；nacl 100mm；bsa 0.1％。
[0327]-图23a：gtpgn-辛基-c2(在孔中最终为6nm)；dsv36s-d2(在孔中最终为10nm)；10μg的cho-d2s膜/孔；缓冲液：trishcl 50mm ph7.4；mgcl2 10mm；nacl 100mm；gdp 1μm；bsa 0.1％。
[0328]
在大量的过量的gtpgs(100μm)不存在或存在的情况下对膜进行温育。在这两种条件下观察到的tr-fret信号的差异(htrf比率)表示，类似物gtpgn-辛基-c2与接受体抗gαi抗体一起，能够与g蛋白αi结合，产生tr-fret信号(图21a至图23a)。
[0329]
其次，用与上述相同的膜和实验条件，测试rcpg的激动剂调节与供体gtp结合的g蛋白α的比例的能力。由激动剂刺激产生的tr-fret信号(htrf比率)增加，指示与供体gtp结合的g蛋白α形式的比例增加(即，g蛋白α的空形式减少)。因此，被rcpg的激动剂活化的rcpg受体导致供体gtp与g蛋白结合，然后g蛋白改变为供体gtp形式，导致tr-fret信号增加。这些结果显示在图21b、图22b和图23b中。
[0330]
根据图式2b的在δ阿片rcpg(dor)上的活化测定：在激动剂的刺激下，在gtp接受体和供体抗g蛋白αi抗体之间的tr-fret信号增加
[0331]
首先，使用表达δ阿片rcpg和g蛋白αi的cho-k1细胞膜制备物，证明了接受体gtp/供体抗gαi抗体对通过结合g蛋白产生特异性tr-fret信号的能力。使用以下实验条件：
[0332]-图24a：gtpgn-辛基-cy5(在孔中的终浓度为50nm)；dsv36s-lumi4tb(在孔中的终浓度为1nm)；10μg的cho-dor膜/孔；缓冲液：trishcl 50mm ph7.4；mgcl2 10mm；nacl 300mm；gdp 0.5μm；bsa 0.1％。在21℃温育3小时后读取。
[0333]-图25a：gtpgn-辛基-af488(在孔中的终浓度为50nm)；dsv36s-lumi4tb(在孔中的终浓度为1nm)；10μg的cho-dor膜/孔；缓冲液：trishcl 50mm ph7.4；mgcl2 10mm；nacl 300mm；gdp 0.5μm；bsa 0.1％。在21℃温育3小时后读取。
[0334]
在大量的过量的gtpgs(100μm)不存在或存在的情况下，对膜进行温育。在这两种条件下观察到的tr-fret信号的差异(htrf比率)表示，类似物gtpgn-辛基-cy5和gtpgn-辛基-af488与供体抗gαi抗体一起，能够与g蛋白αi结合，产生tr-fret信号(图24a至图25a)。
[0335]
其次，用与上述相同的膜和实验条件，测试rcpg的激动剂调节与接受体gtp结合的g蛋白α的比例的能力。由激动剂刺激产生的tr-fret信号(htrf比率)增加，指示与接受体gtp结合的g蛋白α形式的比例增加(即，空形式的g蛋白α减少)。因此，被rcpg的激动剂活化的rcpg受体导致接受体gtp与g蛋白结合，然后g蛋白改变为接受体gtp形式，导致tr-fret信号增加。这些结果显示在图24b和图25b。
[0336]
根据图式2a的在δ阿片rcpg(dor)上的活化测定：在激动剂的刺激下，在供体gtp和接受体抗g蛋白αi抗体之间的tr-fret信号增加
[0337]
首先，使用表达δ阿片rcpg和g蛋白αi的cho-k1细胞膜制备物，证明了供体gtp/接受体抗gαi抗体对通过结合g蛋白产生特异性tr-fret信号的能力。使用以下实验条件：
[0338]-图26a：gtp-gn-辛基-硫代琥珀酰亚胺基-c2(在孔中的终浓度为7.5nm)；dsv36s-d2(在孔中的终浓度为10nm)；10μg的cho-dor膜/孔；缓冲液：trishcl 50mm ph7.4；mgcl2 60mm；nacl 150mm；bsa 0.1％。
[0339]
在大量的过量的gtpgs(100μm)不存在或存在的情况下，对膜进行温育。在这两种ré
cepteur gabab.biologie cellulaire.universit
é
montpellier i,2006.
[0346]
[2]atwood等人bmc genomics,2011,12:14。

技术特征：

1.一种能够与g蛋白α结合的抗体或抗体片段，其包含：-重链可变结构域，其含有氨基酸序列seq id no：1的cdr1、氨基酸序列seq id no：2的cdr2和氨基酸序列seq id no：3的cdr3；和-轻链可变结构域，其含有氨基酸序列seq id no：4的cdr1、氨基酸序列dts的cdr2和由氨基酸序列seq id no：5组成的轻链可变结构域的cdr3。2.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其中：-重链可变结构域包含：与氨基酸序列seq id no：6具有至少80％同源性的fr1、与氨基酸序列seq id no：7具有至少80％同源性的fr2、与氨基酸序列seq id no：8具有至少80％同源性的fr3、与氨基酸序列seq id no：9具有至少80％同源性的fr4；和-轻链可变结构域包含：与氨基酸序列seq id no：10具有至少80％同源性的fr1、与氨基酸序列seq id no：11具有至少80％同源性的fr2、与氨基酸序列seq id no：12具有至少80％同源性的fr3、与氨基酸序列seq id no：13具有至少80％同源性的fr4。3.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体或抗体片段，其中：-重链可变结构域与氨基酸序列seq id no：14具有至少80％同源性；-轻链可变结构域与氨基酸序列seq id no：15具有至少80％同源性；和-重链可变结构域的cdr1由氨基酸序列seq id no：1组成、重链可变结构域的cdr2由氨基酸序列seq id no：2组成、重链可变结构域的cdr3由氨基酸序列seq id no：3组成、轻链可变结构域的cdr1由氨基酸序列seq id no：4组成、轻链可变结构域的cdr2由氨基酸序列dts组成以及轻链可变结构域的cdr3由氨基酸序列seq id no：5组成。4.根据权利要求1或权利要求3所述的抗体或抗体片段，其中所述重链可变结构域由氨基酸序列seq id no：14组成以及所述轻链可变结构域由氨基酸序列seq id no：15组成。5.一种抗体或抗体片段，其与权利要求1至权利要求4中任一项所述的抗体或抗体片段竞争性结合g蛋白α。6.根据权利要求1至权利要求5中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段用ret配偶体对的成员进行标记。7.根据权利要求6所述的抗体或抗体片段，其中所述ret配偶体对的成员是(i)荧光供体化合物或发光供体化合物，或(ii)荧光接受体化合物或非荧光接受体化合物(猝灭剂)。8.根据权利要求6或权利要求7所述的抗体或抗体片段，其中：-所述ret配偶体对的成员是荧光接受体化合物，其选自别藻蓝蛋白，罗丹明，花青素，方酸菁，香豆素，原黄素，吖啶，荧光素，硼-二吡咯亚甲基衍生物，硝基苯并噁二唑和量子点，gfp，选自gfp10、gfp2和egfp的gfp变体，yfp，选自eyfp、yfp topaz、yfp citrine、yfp venus和ypet的yfp变体，morange和dsred；或者-所述ret配偶体对的成员是荧光供体化合物，其选自：铕穴状化合物、铕螯合物、铽螯合物、铽穴状化合物、钌螯合物、量子点、别藻蓝蛋白、罗丹明、花青素、方酸菁、香豆素、原黄素、吖啶、荧光素、硼-二吡咯亚甲基衍生物和硝基苯并噁二唑；或者-所述ret配偶体对的成员是发光供体化合物，其选自：萤光素酶(luc)、海肾萤光素酶(rluc)、海肾萤光素酶的变体(rluc8)和萤火虫萤光素酶。9.一种组合物，其包含权利要求1至8中任一项所述的抗体或抗体片段。10.一种核酸序列，其编码权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗体片段。
11.一种载体，其包含权利要求10所述的核酸序列。12.一种细胞，其包含权利要求11所述的载体或权利要求10所述的核酸序列。13.一种试剂盒，其包含(i)权利要求1至8中任一项所述的抗体或抗体片段、或权利要求9所述的组合物和(ii)ret配偶体对的成员标记的gtp来源。14.根据权利要求13所述的试剂盒或根据权利要求9所述的组合物，其中所述gtp是不可水解或可缓慢水解的gtp，如gtpgammas(gtpγs或gtpgs)、gppnhp和gppcp。15.根据权利要求13或权利要求14所述的试剂盒、或根据权利要求9所述的组合物，其中所述标记的gtp是用以下标记的不可水解或可缓慢水解的gtp：-荧光供体化合物，例如选自gtpgn-c2(gtp-γ-n-c2)、gtpgn-c3(gtp-γ-n-c3)、gtpgn-辛基-c2(gtp-γ-n-辛基-c2)、gtpgn-辛基-c11(gtp-γ-n-辛基-c11)、gtpgn-辛基-c3(gtp-γ-n-辛基-c3)、gtpgo-已基-c2(gtp-γ-o-已基-c2)、gtpgo-已基-c3(gtp-γ-o-已基-c3)或gtp-gn-辛基-硫代琥珀酰亚胺基-c2(gtp-γ-n-辛基-硫代琥珀酰亚胺基-c2)，优选gtp-gn-辛基-硫代琥珀酰亚胺基-c2；或者-荧光接受体化合物，例如，选自gtpgn-辛基-cy5、gtpgn-辛基-af488、gtpgn-l15-荧光素、gtpgo-接头-cy5(p)或gtpgs-接头-cy5(r)，或非荧光接受体化合物(猝灭剂)。

技术总结

本发明涉及能够与G蛋白α结合的抗体或抗体片段、编码所述抗体的核酸序列、包含所述核酸序列的载体、包含所述载体或所述核酸序列的细胞以及试剂盒，其包含：i)所述抗体或抗体片段或所述组合物和(ii)用RET配偶体对的成员标记的GTP来源。记的GTP来源。

技术研发人员：

E

受保护的技术使用者：

CISBIO生物试验公司

技术研发日：

2021.01.29

技术公布日：

2022/11/25