操作方法
1、包被：用包被液CBS稀释包被抗原至菌含量为2×108cfu，酶标板中每孔加入50μl，湿盒内室温或4℃或37℃过夜包被。 2、洗涤：弃包被液（用力拍干），用洗涤液1×PBST洗板3次（每孔均要加满），每次3min~5min。
3、封闭：每孔加封闭液（1%BSA）250μl，（10ml 5%。0.5g）37℃封闭2h。
4、洗涤：用洗涤液1×PBST洗板3次，每次3min~5min。
5、结合一抗：用1×PBST缓冲液1∶100稀释被检血清，每孔50μl，要设立阴性对照，37℃孵育1.5h。 6、洗涤：同上。
7、结合二抗：每孔加用1×PBST 500倍稀释的酶标二抗羊抗鸡IgG-HRP（稀释倍数根据产品不同有所不同，可按说明书进行）50μl，37℃孵育1.5h。
8、洗涤：同上。
9、显：每孔加底物溶液（OPD）50μl (配10ml) ，置室温暗盒内显10min。
10、待显后，每孔加入50μl终止液采访麦克风（2mol/L H2SO4）终止反应。使用酶标仪读取492nm的OD值，以确定血清抗体水平。
ELISA检测所用主要试剂：
包被缓冲液：0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液（CBS）
Na2CO3 l.59g
NaHCO3 2.93g
加去离子水水至1000ml，调pH值到9.6。15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。
磷酸盐缓冲溶液（1×PBS）：0.01 mol/L、pH7.4
NaCl 8.0g
KH2PO4 0.2g
KCl 0.2g
Na2耐高温油墨HPO4·12H2O 2.9g
溶于900ml去离子水后，调节pH至7.4，定容到1L。15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。
10×PBS：0.2 mol/L、pH7.4
NaCl 8.0g
KH2PO4 2.4g
KCl 2.0g
Na2HPO4·12H2O 36.05g 或Na2HPO4 14.4g
溶于900ml去离子水后，调节pH至混合交换7.4，定容到1L。15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。
洗液：含0.05% Tween20的0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBST)。
封闭液：0.5% 聚乙烯醇或5%BSA或脱脂乳或1·5%的明胶
潜流湿地酶标二抗溶液：用PBST适当稀释辣根过氧化物酶标记二抗。
底物溶液：OPD-H2O2-磷酸盐缓冲液
A液(0.1mol/L柠檬酸)：柠檬酸19.2g加去离子水至1L。15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。
B液(0.2mol/L Na2HPO4溶液)：Na2HPO4·12H2O 71.6g加去离子水至1L。15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。
10ml底物液，取A液2.43m1, B液2.57m1，去离子水5m1，加OPD 4mg充分混匀溶解。加入15μl 30%H2O2后，配好后即刻使用。
终止液(2mol/L H2SO4)：把109ml浓硫酸缓慢加入891ml去离子水中，边加边不断搅拌，以利于散热。
实验1一免后 0.354 0.365 | 实验1一免后0.422 0.417 | 对照1二免 0.405 0.406 | 对照1二免 0.412 0.424 | | | | | |
实验2一免后 0.358 0.362 | 实验2一免后 0.412 0.414 | 对照2二免 0.342 0.349 | 对照2二免 0.422 0.351 | | | | | |
实验1二免后 0.364 0.367 | 实验1二免后 0.406 0.407 | 对照1三免 0.356 0.360 | 对照1三免 0.400 0.401 | | | | | |
实验2二免后 0.354 0.357 | 实验2二免后 0.389 0.411 | 对照2三免 0.346 0.356 | 对照2三免 0.400 0.408 | | | | | |
实验1三免后 0.356 0.341 | 实验1三免后 0.406 0.402 | 阴性血清 0.350 0.360 | 阴性血清 0.420 0.430 | | | | | |
实验2三免后 0.354 0.352 | 实验2三免后 0.406 0.415 | 空白 0.360 0.355 | | | | | | |
口袋领域对照1一免 0.341 0.340 | 对照1一免 0.422 0.418 | | | | | | | |
对照2一免 0.347 0.358 | 对照2一免 0.343 0.351 | | | | | | | |
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一次性咖啡杯1→12
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