绿萝叶片和茎段离体愈伤组织培养及继代培养
三组实验设计方案
1、实验目的
(1)通过本次实验，进一步熟悉配制培养基的流程及操作中应注意的事项，学会设计和筛选绿萝愈伤组织诱导培养基配方。 (2)通过本次实验，能够熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术。
(3)通过本次实验，能够熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。
2、实验流程
配置绿萝叶片和茎段愈伤组织诱导培养基 接种绿萝叶片和茎段诱导愈伤组织产生 配置绿萝叶片和茎段愈伤组织增殖培养基 接种绿萝叶片和茎段愈伤组织进行增殖 实验结果观察记录
3、实验设备及材料
（1）实验用具和仪器
冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、玻璃棒、陶瓷缸、精密pH试纸（pH5.4~7.0）、药勺、称量纸、标签纸、封口膜、橡皮筋、棉线、电炉、高压蒸汽灭菌锅、电磁炉等。 酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、超净工作台、恒温培养箱、100ml三角瓶、1000ml搪瓷杯、50ml量筒、1ml、2ml、5ml、10ml吸管等。
（2）药品和试剂：
MS培养基母液配制试剂、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH、绿萝叶片和茎段组织诱导培养基、无菌水、75％酒精、0.1%HgCl2，、愈伤组织继代培养基、蒸馏水等。
（3)材料：绿萝叶片和茎段
4、外植体选择
绿萝，属天南星科，是常绿藤植物。枝繁叶茂，嫩绿有光泽，有极好的观赏价值。还能吸附和去除室内空气中的甲醛、苯、三氯乙烯等污染物，是天然的“空气净化器”。叶片光滑无绒毛，用作植物组培外植体时消毒较容易。
5、培养基及配制
绿萝叶片诱导愈伤组织的培养基：MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L
绿萝茎段诱导愈伤组织的培养基：1/2MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L+2，4-D0.8 mg/L
愈伤组织分化的培养基：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5mg/L
生根培养基：1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+IBA 0.2mg/L
（一）大量元素母液制备
表1 MS培养基大量元素母液制备
序号 | 药品名称 | 培养基浓度（mg/L） | 扩大20称量(mg) | 声波驱蚊 |
1 | NH4NO3 | 1650 | 33000 | 蒸馏水定容至 1000ml |
2 | KNO3 | 1900 | 38000 |
3 | CaCl2·2H2O | 440 | 8800 |
4 | MgSO4·7H2O | 370 | 7400 |
5 | KH2PO4 | 170 | 3400 |
| | 变压器油箱 | | |
注意：
(1) 配制大量元素母液时，各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。
(2)CaCl2·2H2O要在最后单独加入，在溶解CaCl2·2H2O时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl2·2H2O放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。
（二）微量元素母液的配制
MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物（除Fe ）组成。微量元素用量较少，按照表2配方，用电光分析天平称量，其它同大量元素。
配制培养基时，每配制1L培养基，取微量10ml
表2 MS培养基微量的配制
序号 | 化合物名称 | 培养基浓度（mg/L） | 扩大100倍称量(mg) |
1 | MnSO4·4H2O | 22.3 | 2230 |
2 | ZnSO4·7H2O | 8.6 | 860 |
3 | H3BO3 | 6.2 | 620 |
4 | KI | 0.83 | 83 |
5 | Na2MoO4·2H2O | 025防鼠器 | 25 |
6 | CuSO4·5H2O | 0.025 | 2.5 |
7 | CoCl2·6H2O | 0.025 | 2.5 |
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（三）、铁盐母液的配制
目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。
配制培养基时，配制1L取此液10ml
表3 MS铁盐母液的配制
序号 | 化合物名称 | 培养基浓度（mg/L） | 扩大200倍称量(mg) |
1 | 2Na-EDTA | 37.3 | 7460 |
2 | FeSO4·7H2O | 27.8 液体收集系统 | 平行流冷凝器 5560 |
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注意：
在配制铁盐时，如果加热搅拌时间过短，会造成FeS04和Na2EDTA鳌合不彻底，此时若将
其冷藏，FeS04会结晶析出。为避免此现象发生，配制铁盐母液时， FeS04和Na2EDTA应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄(约加热20 - 30 min)，调pH值至5 .5，室温放置冷却后，再冷藏。
（四）有机母液的配制
MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用电子分析天平。
表4 MS培养基有机物质母液的制备
序号 | 化合物名称 | 培养基浓度（mg/L） | 扩大倍数 | 称量(mg) |
1 | 甘氨酸 | 2 | 100 | 200 |
2 | 肌醇 | 100 | 100 | 10000 |
3 | 盐酸硫胺素(VB1) | 0.4 | 100 | 40 |
4 | 盐酸吡哆素(VB6) | 0.5 | 100 | 50 |
5 | 烟酸 | 0.5 | 100 | 50 |
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6、培养基的配制步骤
（1）计量
根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量，计算公式：吸取量 ml=培养基中物质的含量（mg/L）×1000ml/母液浓度（mg/L）。
（2）根据培养基配方， 用量筒或移液器量取所需要的各种元素的母液。
物质 | 加入体积或重量 |
大量元素母液(20×) | 50ml |
微量元素母液(100×) | 10 ml |
有机物质母液(100×) | 10 ml |
铁盐母液(200×) | 5 ml |
蔗糖 | 30 g |
琼脂 | 6 g |
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注意：
①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制。
②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次。
③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错；
④移液管不能混用。
（3）称取6g琼脂，30g蔗糖备用
（4）融化
将装有各母液的量杯倒入600～700ml的蒸馏水放在电炉上，加入琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下，加入蔗糖，蒸馏水定容到1000ml。
（5）调pH
用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.4～7.0)或酸度计测培养基的pH，一直到培养基的pH达到要求为止(在调制时要比目标pH值偏高0.2～0.5个单位，因为培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解，pH值会下降0.2～0.5个单位左右)。
注意：
调至时要用玻璃棒不停的搅拌,使其充分混合。
激素应在调节pH之前加入，因为有些激素是用酸或碱溶解的，在调节pH好之后加入会改变pH值。pH过酸或过碱对培养基均是不利的，会导致过软或过硬的结果，从而影响培养质量。
（6）分装
溶化的培养基应该趁热分装。分装时，锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4。每1L培养基，可分装25～30瓶。
（7）灭菌
培养基各母液或MS培养即可高压蒸汽灭菌。
培养基中某些成分是热不稳定的，需要进行过滤灭菌。例如一些生长因子，如赤霉素(GA)、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。先将除去了不耐热物质的培养基其它成分经高压灭菌后置于超净工作台上冷却至40℃，再将过滤灭菌后的该化合物按计划用量依次加入，摇匀，凝固后即可使用。电价查询
7、植物材料的表面灭菌和接种
A.操作人员洗手消毒
B.装材料的容器及玻璃棒用酒精表面消毒
C.将待消毒的绿萝材料水流冲洗20min，浸入75％的酒精中30秒，取出转入无菌水冲洗干净。（酒精单独一个杯子装，消毒完毕转下一组使用）
D.将无菌水倒出，并倒入0.1 %HgCl2 消毒剂并计时10分钟；（同一瓶子中操作即可，但注意不要碰到瓶口等关键部位），倒出消毒液，并用无菌水清洗4遍，保证消毒液全部清洁干净。
E.将洗净的材料用灭过菌的镊子夹出，放到干净的滤纸上吸干水分，并在滤纸上操作后续步骤；
F.将叶片切成0.5cm×0.5cm小块（接种时，叶片背面贴着培养基），茎段切成0.5-1.0cm小段接种到配制好的培养基中。（每瓶培养基放2-4块材料即可，材料不要过于集中）
I. 封口膜封好后，培养。
培养条件：温度（25±1）℃，每天光照12 h，以下培养条件均同。
8、愈伤组织诱导分化不定芽及生根培养
（1）继代培养前的准备——接种室的消毒与灭菌，超净工作台的灭菌，接种工具的消毒灭菌以及实验材料的准备
（2）愈伤组织继代培养
将上述培养好的愈伤组织在无菌条件下接种到愈伤组织分化的培养基：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5mg/L和生根培养基：1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+IBA 0.2mg/L中，封好封口膜，
25℃培养，以后每天观察愈伤组织变化以及是否有污染。
9、注意事项
（1）玻璃器皿的洗涤与消毒灭菌。
（2）天平的使用称量要准确，以保证配方中各组分的含量是准确的
（3）灭菌前检查锅内是否有足够的水，装锅不可过满。
（4）为了保证灭菌彻底，在蒸气灭菌锅增压前应先将灭菌锅内的冷空气放尽。
（5）培养基消毒灭菌时间不宜过长，也不可超过灭菌锅规定的压力范围；否则，培养基中的蔗糖、有机物质，特别是维生素类物质就会分解，导致培养基变质、变，甚至难以凝固。
当灭菌完成后，应切断电源或热源，待灭菌锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，拧开灭菌锅盖取出培养基。切勿为急于取出培养基而打开放气阀放气，否则锅内气压下降太快会引起减压沸腾，导致灭菌锅内各容器中的培养基溢出，造成浪费或污染，甚至烫伤工作人
员。
（6）操作前要洗手消毒、操作器械要灭菌，使用时可用酒精消毒和灼烧灭菌
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