传染病信息２００８年第２１卷第３期
激发患者机体产生ＨＢＶ特异性细胞免疫，是慢性ＨＢＶ感染的关键［１］。病毒性载体是基因的主要工具，成为慢性乙型肝炎（乙肝）的研究 热点［２］。我们采用减毒的痘苗病毒安卡拉株（ＭＶＡ）作为基因载体［３］，构建了表达ＨＢＶ外膜中蛋白ｐｒｅＳ２Ｓ基因的重组假病毒颗粒，为其作为基因ＨＢＶ慢性感染打下了相关的实验基础。1 材料与方法
1.1材料
1.1.1试剂材料及实验动物ＨＢＶａｄｒ亚型ｐｒｅＳ２Ｓ基因重组质粒由本室赫兢构建，穿梭载体ｐＳＣ１１、减毒的痘苗病毒安卡拉株（ＭＶＡ）由吉林大学孔维惠赠，限制性内切酶ＳａｌＩ和ＮｏｔＩ、Ｔａｑ酶采用ＴＯＹＯＢＯ公司产品；Ｔ４－ＤＮＡ连接酶采用ｐｒｏｍｅｇａ公司产品；
转染试剂ＶｉｇｏＦｅｃｔ采用威格拉斯公司产品；鼠抗ＨＢｓＡｇ多克隆抗体、ＨＲＰ标记羊抗鼠ＩｇＧ单克隆抗体采用中杉金桥公司产品；预染蛋白Ｍａｒｋｅｒ采用ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ生物公司产品；ＥＣＬ化学发光检测试剂盒采用Ｐｉｅｒｃｅ公司产品；９日龄ＳＰＦ鸡胚购自北京实验动物研究
中心。
1.1.2引物ｐｒｅＳ２Ｓ基因扩增引物１：
ＡＡＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡＴＴ，引物２：ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＡＴＧＴＡＴＡＣＣＣＡＡＡＧＡＣＡＡＡＡＡ；重组ＭＶＡ－ｐｒｅＳ２Ｓ单克隆鉴定引物３：ＣＧＧＣＧＧＡＣＡＴＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＴ，引物４：ＴＣＴＣＧＧＴＴＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡＡＴＣ。引物由奥科生物公司合成，构建后质粒核苷酸序列测定由华大中生技术公司完成。1.2方法 1.2.1穿梭质粒ｐＳＣ１１－ｐｒｅＳ２Ｓ的制备
1.2.1.1Ｔ－ｐｒｅＳ２Ｓ克隆载体的获得以含ＨＢＶａｄｒ亚型ｐｒｅＳ２Ｓ基因的重组质粒为模板，以引物１
·论著·
表达ＨＢＶｐｒｅＳ２Ｓ基因重组ＭＶＡ假病毒颗粒的构建及抗原性鉴定*
栾翔凌
刘素君①
胡
燕②
侯
俊②
沈宏辉②
王志杰②
辛绍杰②
貌盼勇②
解放军军医进修学院
北京
１００８５３
①北京朝阳医院京西院区北京１０００４３②解放军第三○二医院北京１０００３９
不倒翁玩具
摘
要
目的
构建携带ＨＢＶｐｒｅＳ２Ｓ基因的重组ＭＶＡ假病毒颗粒，评价其抗原性。方法将ＨＢＶｐｒｅＳ２Ｓ基因通过基
因重组构建入穿梭载体ｐＳＣ１１，得到质粒ｐＳＣ１１－ｐｒｅＳ２Ｓ，将此质粒转染ＭＶＡ病毒通过同源重组得到ＭＶＡ－ｐｒｅＳ２Ｓ，通过免疫印迹法鉴定其抗原性。结果利用基因测序，ＰＣＲ鉴定证实所得假病毒颗粒可以表达ＨＢＶｐｒｅＳ２Ｓ基因，并且具有良好的抗原性，经过９次传代得到单克隆重组病毒。结论本试验成功地构建了表达ＨＢＶｐｒｅＳ２Ｓ基因的重组ＭＶＡ假病毒颗粒ＭＶＡ－ｐｒｅＳ２Ｓ，为基因ＨＢＶ慢性感染做了一项实验性奠基工作。
关键词痘苗病毒；ＨＢＶ；基因中图分类号：Ｒ５１２．６２文献标识码：Ａ文章编号：１００７－８１３４（２００８）０３－０１５５－０３
Construction and antigenicity identification of recombinant modified vaccinia virus Ankara(MVA)pseudovirus particle expressing HBV preS2S gene
Luan Xiangling ，Liu Sujun ①，Hu Yan ②，et al.
PLA Postgraduate Medical School ，Beijing 100853，China ①Beijing Chaoyang Hospital Jingxi District ，Beijing 100043，China
②302Hospital of PLA ，Beijing 100039，China
Abstract Objective ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＭＶＡｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓｐａｒｔｉｃｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＨＢＶｐｒｅＳ２Ｓｇｅｎｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｉｔｓａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ．Methods ＨＢＶｐｒｅＳ２ＳｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅｓｈｕｔｔｌｅｖｅｃｔｏｒｐＳＣ１１．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｅｄｐｌａｓｍｉｄｐＳＣ１１－ｐｒｅＳ２ＳｗａｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＭＶＡ，ａｎｄｔｈｅａｎｔｉｇｅｎｃｉｔｙｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅｄｖｉｒｕｓｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈｒｏｕｇｈｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎ．Results ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓｐａｒｔｉｃｌｅｗａｓｖｅｒｉｆｉｅｄｔｏｅｘｐｒｅｓｓＨＢＶｐｒｅＳ２ＳｇｅｎｅｂｙｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄＰＣＲ，ａｎｄｗａｓｏｆｇｏｏｄａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｗｉｔｈ９
ｐａｓｓａｇｅｓ，ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｉｒｕｓｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ．Conclusion ＴｈｅｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓｐａｒｔｉｃｌｅＭＶＡ－ｐｒｅＳ２ＳｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＨＢＶｐｒｅＳ２Ｓｇｅｎｅｈａｓｂｅｅｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．ＩｔｐｒｏｖｉｄｅｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｂａｓｉｓｆｏｒｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｏｆｃｈｒｏｎｉｃＨＢＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．
Key words ｖａｃｃｉｎｉａｖｉｒｕｓ；
集飞行器ＨＢＶ；ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ通讯作者：貌盼勇，６６９３３３１６，ｍａｏｐｙ３０２＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
辛绍杰，６６９３３４２３，ｘｓｊ３０２＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
MKD-S78＊
基金项目：解放军第三○二医院院长创新基金资助项目
（２００４００１）
１５５··
ＩｎｆｅｃｔＤｉｓＩｎｆｏ，２００８，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．３
连续铸造机５０００ｂｐ
３０００ｂｐ２０００ｂｐ１０００ｂｐ７００ｂｐ５００ｂｐ３００ｂｐ２００ｂｐ
１
１：ｐＳＣ１１－ｐｒｅＳ２Ｓ经ＳａｌＩ和ＮｏｔＩ双酶切；２：相对ＤＮＡ分子量标准
图1重组质粒ｐＳＣ１１－ｐｒｅＳ２Ｓ的双酶切鉴定
和引物２用ＰＣＲ法扩增ｐｒｅＳ２Ｓ基因片段。将所得ｐｒｅＳ２Ｓ片段与克隆载体ｐｅａｓｙ－Ｔ连接，转化感受态细胞ＤＨ５а，经ＩＰＴＧ诱导，在含有５－溴－４－氯－３－吲哚－α－Ｄ－半乳糖苷（Ｘ－Ｇａｌ）的琼脂平板上通过蓝白斑筛选挑选白克隆［４］，得到重组克隆Ｔ－ｐｒｅＳ２Ｓ，经测序鉴定。
1.2.1.2ｐＳＣ１１－ｐｒｅＳ２Ｓ重组质粒的构建将所得Ｔ－ｐｒｅＳ２Ｓ质粒和ｐＳＣ１１质粒经限制性内切酶ＳａｌＩ和ＮｏｔＩ消化，电泳后回收目的片段，经Ｔ４－ＤＮＡ连接酶１６℃连接过夜，将连接产物转化感受态细胞ＤＨ５а，涂布于含有６０μｇ／ｍｌ氨苄青霉素和４０ｎｇ／ｍｌＸ
－Ｇａｌ的琼脂平板，加入ＩＰＴＧ诱导后，通过蓝白斑筛选挑选蓝克隆ｐＳＣ１１－ｐｒｅＳ２Ｓ，提取质粒，经限制性内切酶ＳａｌＩ和ＮｏｔＩ双酶切鉴定。1.2.2重组病毒的构建和鉴定
1.2.2.1鸡胚成纤维细胞
（ＣＥＦ）的制备９日龄ＳＰＦ鸡胚在苯扎溴铵溶液中浸泡３０ｍｉｎ，无菌操作取出鸡胚，剪碎，胰酶消化获得单个细胞悬液；细胞计数板计数，分装于５ｍｌ培养瓶，每瓶２×１０７细胞。1.2.2.2重组ＭＶＡ病毒的构建、筛选取ＭＶＡ病毒感染生长单层的ＣＥＦ，１ｈ后弃去培养液，换入新鲜培养基，加入ｐＳＣ１１－ｐｒｅＳ２Ｓ和转染试剂，培养４８ｈ后，收集细胞，反复冻融，破碎细胞，１０００ｒ／ｍｉｎ、１０ｍｉｎ离心，留取上清。将上清作系列稀释，吸取５μｌ，感染培养２４ｈ已经铺满的ＣＥＦ，在培养基中加入Ｘ－Ｇａｌ，培养７２ｈ后挑取蓝细胞落。反复传代９代，挑选稀释度高、染度好的细胞落，反复冻融，离心，取上清作为种毒，－７０℃冻存。
1.2.2.3重组病毒的ＰＣＲ鉴定取种毒５μｌ感染ＣＥＦ，培养７２ｈ后，收集细胞，反复冻融，离心取上清，以病毒悬液为模板，引物１、２进行ＰＣＲ反应。1.2.2.4重组病毒单克隆鉴定取种毒１μｌ为模板，引物３、４进行ＰＣＲ反应。
1.2.2.5免疫印迹检测蛋白表达取培养瓶中细胞冻融上清液２０μｌ进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，电泳后置于半干转移系统２５ｍＡ转移２ｈ，将硝酸纤维素膜经过１０％胎牛血清封闭后，洗液漂洗，将
硝酸纤维素膜置于鼠抗ＨＢｓＡｇ多抗（１︰１００稀释）１０ｍｌ中，４℃孵育过夜，洗液漂洗，将膜置于ＨＲＰ标记羊抗鼠ＩｇＧ二抗（１︰２０００稀释）３７℃孵育２ｈ，ＰＢＳＴ漂洗，按照ＥＣＬ试剂盒说明操作，将膜上液体滴尽，置于塑料膜内，混合０．５ｍｌＰｉｃｏＬｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ液及０．５ｍｌ过氧化氢，滴加于膜上，室温放置５ｍｉｎ，将膜上液体滴
尽，保持湿润放入塑料袋中，Ｘ线片曝光４ｍｉｎ。1.2.2.6重组病毒的初步纯化定量蔗糖梯密度离
心纯化重组病毒。取纯化产物进行倍比稀释，感染ＣＥＦ细胞２ｈ后铺琼脂平板，通过Ｘ－Ｇａｌ染。显微镜下对蓝落进行计数，根据最少的稀释度定量纯化产物。2结
果
2.1Ｔ－ｐｒｅＳ２Ｓ克隆载体的获得１％琼脂糖凝胶电泳鉴定，约８４０ｂｐ的片段被插入ｐｅａｓｙ－Ｔ载体，经测序鉴定，序列正确，命名为Ｔ－ｐｒｅＳ２Ｓ。2.2ｐＳＣ１１－ｐｒｅＳ２Ｓ重组质粒的构建及鉴定重组质粒经特异引物ＰＣＲ鉴定，１％琼脂糖凝胶电泳显示，得到约８４０ｂｐ的片段，表明质粒构建成功，命名为ｐＳＣ１１－ｐｒｅＳ２Ｓ（图１）。
2.3ＭＶＡ－ｐｒｅＳ２Ｓ的构建和筛选ｐＳＣ１１携带ＬａｃＺ基因，穿梭质粒ｐＳＣ１１－ｐｒｅＳ２Ｓ转染ＭＶＡ病毒后，发生同源重组，感染重组病毒的ＣＥＦ在含有Ｘ－Ｇａｌ的培养基中显现为蓝绿（图２）。
１：ＣＥＦ阴性对照在含有Ｘ－Ｇａｌ的培养基中；
２：感染ＭＶＡ－ｐｒｅＳ２Ｓ的ＣＥＦ在含有Ｘ－Ｇａｌ的培养基中
图2
感染ＭＶＡ－ＥＣ的ＣＥＦ在含有Ｘ－Ｇａｌ的培养基中（４００×）
１
２
２
１５６··
传染病信息２００８年第２１卷第３期
2.4重组病毒ＭＶＡ－ｐｒｅＳ２Ｓ的ＰＣＲ鉴定以重组病毒ＭＶＡ－ｐｒｅＳ２Ｓ悬液为模板，引物１、２进行ＰＣＲ反应，扩增得到约８４０ｂｐ的条带，初步证实重组病毒正确的携带ｐｒｅＳ２Ｓ基因（图３）。
2.5重组病毒单克隆鉴定用ｐＳＣ１１－ｐｒｅＳ２Ｓ转染ＭＶＡ，经过９次传代获得的重组病毒在传代过程中逐渐占多数，形成单克隆，不含有空ＭＶＡ病毒，用引物３、
４无法扩增出片断，而ＭＶＡ病毒悬液可扩增出约５５０ｂｐ大小片断（图３）。2.6免疫印迹鉴定蛋白表达免疫印迹法检测ＣＥＦ细胞裂解液，ＭＶＡ－ｐｒｅＳ２Ｓ转染组可见阳性条带，条带位于３１ｋＤ左右分子量Ｍａｒｋｅｒ位置（图４）。
2.7重组病毒定量通过Ｘ－Ｇａｌ染计数，
重组病毒的滴度为１．２×１０９ｐｆｕ／ｍｌ。3
讨
论
痘苗病毒作为基因的载体具有以下优势：①属于非复制型病毒，仅在鸡胚成纤维细胞及地鼠
肾细胞中繁殖，在人体内不可复制，具有很高的安全
性；②痘病毒作为最大、
最复杂的一类病毒，具有大型的复杂结构，包含大量多肽和酶，具有良好的免疫原性，载体本身具有佐剂的功能；③通过皮肤划痕即可接种，具有很高的感染效率；④外源基因容量大，
能够同时容纳、
表达多个外源基因［５］。因此，有可能为乙肝的基因提供了一个潜在的工具。
德国的一项试验显示，ＡＩＤＳ患者在接受高效抗逆转录病毒之前接种ＭＶＡ假病毒颗粒，除了接种局部反应外，没有其他不良反应，所有患者的
ＣＤ４＋、
ＣＤ８＋细胞均增加，病毒载量下降，证明ＭＶＡ重组病毒对于免疫缺陷的患者是安全并且有效的。由于假病毒颗粒在人体不能复制，激发免疫反应后
可被清除，不存在致癌、
整合入基因组或者感染其他未接种者的潜在危险［６－７］。
本研究将ＨＢＶｐｒｅＳ２Ｓ基因构建入ＭＶＡ，得到重组假病毒颗粒。经过ＰＣＲ证实重组假病毒
基因组中携带ｐｒｅＳ２Ｓ的基因片段，并且该基因正确的整合入病毒的编码区，重组病毒颗粒可以编码ｐｒｅＳ２Ｓ蛋白，并能够被抗ＨＢｓＡｂ识别，具有良好的抗原性，为进一步研究假病毒颗粒作为ＨＢＶ基因的载体，IKRTV
单独或者与药物、
ＤＮＡ疫苗等手段协同乙肝慢性感染做了一定的基础工作。
参
考
文献
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ＨｅｂｂｅｎＭ，ＢｒａｎｔｓＪ，ＢｉｒｃｋＣ．Ｈｉｇｈｌｅｖｅｌｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇａｓａｆｅｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒ：ｍｏｄｉｆｉｅｄｖａｃｃｉｎｉａｖｉｒｕｓＡｎｋａｒａ［Ｊ］．ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒＰｕｒｉｆ，２００７，５６（２）：２６９－２７８．
（２００８－０１－２８收稿２００８－０２－２８修回）
１：引物１、
２扩增ＭＶＡ－ｐｒｅＳ２Ｓ；２：引物１、２扩增ＭＶＡ；３：引物３、
４扩增ＭＶＡ－ｐｒｅＳ２Ｓ；４：引物３、４扩增ＭＶＡ；５：相对分子量标准
图3重组病毒ＰＣＲ鉴定
１：感染ＭＶＡ的ＣＥＦ细胞裂解产物；
智能巡检终端
２：感染ＭＶＡ－ｐｒｅＳ２Ｓ的ＣＥＦ裂解产物
图4免疫印迹鉴定重组病毒ＭＶＡ－ｐｒｅＳ２Ｓ
５０００ｂｐ
３０００ｂｐ２０００ｂｐ１０００ｂｐ７００ｂｐ５００ｂｐ３００ｂｐ２００ｂｐ
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