方法一：
1.首先需要把细胞养在玻璃片上悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟,PBS洗两次,% TX-100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透;
3.接下来进行荧光标记,需要在一个大的容器面积大,扁平状的,比如大的培养皿里面,放一张用水打湿的滤纸,以保持湿度;
4.剪一片合适大小的parafilm,在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗稀释倍数依具体抗体而定,每个玻璃片30ul足够,把玻璃片盖在上面细胞面朝下,室温下孵育30分钟,然后在PBS里洗三次; 5.接下来二抗孵育步骤同上;
6.最后,在载玻片加上mounting medium大约每个玻璃片加10ul,把玻璃片放上去细胞面朝下,37度30分钟,然后就可以在荧光显微镜下观察了;
7.抗体很重要,不能有非特异性结合;你可以先做WB检测一下你的抗体,看看有没有杂带;
8.双标的话,可以把两个一抗一起加或者分别标记两次可以都试一下看看那种方法合适;如果一个抗体需要二抗,一个是直接荧光标记的,可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加;
方法二：
1.选取一抗时要来源于两种不同的动物,我用的是来源于rabbit和rat的抗体,二抗则是不同荧光信号标记 的,我用的是donkey anti-rabbit-FITC绿和donkey anti-rat-Tex-Red红;
2.我的做法是两种一抗同时孵育,然后两种二抗同时孵育;抗体浓度、孵育时间要仔细摸索,我感觉一抗4度孵育过 夜比较好,背景比较清晰;
3.我的阳性对照用的是阳性组织切片,阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG,荧光标记物对照是PBS+荧光标记物;
4.封闭血清与二抗来源动物一致,我用的是10%的正常donkey血清;
5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作;
方法三：
1.片子的制作：可以做细胞爬片,细胞甩片,还有直接在24well/12well/96well中直接染
2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片,要是自己制作的话,就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片 3.儿童远程监控手表细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上;
4.其实小的well的话,可以直接拿来染,没问题的;
5.固定：用PBS洗去培养液,用固定液如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精;;;固定细胞;
6.内源性过氧化物酶处理,3%过氧化氢处理细胞选作,二抗连HRP得必做,其他的如做免疫荧光染不用做;
7.通透胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做,一般选用Triton-X100来做细胞通透,浓度和时间需要摸索,一般是%,处理时间为1-30分钟,级个别需要到1-2小时;
8.封闭：洗去通透液,用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时,也可以选用5-10%脱脂奶粉;封闭结束后千万不要洗,直接上一抗;
9.一抗：具体你想做什么样的蛋白,咨询抗体公司如santa cruze,;选取具体的抗体,但是一抗的稀释浓度也是要摸索,抗体稀释液可以购买抗体公司现成的,对于新手还是挺好的;时间一般是4度过夜或者37度1小时;一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体;车载电视接收器
10.洗去一抗;
11.上二抗,二抗一般抗体公司会给你推荐的,你在其中选上一个就行了,自己选国产的也行,就是选在哪个动物体内做的一抗,二抗就选抗那个动物的就行了;二抗的浓度也是需要摸索的,抗体稀释液和一抗相同就行了;二抗的时间一般是37度半小时;
12.底物显选作,二抗连得是酶的必做,按试剂盒的说明书添加就行了,显时间可能需要摸索,以免显过度引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做
13.洗去二抗,染核
14.DAPI或者Hoechst染核
15.洗去染核液,加PBS,上镜观察;
方法四：
(1)细胞准备;对单层生长细胞,在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片,PBS洗两次；对悬浮生长细胞,取对数生长细胞,用PBS离心洗涤1000rpm,5min2次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片;
(2)固定;根据需要选择适当的固定剂固定细胞;固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月;PBS洗涤3×5 min;
(3)通透;使用交联剂如多聚甲醛固定后的细胞,一般需要在加入抗体孵育前,对细胞进行通透处理,以保证抗体能够到达抗原部位;选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质;通透的时间一般在5-15min;通透后用PBS洗涤3×5 min;
(4)封闭;使用封闭液对细胞进行封闭,时间一般为30min;
(5)一抗结合;室温孵育1h或者4℃过夜;PBST漂洗3次,每次冲洗5min;
(6)二抗结合;间接免疫荧光需要使用二抗;室温避光孵育1h;PBST漂洗3次,每次冲洗5min后,再用蒸馏水漂洗一次;
(7)封片及检测;滴加封片剂一滴,封片,荧光显微镜检查;
方法五：
1．漂洗血清蛋白,37度 PBS 2小时.
2．-20度甲醇固定20分钟后卷帘门电机接线图,自然、干燥 10分钟
3．发电机冷却器PBS洗净：3min3
4．1%Triton：25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS
5．PBS洗净：25min
6．羊血清封闭：37度,20分钟
7．一抗,4度过夜,一般要大于18小时或者37度1-2小时
8．4度 PBS洗净,３min5次
9．二抗 37度小于一小时
10．37度 PBS洗净,33min
11．凉干封片封闭液
细胞免疫荧光步骤：
1.细胞爬片；首先是玻片的处理,普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块,先用洗衣粉洗干净,用水冲静烤干,然后泡酸过夜,捞酸后流水洗净,烤干,置于器皿中高压灭菌,然后再烤箱中大约8小时烤干备用;
爬片可以在培养皿 六孔板或24孔板中都可,我选择在培养皿中爬;一为节约经费培养皿可以重复利用二来觉得培养皿口大,操作比较方便;培养皿消毒同上,消毒时记得消两把镊子
具体操作是：用胰酶消化好细胞,充分吹打,使之成单细胞悬液注意：这一点很重要,关系到将来爬出来片子的质量幼儿园门禁
取出消毒的培养皿,可以先加少量培养基以使玻片与培养皿紧密接触,将玻片小心放入摆放其中,然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上;最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养,根据细胞生长状况,24小时或更长时间适时取出爬片;
爬片置于37度PBS中洗三次,每次3到5秒钟,然后在4％多聚甲醛中固定15分钟,然后再用37度去离子水将甲醛冲干净,注意手法轻柔,要不然掉片很厉害;同时操作过程中注意玻片的正反面,要不然真的是前功尽弃;
将做好的爬片置于滤纸上晾干,然后用中性树胶粘在载玻片上;注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验,要不然玻片会掉下来的,就又是前功尽弃了 做好的细胞爬片可以放在－20保存备用,具体能保存多长时间不太清楚,当然尽量早用;
%多聚甲醛固定10min固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮；
漂洗5min；
4.0.5% Triton 穿孔15min丙酮固定法不用透化处理；
漂洗2次,每次5min；
%BSA封闭30min；
7.加入1%BSA稀释的一抗,于37℃杂交2h；
漂洗2次,每次5min；
9.加入1%BSA稀释的二抗,于37℃杂交1h；
漂洗2次,每次5min；
ml DAPI染2min；
12.抗淬灭封片剂封片;
抗淬灭封片剂:
% DABCO w/v
50mM Tris
90%甘油
细胞免疫荧光
细胞爬片
4%多聚甲醛固定10min
固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮
PBS漂洗5min
% Triton 穿孔15min
丙酮固定法不用透化处理
PBS漂洗2次,每次5min
1%BSA封闭30min
加入1%BSA稀释的一抗,于37℃杂交2h
PBS漂洗2次,每次5min
加入1%BSA稀释的二抗,于37℃杂交1h
PBS漂洗2次,每次5min
5ug/ml DAPI染2min
抗淬灭封片剂封片
% DABCO w/v
抗淬灭封片剂 50mM Tris
90%甘油
0.25g DABCO
9ml甘油
1M Tris 70℃溶解,-20℃保存
ddH2O
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