酶联免疫吸附试验（ELISA）的程序
第一节 间接ELISA试验
一用可溶性抗原的ELISA：
毒草解毒剂1、 纯化抗原：用包被液稀释至1—20ug/ml； 2、 以50—100ul/孔量加入酶标板孔中；
3、 置4（度）过夜或37（度）吸附3h；
多任务手势4、 PBST洗三次；
5、 每孔200ulPBS/NCS 4（度）过夜封闭或37（度）封闭3h；
6、 PBST洗5次，每次1min（包被板可—20（度）或许（度）保存备用）
7、 每孔加50—100ul第一抗体，同时设阳性、阴性对照。若杂交瘤筛 选，每孔加杂交瘤培养上清；
8、 37（度）孵育2h
9、 PBST洗5次，每次5min
10、 每孔加50—100ul酶标第二抗体；若杂交瘤筛选，每孔加HRP标记的抗小鼠（IgG+IgM）抗体；
11、 37（度）孵育2h
12、 PBST洗5次，每次数5分钟；
13、 每孔加OPD 或TMBS底物100ul
14、 37（度）避光作用；（OPD为10—20）分钟，TMBS为40分钟）；
15以50ul2MH2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值（OPD底物选用490nm滤光片，TMBS底物选用450nm滤:光片）；
16结果判定：
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二维码支付（1）P/N≥2.1 为阳性
(2) P≥N+3SD 为阳性
成功范例:NDV单抗检测，粘附素单抗检测，H单抗检测 亚类鉴定和鸡白痢检疫等。 二、用全菌抗原的ELISA法
（一） GA法
1、 新鲜培养的细菌用蒸馏水悬浮，光密度法或比浊法调整细菌 浓度至1X10（6）个/ml。 注意：沙门氏菌等人畜共患病原体，使用前必须灭活或采用市售的灭活诊断菌液；
2、 酶标板中加200ul/孔，5%戊二醛（GA）溶液（0.1M NaHCO4 95ml+25%DNY戊二醛溶液5ml）;37(度);2小时
3、 蒸馏水洗5次;
4、 加细菌悬浮液,50ul/孔;
5、 37(度)温箱内过液,干燥吸附(20—24h)
6、 加PBS/NCS 220ul/孔37（度）封闭3小时或4（度）过夜封闭；
7、 PBST洗5次（—20（度）或4（度））存放备用；
8、 以下步骤同一。
（二） MA法
1、 细菌悬液（1X10（6））50ul/孔；
2、 室温或37（度）干燥吸附；用甲醇（MA）固定；室温10分钟；
3、 加PBS/NCS封闭，37（度）3小时或4（度）过夜；
4、 PBST洗5次（于—20度或4度保存备用）；
5、 以下步骤同一
成功范例：H单抗检测等。
1、 按常规方法培养细胞，接种病毒，收获感染细胞和未感染的细胞 ，进行细胞 计数，用PBS制成适当浓度悬液；
2、 加100ul/孔细胞悬殊浮液于酶标板内，使每孔含细胞5X10（）
3、 将板离心1000rpm10分钟，甩去上清，室温干燥（可保存在4℃或—20℃备用）；
4、 PBST冼3次，每次5分钟；
5、 每孔加100ul第一抗体或杂交瘤 上清，设立对照；
6、 37℃1—2小时；集成电路设计流程
7、 PBST洗3 次；
8、 每孔加入100ul酶标第二抗体，37℃1—2小时；
9、 PBST冼5次；
10、 每孔加入100ul底绶冲液，室温作用30分钟；
11、 判定结果。多点干油泵
成功范例：粘附素单抗，O抗原单抗检测等。
注意：若需要，可灭活细胞内源酶，以减少本底反应。其它方法参见本章第六节。
第二节 直接ELISA
1、可溶性抗原或全菌抗菌素原（用量以方阵试验确定）包被标板（50—100ul/孔）；
2、PBS/NCS封闭板（保存备用）；
3、 每孔加50—100ul酶标抗菌素体；设立阴性、阳性对照；
4、 37℃孵育2h
5、 PBST洗5次，每次5分钟；
6、 以下同间接ELISA；
成功范例：沙门氏菌检验、抗血清效价测定、酶标抗体效价测定 等。
第三节 夹心ELISA试验
1、 单一或混合单抗腹水或纯化的免疫血清用包被液稀释后25—100ug/ml；（有人使用蒸馏水直接稀释腹水作包被）。
2、 以50—100ul/孔量加入酶标板中；
3、 置4℃过夜吸附或37℃吸附3h
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