实验器材:
紫外分光光度计、冷冻离心机、水浴锅、天平、100微升2支、10ml容量瓶、10 mL试管、具塞试管、5 mL一支、研钵 试剂:
(1)0.05mol·L-1磷酸缓冲液(PH7.0)。
pH 0.05mol/L NaH2PO4(ml) 0.05mol/L Na2HPO4(ml)
5.7 93.5 6.5
5.8 92.0 8.0
5.9 90.0 10.0
6.0 87.7 12.3
摄像考勤机6.1 85.0 15.0
6.2 81.5 18.5
6.3 77.5 22.5
6.4 73.5 26.5
6.5 68.5 31.5
6.6 62.5 37.5
6.7 56.5 43.5
6.8 51.0 49.0
6.9 45.0 55.0
7.0 39.0 61.0
7.1 33.0 67.0
7.2 28.0 72.0
7.3 23.0 67.0
7.4 19.0 81.0
7.5 16.0 84.0
7.6 13.0 87.0
7.7 10.5 89.5
7.8 8.5 91.5
7.9 7.0 93.0
8.0 5.3 94.7
(2)200 mmol·L-1H2O2溶液,30% H2O2 45.44 mL溶于磷酸缓冲液,定容至1 L。 (3)50 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液(PH7.0)(Tris三羟甲基氨基甲烷; 氨基丁三醇;缓血
酸胺,C4H11NO3):250ml 0.2mol/L的Tris(含三羟甲基氨基甲烷24.23g/L)+450mL 0.1mol/L的HCl(取83ml浓度为37.2%的盐酸定容至1L),加水稀释至1L。
步骤:
1、酶液提取:取0.5g新鲜植物样品,置于预冷研钵中,加2mL磷酸缓冲液及少量石英砂,在冰浴上研磨匀浆。
2、将研磨好的匀浆转移至10mL容量瓶中,用磷酸缓冲液冲洗研钵2-3次(每次1-2mL),转移至容量瓶,定容至10 mL。
3、取提取液5 mL于离心管中,在4℃、15000g下离心15min,上清液即为酶提取液,4℃下保存备用。
4、取5 mL具塞试管,加2 mL酶提取液于沸水中加热煮死,冷却备用。
5、取10 mL试管4支,3支为测定管,1支为对照管,按表加入试剂: 试剂 | 试管号 |
1 | 2 | 3 | 4 |
Tris-HCl | n2200机械曝气机1 | 1 | 1 | 1 |
酶提取液 | 0.1 | 0.1 甲胺基苯丙酮 | 0.1 | 0.1(煮死酶液) |
掘进机液压泵蒸馏水 | 1.7 | 1.7 | 1.7 | 1.7 |
| | | 无线公话 | |
6、将试管于25℃水浴中预热3分钟,逐管加入0.2 mL200mmol·L-1过氧化氢溶液,加完后立即在紫外分光光度计上测定A240,每隔30S读数一次,共3min,记录测定值。
7、计算,CAT活性(U·gFW·min-1)=