过氧化氢酶(CAT)测定

实验器材:
紫外分光光度计、冷冻离心机、水浴锅、天平、100微升2支、10ml容量瓶、10 mL试管、具塞试管、5 mL一支、研钵
试剂:
(1)0.05mol·L-1磷酸缓冲液(PH7.0)。
pH        0.05mol/L NaH2PO4(ml)      0.05mol/L Na2HPO4(ml)
5.7            93.5                      6.5
5.8            92.0                      8.0
5.9            90.0                      10.0
6.0            87.7                      12.3
摄像考勤机6.1            85.0                      15.0
6.2            81.5                      18.5
6.3            77.5                      22.5
6.4            73.5                      26.5
6.5            68.5                      31.5
6.6            62.5                      37.5
6.7            56.5                      43.5
6.8            51.0                      49.0
6.9            45.0                      55.0
7.0            39.0                      61.0
7.1            33.0                      67.0
7.2            28.0                      72.0
7.3            23.0                      67.0
7.4            19.0                      81.0
7.5            16.0                      84.0
7.6            13.0                      87.0
7.7            10.5                      89.5
7.8            8.5                      91.5
7.9            7.0                    93.0
8.0            5.3                      94.7
(2)200 mmol·L-1H2O2溶液,30% H2O2 45.44 mL溶于磷酸缓冲液,定容至1 L。
(3)50 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液(PH7.0)(Tris三羟甲基氨基甲烷; 氨基丁三醇;缓血
酸胺,C4H11NO3):250ml 0.2mol/L的Tris(含三羟甲基氨基甲烷24.23g/L)+450mL 0.1mol/L的HCl(取83ml浓度为37.2%的盐酸定容至1L),加水稀释至1L。
步骤:
1、酶液提取:取0.5g新鲜植物样品,置于预冷研钵中,加2mL磷酸缓冲液及少量石英砂,在冰浴上研磨匀浆。
2、将研磨好的匀浆转移至10mL容量瓶中,用磷酸缓冲液冲洗研钵2-3次(每次1-2mL),转移至容量瓶,定容至10 mL。
3、取提取液5 mL于离心管中,在4℃、15000g下离心15min,上清液即为酶提取液,4℃下保存备用。
4、取5 mL具塞试管,加2 mL酶提取液于沸水中加热煮死,冷却备用。
5、取10 mL试管4支,3支为测定管,1支为对照管,按表加入试剂:
无线公话
试剂
试管号
1
2
3
4
Tris-HCl
n2200机械曝气机1
1
1
1
酶提取液
0.1
0.1
甲胺基苯丙酮
0.1
0.1(煮死酶液)
掘进机液压泵蒸馏水
1.7
1.7
1.7
1.7
6、将试管于25℃水浴中预热3分钟,逐管加入0.2 mL200mmol·L-1过氧化氢溶液,加完后立即在紫外分光光度计上测定A240,每隔30S读数一次,共3min,记录测定值。
7、计算,CAT活性(U·gFW·min-1)=

本文发布于:2024-09-21 10:57:04,感谢您对本站的认可!

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