中国图书分类号Q786 文献标识码A 文章编号1004-5503（2009）10-0949-04 【基础研究】HCV 核心抗原N-端片段生物素化表达质粒的构建及表达 雷明军买制刚陈少娟黄德兴林枫李凌云
【摘要】目的构建HCV 核心（C）抗原N-端1 ～130 aa 片段的生物素化表达质粒，并在大肠杆菌中进行表达。方法PCR 扩增HCV C 抗原N-端1 ～130 aa 片段的编码基因，拼接上生物素-蛋白连接酶底物肽序列（BSP），构建重组原核表达质粒pGEX4T-1-C N130B SP，转化大肠杆菌Rosetta，IPTG 诱导表达。表达产物经SDS-PAGE 后，电转至硝酸纤维素膜上，以抗HCV C 抗原的单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素对表达产物进行分析。结果PCR 扩增出约466 bp 的目的基因片段；质粒pGEX4T-1-C N130BSP 经PCR 及双酶切鉴定，与预期结果一致，测序鉴定基因无突变；SDS-PAGE 显示表达产物相对分子质量约为42 000，22℃诱导16 h 可溶性表达产物含量较高；表达的重组蛋白可被抗HCV C 抗原的单克隆抗体所识别，并能特异性结合辣根过氧化物酶标记的亲和素。结论已成功构建了HCV C 抗原N-端1 ～130 aa 片段生物素化表达质粒，并表达出带生物素标签的GST 融合蛋白，为进一步研制HCV 双抗原夹心检测试剂奠定了基础。 【关键词】丙型肝炎病毒；核心抗原；N-端片段；生物素化；原核表达
Construction and Expression of Biotinylated Expression Vector for Amino Acid Fragment at N-terminus
of HCV Core Antigen
LEI Ming-jun, MAI Zhi-gang, CHEN Shao-juan, et al（Research Center for Biotechnology of Shenzhen University, Shenzhen 518057, Guangdong Province, China）
【Abstract】Objective To construct a biotinylated expression vector for 1 ~ 130 aa fragment at N-terminus of HCV core anti－gen. Methods The gene encoding 1 ~ 130 aa fragment at N-terminus of HCV core antigen was amplified by PCR and spliced to BirA substrate peptide（BSP）gene sequence. The constructed recombinant prokaryotic expression vector pGEX4T-1-C N130BSP was trans－formed to E. coli Rosetta for expression under induction of IPTG. The expressed product was identified by SDS-PAGE, then trans－ferred to a nitrocellulose filter and analyzed with McAb against HCV core antigen and HRP-labeled avidin. Results A target gene fragment at length of 466 bp was amplified by PCR. Both PCR and restriction analysis proved that recombinant plasmid pGEX4T-1- C N130B SP was constructed correctly, and sequencing result showed no gene mutation. SDS-PAGE showed expressed protein with a rela－tive molecular mass of about 42 000. After induction at 22℃ for 16 h, the expression level of soluble protein reached a peak value. The expressed product was recognized with McAb against HCV core antigen, and bound to HRP-labeled avidin specifically. Conclu－sion A biotinylated expression vector for 1 ~ 130 aa fragment at N-termin
us of HCV core antigen was successfully constructed, and GST fusion protein with biotin labeling was expressed, which laid a foundation of further preparation of double antigen sandwich de－tection kit for HCV.
【Key words】HCV; Core antigen; N-terminal fragment; Biotinylation; Prokaryotic expression
丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）是一种经血液传播的病毒，其感染所导致的丙型肝炎是一种危害严重的传染病。该病毒基因组为单股正链RNA，含有一个大的开放阅读框架。编码一个3010 ～3013 氨基酸的多肽前体。该前体在体内至少被加工成10 个不同的结构与非结构抗原［1，2］。由于各抗原性质不同，在体内引起的免疫应答也不相同。其中，抗HCV 核心（Core，C）抗原的抗体在体内出现最早，持续时间最长。因此HCV 核心抗原及其抗体是目前
基金项目：广东省科技计划项目（2008A030201025）；深圳市科技计划项目（200712）；深圳大学青年基金（200835）.
作者单位：深圳大学生化工程技术研究中心（广东深圳518057）.
通讯作者：买制刚，E-mail：**************** HC V检测试剂的核心成分［3，4］。在目前的市售HC V
抗体试剂盒中，间接E LISA是主流检测技术。间接
法所测定的仅为抗体的IgG类，不涉及IgM和IgA类，
因而灵敏度不如双抗原夹心法。但由于HC V抗原的
性质与结构较为特殊，如HC V核心抗原含有较多的
碱性氨基酸，溶解性差，且难于进行标记，对HC V双
抗原夹心法试剂盒的研制造成了一定困难。为了进
一步开发研制HC V诊断试剂，本研究通过蛋白质分
析软件（Go ldke y）对HC V C抗原进行了蛋白质疏水
性分析和抗原决定簇预测，在此基础上选取了HC V C 抗原基因N-端1 ～130 aa 片段作为目的片段；在其
编码基因的3′端拼接上B ir A酶底物肽（BS P）序列，使表达产物能够被大肠杆菌内部的生物素-蛋白
连接酶（BirA）所识别而生物素化。融合基因插入GST 融合表达载体pGEX4T- 1中，并在大肠杆菌Rosetta 中进行诱导表达。表达产物经Western blot 分析证明具有良好的反应原性，为HCV 双抗原夹心检测试剂的研制奠定了基础。
1. 材料与方法
1. 1 菌株及质粒
大肠杆菌DH5α和Rosetta 为本中心基因工程与分子诊断室保种传代；含HCV C 抗原全长cDNA 的质粒pBluescript-core 为武汉大学朱艺教授惠赠；GST 融合表达载体pGEX4T-1 为本中心基因工程与分子诊断室保存。
1. 2 主要试剂
Ex Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、限制性内切酶SalⅠ、BamHⅠ和DNA marker DL2000 均购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA 凝胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒均购自Queen 公司；IPTG、十二烷基硫酸钠（SDS-Na）、EDTA-Na2、Tris 碱和氨卞西林为上海生工生物工程技术服务有限公司产品；抗HCV C 抗原单克隆抗体为本中心基因工程与分子诊断室保存；HRP 标记的羊抗鼠IgG 和辣根过氧化物酶标记的亲和素均购自北京博奥森生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
淤泥固化
1. 3 HCV C 抗原基因N-端1 ～130 aa 片段的扩增及BSP 序列的拼接
根据GenBank 中登录的HCV C 抗原基因序列（D45172）设计3 条引物：P1：5′-CATGCGGATCCAT－GAGCACAAATCCAAAACCC-3′（引入B amHⅠ酶切位点）；P2：5′-AAAAATATCATTCAGACCGCCACCGA- AGCCGCATGTGAGGGTATC-3′；P3：5′-TCGCAGTCG- ACTTATTCGTGCCATTCGATTTTC TGAGCCTCAAAA-ATATCATTCAGACCGCC-3′（引入Sa lⅠ酶切位点），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR 扩增分2 次进行，首先以P1 和P2 为引物，质粒pBluescript-c o re 为模板，扩增HC V C抗原基因N-端1 ～130 aa 片段的编码序列，并在3′端融合部分BSP 序列；将第1 次PCR 产物电泳回收，以其为模板，P1 和P3 为引物进行第2 次PCR 扩增。PCR 产物经1. 2% 琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
1. 4 HCV C 抗原基因N-端1 ～130 aa 片段生物素化重组原核表达质粒的构建
使用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ分别双酶切第2 次PCR 回收产物及pGEX4T-1 表达载体，经琼脂糖凝胶电泳回收后，以T4 DNA 连接酶连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，菌落PCR 筛选阳性克隆，抽提质粒DNA，经BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定后，使用pGEX4T-1 载体通用测序引物测定插入片段序列。测序正确后，将pGEX4T-1-C N130BSP 质粒转化大肠杆菌Rosetta。
1. 5 目的基因的诱导表达
将含重组表达质粒的大肠杆菌Rosetta 接种于含100 μg ／ml 氨卞西林的LB 培养基中，过夜培养至生长饱和后，1 ∶ 100 转种，培养至A600 = 0. 6 时，加入IPTG 至终浓度为0. 1 mmol ／L，分别以28℃诱导10 h 和22℃诱导16 h，离心收集菌体，重悬于PBS 中，超声裂解后，离心，取沉淀和上清液，进行SDS-PAGE 分析。
1. 6 重组蛋白的鉴定
表达的重组蛋白经SDS-PAGE 后转印至硝酸纤维素膜上，用含3%脱脂奶粉、0. 05%吐温-20 的PBS 37℃封闭 2 h；加入封闭液稀释的抗HCV C 抗原单克隆抗体（检测反应原性）或辣根过氧化物酶标记的亲和素（检测生物素化），4℃作用过夜；PBST 洗涤4 次，检测反应原性时，再加入封闭液稀释的HRP 标记的羊抗鼠IgG，37℃作用2 h；最后DAB 显，PBS 终止反应，观察结果。
2. 结果
2. 1 PCR 扩增产物的鉴定
第1 次和第2 次PCR 产物经1. 2％琼脂糖凝胶电泳分析，分别在约425 bp 和466 bp 处可见特异性DNA 片段，大小与预期一致，见图1。烟气脱硝催化剂
bp M 1 2
2 000
1 000
750
500
250
100
1：第1 次PCR 产物；2：第2 次PCR 产物；M：D N A marker DL2000
图 1 HCV C 抗原基因N-端 1 ～130 aa 片段PCR 扩增产物电泳图
Fig 1. Electrophoretic profile of PCR product of gene encoding 1 ～130 aa at N-terminus of HCV C antigen
2. 2 重组原核表达质粒的鉴定
重组质粒的PCR 及双酶切产物经1. 2％琼脂糖凝胶电泳分析，在约500 bp 处均可见特异性DNA 片段，大小与预期相符，见图2。测序证实插入片段序列正确，无突变。
bp M 1 2
M r M 1
43 000
M r M 2
43 000
500
250
1：质粒pGEX4T-1-C N130BS P的PCR 产物；2：质粒p GEX4T-1-C N130BS P 经BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切；M：D N A m arker DL2000
图2 重组原核表达质粒pGEX4T-1-C N130BS P 的鉴定
Fig 2. Identification of recombinant plasmid pGEX4T-1-C N130BSP
2. 3 表达产物的鉴定
表达产物经SDS-PAGE 分析，在相对分子质量约42 000 处可见一条新生蛋白条带，所表达的重组蛋白GST-C N130BSP 部分位于包涵体中，部分位于裂解上清中。22℃诱导16 h 可溶性表达产物较28℃诱导10 h 明显增加，见图3。转膜分析表明，表达的重组蛋白可被抗HCV C 抗原单克隆抗体或辣根过氧化物酶标记的亲和素所识别，见图4。
1 2 3 4 5 6 7 8 M M r
43 000
31 000
1：未经诱导的重组表达菌；2：28℃诱导10 h 后的表达菌；3：28℃诱导10 h 的破菌上清；4：28℃诱导10 h 的破菌沉淀；5：22℃诱导16 h 的破菌沉淀；6：22℃诱导16 h 的破菌上清；7：未经诱导的空载体转化菌；8：28℃诱导10 h 后的空载体转化菌；M：蛋白质marker
图3 表达产物的SDS-PAGE 分析
Fig 3. SDS-PAGE profile of expressed p roduct
M：蛋白质marker；1：重组蛋白与抗HCV C 抗原单克隆抗体反应；2：重组蛋白与辣根过氧化物酶标记的亲和素反应图4 重组蛋白GST-C N130BSP的转膜分析
道路交通事故现场图Fig 4. Analysis of recombinant GST-C N130BS P protein with McAb against HCV C antigen and HRP-labeled avidin
3. 讨论
目前市售的HCV 抗体检测试剂盒均采用间接法，即使用酶标二抗作酶结合物。但病人血清中被检测的特异性IgG 只占总IgG 的一小部分，并且IgG 的吸附性很强，非特异IgG 可直接吸附到固相载体上造成假阳性结果。同时，血清中还存在一些内源性干扰物，如类风湿因子，能与IgG 的Fc 段反应而干扰检测结果［5］。因此，目前间接法ELISA 试剂盒正向双抗原夹心法转变。由于HCV 抗原的性质及结构较特殊，如HCV C 抗原含有较多的碱性氨基酸，经化学标记后容易丧失抗原活性，因此，目前市场上还没有HCV 抗体的双抗原夹心法检测试剂盒出售。大肠杆菌的BirA 酶可以特异性地识别BSP 序列，并催化其与生物素的连接反应。因此，可以利用这一性质得到生物素化的重组蛋白［6］。本研
深度水产>萝卜红素究将BSP 融合在重组蛋白的C-端，转膜后分析证实，所表达的重组蛋白能与辣根过氧化物酶标记的亲和素特异性结合，表明重组蛋白在表达过程中被大肠杆菌本身的Bi－rA 酶所识别并被生物素化。
HCV C 抗原是由HCV 多肽前体剪切而成的非糖基化蛋白，在HCV 逃避机体的免疫学攻击和致癌方面发挥着重要作用［7～9］，且含有大量的免疫学表位［10～12］。但HCV C 抗原的羧基端富含疏水性氨基酸，直接表达产量很低，因此，本研究截取HCV C 抗原N-端的1 ～130 aa 片段进行表达，避开了C-端对表达有影响的部分，同时又包含了大部分的免疫学表位。真核蛋白在大肠杆菌中的表达多不能正确折叠而形成包涵体，我们在研究中发现，包涵体中的表达产物被生物素化的效率很低，因此，重组蛋白能否被正确折叠而保持良好的水溶性非常重要。本文采用pGEX4T-1 载体，将GST 与HCV C 抗原N-端1 ～
130 aa 片段融合表达，融合GST 有助于提高重组蛋白的稳定性和水溶性［13］，并且融合蛋白可以通过亲和层析得到纯化。同时，诱导表达温度对重组蛋白的活性非常重要。当诱导表达温度为28℃时，
在裂解上清中有重组蛋白，但主要为包涵体形式；当诱导表达温度降至22℃时，裂解上清中的表达产物与包涵体中的大致相当。进一步降低表达温度可以得到更多的可溶性重组蛋白，但需要更长的诱导表达时间，使得表达方案更复杂。综合考虑，我们选择了22℃作为最终的表达温度。对重组蛋白的转膜分析表明，生物素化的重组抗原能够被抗HCV C 抗原的单抗特异性识别，表明重组抗原具有良好的反应原性。生物素化的HCV C 抗原N-端1 ～130 aa 片段的成功表达，为HCV 双抗原夹心法检测试剂盒的研制奠定了基础。
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（收稿日期：2009-02-06）
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效表述，其产量达到100 mg ／L［19］。本文在SP2 ／0 细胞中表达的嵌合抗体产量较低，难以获得足够的量以进一步鉴定其他生物学活性。但本文利用基因工程技术将鼠源性单克隆抗体改造成嵌合抗体，该技术为嵌合抗体在其他真核细胞中的高效表达及临床应用奠定了基础。
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（收稿日期：2009-06-01）
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