2021年4月
第31卷㊀第4期
中国比较医学杂志
CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVE MEDICINE
April,2021
去皮刀片
Vol.31㊀No.4
姬桂青，邱天，景瑾，等.B6-Co 小鼠眼睑成纤维细胞生长曲线及HSP70表达研究[J].中国比较医学杂志,2021,31(4):99-106. Ji GQ,Qiu T,Jing J,et al.Growth curve and HSP70expression of eyelid fibroblasts in B6-Co mice [J].Chin J Comp Med,2021,31(4):99-106.
doi:10.3969/j.issn.1671-7856.2021.04.015[作者简介]姬桂青(1994 )，女，在读硕士研究生，研究方向：人类疾病动物模型㊂E-mail:1337729738@qq
[通信作者]邵义祥(1956 )，男，博士，教授，研究方向：实验动物培育与应用，人类疾病动物模型㊂E-mail:shaoyx@ntu.edu
B6-Co 小鼠眼睑成纤维细胞生长曲线及HSP70
表达研究
姬桂青1,3，邱㊀天2，景㊀瑾3，朱顺星3，邵义祥3∗
(1.南通大学神经再生重点实验室，江苏南通㊀226001;2.华东师范大学第二附属中学，上海㊀201203;
3.南通大学比较医学研究所，江苏南通㊀226001)
㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀探索B6-Co 小鼠与正常C57BL /6小鼠眼睑成纤维细胞增殖能力与HSP70蛋白表达的差异㊂
方法㊀C57BL /6(B6)小鼠按雌雄小鼠2ʒ1的比例配种获取孕鼠;B6-Co 小鼠按B6(雄)ˑB6-Co(雌)=1ʒ2或B6(雌)ˑB6-Co(雄)=2ʒ1比例配种获得孕鼠，取18.5d 的孕鼠腹中胚胎，再取胚胎眼睑组织培养小鼠眼睑成纤维细胞；用
免疫荧光㊁HE 染鉴定原代细胞㊁观察成纤维细胞形态㊂根据血球计数板直接计数法观察两种细胞生长曲线的差异，用Real-time PCR 和Western blot 检测两种细胞中HSP70的表达量㊂体外构建HSP70基因siRNA 干扰载体,Lipofectamin2000转染B6小鼠眼睑成纤维细胞;Real-time PCR 和Western blot 实验从mRNA 和蛋白水平分别检测HSP70的相对表达量，测定其干扰效率;Transwell 实验检测B6小鼠眼睑成纤维细胞的迁移能力㊂结果㊀小鼠眼睑成纤维细胞生长曲线结果表明,B6-Co 小鼠眼睑成纤维细胞增殖速度慢于B6小鼠眼睑成纤维细胞(P <0.01)㊂B6-Co 小鼠成纤维细胞中HSP70表达量远远低于B6小鼠成纤维细胞，具有显著性差异㊂B6小鼠眼睑成纤维细胞转染HSP70siRNA 干扰载体后,siRNA-HSP70-3干扰效率最强,mRNA 和蛋白水平均被有效抑制，干扰效率高达70%(P <0.05);siRNA-HSP70组在迁移能力上亦显著低于对照组(P <0.05)㊂结论㊀HSP70基因及蛋白表达下调影响B6-Co 的成纤维细胞生长曲线，构建的siRNA-HSP70-3干扰载体能够有效抑制B6小鼠眼睑成纤维细胞中HSP70基因的表达，并显著抑制细胞迁移㊂HSP70可能参与成纤维细胞胚胎期发育的调控，是造成其EOB 表型的重要原因之一㊂
ʌ关键词ɔ㊀眼睑成纤维细胞;HSP70;C57BL /6;B6-Co；迁移
ʌ中图分类号ɔR-33㊀㊀ʌ文献标识码ɔA㊀㊀ʌ文章编号ɔ1671-7856(2021)04-0099-08
Growth curve and HSP 70expression of eyelid fibroblasts in B 6-Co mice
JI Guiqing 1,3,QIU Tian 2,JING Jin 3,ZHU Shunxing 3,SHAO Yixiang 3∗
(1.Key Laboratory of Nerve Regeneration,Nantong University,Nantong 226001,China.镁合金微弧氧化加工
2.NO.2High School of East China Normal University,Shanghai 20120
3.3.Institute of Comparative Medicine,Nantong University,Nantong 226001)
㊀㊀ʌAbstract ɔ㊀
Objective ㊀To examine the mechanism of the eye-open at birth (EOB)phenotype in B6-Co mice at birth.Methods ㊀C57BL /6(B6)mice were bred at a ratio of male to female mice of 2ʒ1to obtain pregnant mice.B6-Co
mice were bred by B6(male)mice with B6-Co(female)mice at a ratio of1ʒ2or B6(female)mice with B6-Co(male) mice at a ratio of2ʒ1hybridization to obtain pregnant mice.We selected18.5-day embryos of pregnant mice and then collected embryonic eyelid tissue to culture mouse eyelid fibroblasts.We used immunofluorescence and hematoxylin and eosin staining to identify primary cells and observe morphology of fibroblasts.The difference in growth curves between two cell types was observed using the direct counting method with a hemocytometer.Real-time PCR and Western
blot were used to detect HSP70expression in the two cell types.Lipofectamin2000was used to transfect the fibroblasts.The HSP70gene mRNA and protein expression levels were detected by Real-Time PCR and Western blot to determine the interference efficiency.The migration ability of fibroblasts was detected by Transwell experiment.Results㊀The growth curve of eyelid fibroblasts showed that B6-Co mouse eyelid fibroblasts proliferated more slowly than B6mouse eyelid fibroblasts(P< 0.01).However,HSP70expression levels in B6-Co mouse fibroblasts were significantly lower than those in B6mouse fibroblasts.After the fibroblasts were transfected with HSP70siRNA interference vector,the expression levels of HSP70 gene on mRNA and protein were effectively inhibited.Among them,siRNA-HSP70-3has the strongest interference efficiency,and the interference efficiency was up to70%(P<0.05).The migration abilities of fibroblasts in the siRNA-HSP70group were significantly lower(P<0.05)than those in the siRNA-NC group.Conclusions㊀Downregulation of HSP70gene and protein expression affects the growth curve of fibroblasts in B6-Co mice and may be involved in regulation of embryonic development of fibroblasts.The constructed siRNA-HSP70-3interference vector can effectively inhibit the expression of target gene HSP70on fibroblasts,and can significantly inhibit the cell migration.This could be one of the important reasons for the EOB phenotype of B6-Co mice.
ʌKeywordsɔ㊀eyelid fibroblasts;HSP70;C57BL/6;B6-Co;migration
㊀㊀先天性的角膜混浊(congenital corneal opacities, CCO)在新生儿中患病率只有1.4ɢ，虽然罕见但患病严重易致盲，如不能得到诊治，将会导致弱视，影响新生儿的视觉发育，或者波及其全身发育(引发生长迟缓等)[1]㊂因此能够及早发现并CCO，具有重要意义㊂一般研究认为常见的CCO病因主要有两种：一是外胚叶发育障碍性的角膜混浊，由于外胚叶的晶状体和囊泡不能正常地分离外胚叶；二是炎症引起角膜混浊(母体内血液或羊水感染)[2]㊂前一种发育障碍主要是常染体显性遗传因素导致，但深入机制尚不明确，这与先天性眼睑闭合不全(eyelid open at birth,EOB)模型鼠[3]的现象极为相似㊂
EOB小鼠在出生时眼睑开放，这种异常现象可能是导致后代小鼠眼部疾患的重要原因[4]㊂有研究发现通过ENU诱变建立的B6-Co突变系小鼠即具有EOB特征[5-7]㊂两种小鼠角膜组织全蛋白二维凝胶电泳结果显示，相比C57BL/6小鼠(以下简称:B6小鼠),B6-Co小鼠电泳结果发现蛋白质点显著上调的有6个，显著下调的蛋白质点有13个，其中HSP70下调最为显著[8]㊂热休克蛋白70 (HSP70)是热休克蛋白家族中被研究最多的一种，尤其是对HSP70家族的结构㊁功能以及表达调控机理的研究较多[9-10],HSP70在细胞的周期调控[11]㊁胚胎发育[12-14]㊁衰老中具有重要的生物学功能[15]㊂而前期实验[8]检测两种老鼠眼睑组织内HSP70蛋白表达差异性显著，所以HSP70与B6-Co小鼠EOB 表型出现可能存在联系㊂
因此，本实验选取从突变系B6-Co小鼠和正常B6小鼠(取18.5d孕鼠腹中胚胎)中取材培养的成纤维细胞[
16-20]，验证HSP70在两种细胞中的含量是否存在差异，通过小干扰敲低B6成纤维细胞HSP70表达，检测其迁移能力变化㊂为体外验证HSP70的表达能否调控两种细胞的生物学行为提供前期基础㊂
1㊀材料和方法
1.1㊀实验动物
㊀实验所用SPF级C57BL/6小鼠雌鼠20只㊁雄鼠10只(18~22g，误差小于10%)以及其突变系B6-Co小鼠(SPF级,18~22g误差小于10%)雌鼠10只㊁雄鼠5只，选用小鼠均为8周龄，均由南通大学实验动物中心提供[SCXK(苏)2019-0001]㊂前期实验取材于南通大学实验动物中心[SYXK(苏) 2017-0045]完成㊂实验鼠饲养于SPF级屏障动物房内，室内温度(21ʃ1)ħ，相对湿度(55ʃ5)%，自由采食和自由饮水，昼夜明暗交替时间12h/12 h，定期更换笼具㊁垫料，实验过程中所有操作符合实验动物福利要求，获得南通大学实验动物伦理委员会批准(IACUC:20180808-001)㊂B6雄性与B6
雌性小鼠以1ʒ2比例配对，共5笼;B6-Co 雄性小鼠与B6雌性或B6雄性与B6-Co 雌性小鼠以1ʒ2比例配对，共5笼㊂每天早上8点前检栓，见栓当日胚龄记为0.5d㊂
1.2㊀主要试剂与仪器CO 2细胞培养箱(Thermo)；倒置相差显微镜
(Leica);Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit
(Roche,REF************);0.25%胰蛋白酶(含EDTA)(Hyclone)㊁总RNA 提取试剂(TRIzol)(生工,Lot:FB06KB3578);SDS -PAGE Preparation kit 凝胶试剂盒(生工,C631100-0200);GAPDH 一抗(Abcam,ab9485);HSP70一抗(Abcam,ab2787);
lysis buffer (生工,G301DB0009)；胎牛血清,FBS (Gibico，美国);DMEM 高糖培养基(Gibico，美国)表1㊀根据HSP70基因设计siRNA 序列
Table 1㊀Design siRNA sequence based on HSP70gene
基因Gene
正义链Sense
反义链Antisense
阴性对照Negative control 5 -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 5 -ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3 小干扰RNA-HSP70-1siRNA-HSP70-15 -GAAGACAUAUAGUCUAGCUTT-3 5 -AGCUAGACUAUAUGUCUUCTT-3 小干扰RNA-HSP70-2siRNA-HSP70-25 -CGAUUACUGUCAAGGUUAUTT-3 5 -AUAACCUUGACAGUAAUCGTT-3 小干扰RNA-HSP70-3siRNA-HSP70-3
d4035 -CCUUCCUGCAUACAUGUCUTT-3
5 -AGACAUGUAUGCAGGAAGGTT-3
1.3㊀实验方法
1.3.1㊀分离和培养小鼠眼睑成纤维细胞
取妊娠期18.5d 的孕鼠麻醉消毒，剖腹取胎鼠
(观察B6-Co 胎鼠的眼睑部开闭，眼睑开启则为EOB 表型小鼠，眼睑关闭则舍弃,B6孕鼠腹中胎鼠则全部可用)的眼睑组织剪碎，胰酶消化,100目㊁40目网筛梯度过滤，离心，完全培养基重悬，放于
37ħ㊁5%CO 2培养箱中培养;24h 后换新鲜完全培养基㊂细胞按照1ʒ3传代，传代3次以上待用㊂1.3.2㊀小鼠眼睑成纤维细胞的观察㊀
将细胞传代培养到第3代时，将细胞接种于圆
玻片上，进行细胞爬片；待细胞密度约80%，弃去培养基,PBS 洗涤,70%乙醇固定过夜,PBS 轻洗细胞；苏木素染20min，自来水清洗㊂伊红染2s，自来水清洗㊂乙醇梯度脱水透明，滴加中性树胶盖玻片，拍照㊂
原材料检测
1.3.3㊀小鼠眼睑成纤维细胞的鉴定㊀将细胞传代培养到第3代时，将细胞接种于圆
玻片上，进行细胞爬片；待细胞密度约80%，弃去培养基,PBS 洗涤细胞，进行固定㊁通透㊁封闭等常规细胞免疫荧光染步骤，在荧光显微镜下观察拍照㊂
1.3.4㊀检测小鼠眼睑成纤维细胞的生长曲线㊀取对数生长期细胞，每孔种2ˑ104个细胞㊂将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养过夜，每组设3个复孔取均值，实验重复3次㊂在培养1d㊁2d㊁3d㊁4d㊁5d㊁6d 和7d 后直接血球计数板进行细胞计数㊂
1.3.5㊀两种成纤维细胞内HSP70mRNA 含量检测
从18.5d 的孕鼠体内获取B6-Co 和B6胎鼠，从
其眼睑部位取材培养成纤维细胞待其传代3次之后种六孔板，重复3次㊂通过常规方法提取RNA㊁逆转录和Real-time PCR(目的基因以内参基因的GAPDH 进行校正，每个样本3次重复㊂根据HSP70基因mRNA 设计RT-PCR 反应引物:GAPDH:Primer-F:5 -GGAGCGAGACCCCACTAAC-3 ;
Primer-R:5 -
GGCGGAGATGATGACCCT-3 .HSP70:Primer-F:5 -CCAAGGTGCAGGTGAAC TACAAGG-3 ;Primer-R:
5 -GCCGCTGAGAGTCGTTGAAGTAG-3 .)使用2-ΔΔCT 法进行相对定量分析㊂1.3.6㊀Western blot 检测眼睑成纤维细胞内HSP70
蛋白相对表达量㊀
在两种细胞培养至第3代后，接种细胞，收集3次样本，提取两种细胞的全蛋白㊁电泳(80V,120
V)㊁转膜(300mA,90min)，室温封闭2h㊂一抗4ħ孵育过夜(1/1000),PBST 洗3ˑ10min㊂二抗室温孵育2h(1/1000),PBS 洗3ˑ20min，显影㊂1.3.7㊀siRNA-HSP70的设计与合成
在NCBI 数据库查询小鼠HSP70基因序列(Accession Number:NM_010478.2)，最终设计3条siRNA 序列㊁1条NC 序列进行合成，见表1㊂siRNA-
HSP70的合成委托上海吉玛制药技术有限公司㊂
1.3.8㊀siRNA-HSP70转染B6小鼠眼睑成纤维细胞
B6小鼠眼睑成纤维细胞种于12孔板中，待密度达到50%~60%时，取2μL siRNA-HSP70溶于100
μL
Opti-MEM
基培中，再取
2
μL大型风力发电机组
Lipofectamin2000溶于100μL Opti-MEM 基培中，混匀后，室温各孵育5min；再将两者混匀，室温孵育
20min；成纤维细胞换液，更换成基础培养液800μL；混合液加入12孔板中，混匀，细胞37ħ,5% CO2培养箱中培养6h后更换成完全培养液㊂细胞转染后48h提取总RNA㊁72h提取总蛋白㊂1.3.9㊀Transwell检测眼睑成纤维细胞迁移能力的变化
本实验选用直径6.5mm，孔径8μm的Transwell小室;0.25%胰酶将转染的细胞消化，以DMEM基础培养基重悬并调整细胞浓度至每毫升5ˑ105个细胞；加100μL细胞悬液至Transwell上室，加入500μL DMEM培养基(含5%胎牛血清)至Transwell下室，于CO2培养箱中培养24h；取出Transwell小室，吸尽培养基,PBS清洗3次；放入4%多聚甲醛中固定20min；弃固定液,PBS摇床洗10 min；放入结晶紫中室温染10min;PBS轻洗2次，每次5min；用脱脂棉擦去小室上表面细胞，显微镜下取5个视野拍照计数，
以备后续统计㊁分析㊂1.4㊀统计学方法
采用STATA V16.1统计学软件进行数据处理，用GraphPad Prism8软件进行统计作图㊂数据结果用平均数ʃ标准差( xʃs)表示，获得数据分析为正态性分布，采用配对t检验，当P<0.05视为差异有统计学意义㊂
2㊀结果
2.1㊀成纤维细胞形态
使用倒置相差显微镜观察从B6和B6-Co小鼠眼睑取出的成纤维细胞，在400倍镜下可以看出两种成纤维细胞都呈现梭形㊁星型㊁多角型㊂但是B6小鼠的成纤维细胞更为舒展，且胞体较大；而B6-Co 小鼠的眼睑成纤维细胞在400倍镜下发现其边缘较为粗糙，形态与B6相比更为狭小，见图1㊂
2.2㊀通过免疫荧光法鉴定B6和B6-Co小鼠成纤维细胞
使用免疫荧光技术鉴定原代取材的细胞，根据文献查阅发现：使用眼睑部位皮肤进行原代取材一般存在两种细胞：成纤维细胞与角质形成细胞㊂因此使用Vimentin(波形蛋白)和Cytokeratin(细胞角蛋白)进行免疫荧光染(图2㊁图3)，因为波形蛋白是成纤维细胞的标志性蛋白，而细胞角蛋白是角质形成细胞的标志性蛋白㊂所以从图2㊁图3中发现，在B6与B6-Co两种成纤维细胞中的细胞质里，发现被染
的波形蛋白，而没有出现细胞角蛋白，说明成纤维细胞纯度达到100%㊂因此，可以证明原代取材B6和B6-Co小鼠眼睑部位成纤维细胞成功㊂
2.3㊀通过HE染观察B6和B6-Co小鼠成纤维细胞
HE染方法主要是用苏木素染核呈蓝，而伊红染主要是染细胞胞浆㊂从图4可以发现，绝大多数细胞呈长梭形，胞浆为红，细胞核被染成蓝，符合成纤维细胞特征㊂B6和B6-Co小鼠成纤维细胞在HE染上没有显著性差别㊂
rbd-446
2.4㊀通过血球计数板法检测B6和B6-Co小鼠成纤维细胞生长
通过血球计数板计数法，原代取材培养三代以后，胰酶消化后离心弃上清，重悬沉淀，人工计数，种板 每孔约2ˑ104个㊂之后7d定时通过数值统计，得出图5的两种细胞生长曲线㊂可以发现两种细胞都呈现增殖趋势，但在第7天略微下降，细胞长满进入平台期㊂而B6小鼠成纤维细胞数量统计每天都略高于B6-Co小鼠成纤维细胞数量,B6小鼠成纤维细胞第1天后即进入指数增长期,B6-Co则在第2天进入指数增长期，因此由图5可以判定, B6-Co小鼠成纤维细胞增殖速度显著低于B6正常成纤维细胞增殖速度(P<0.01)㊂
2.5㊀通过Real-time PCR法检测B6-Co和B6小鼠成纤维细胞内HSP70mRNA的表达
通过常规方法提取RNA进行Real-time PCR实验，从图中发现,B6-Co小鼠眼睑部位成纤维细胞HSP70mRNA表达量低于B6小鼠眼睑成纤维细胞，且二者具有显著性差异(图6)㊂
2.6㊀通过Western blot检测B6-Co和B6小鼠成纤维细胞内HSP70蛋白表达量
通过Western blot实验发现,B6-Co小鼠眼睑部位成纤维细胞的HSP70蛋白表达量低于B6小鼠成纤维细胞，且二者具有显著性差异(图7)㊂
2.7㊀siRNA-HSP70对HSP70基因的干扰效率
在转染48h后，通过Real-time PCR验证HSP70基因mRNA水平的干扰效率；在转染72h 后，通过Western blot验证HSP70基因蛋白水平的干扰效率㊂结果表明(图8)：各组均能对靶基因的mRNA及蛋白表达产生抑制作用,siRNA-HSP70-3组较其他组抑制作用最强,B6小鼠眼睑成纤维细胞HSP70基因的表达量下降最为显著，干扰效率高达70%以上(P<0.01)，以上结果表明siRNA-HSP70-
注:A㊁B㊁C:B6小鼠眼睑成纤维细胞;D㊁E㊁F:B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞㊂
图1㊀B6㊁B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞形态图
Note.A/B/C,B6mouse orbital fibroblasts.D/E/F,B6-Co mouse orbital fibroblasts.
Figure1㊀Morphology of orbital fibroblasts in B6and B6-Co mice
注:A：波形蛋白;D：细胞角蛋白;B㊁E:DAPI染;C㊁F：合成图㊂
图2㊀免疫荧光鉴定B6小鼠的眼睑成纤维细胞Note.A,Vimentin.D,Cytokeratin.B/E,DAPI staining.C/F,Merge.
Figure2㊀Immunofluorescence identification of orbital fibroblasts from B6mice
注:A：波形蛋白;D：细胞角蛋白;B㊁E:DAPI染;C㊁F：合成图㊂
图3㊀免疫荧光鉴定B6-Co小鼠的眼睑成纤维细胞Note.A,Vimentin.D,Cytokeratin.B/E,DAPI staining.C/F,Merge.
Figure3㊀Immunofluorescence identification of orbital fibroblasts from B6-Co mice
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