导电胶水
愈伤组织：原来是指植物在受伤以后，在伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组织培养中，它是指在培养基上由培养物产生的无序生产且没有一定结构的薄壁细胞团。植物组织培养是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其在生细胞或完整植株的技术
植物组织培养的理论依据和分化途径
理论依据：植物细胞全能型（任何有完整细胞核的植物细胞具有全部的遗传信息，在一定条件下均具有分化、发育成完整蜘蛛的能力)、
细胞全能型实现具有两个条件：一是组织或器官离体，二是给予所需的营养条件，特别是激素在器官分化中起重要作用。 外植体：在组织培养中，拉挤模具 由植物体上取下来进行离体培养的那部分组织或器官
脱分化/去分化：有高度分化的植物器官、细胞、或组织，经过离体培养，产生愈伤组织的过程。
再分化：脱分化的分生细胞重新恢复分化能力，沿着正常的发育途径形成特定结果和功能的细胞的结构。
第1章：实验室及基本操作
1、培养基的基本成分及作用
培养基（culture medium）：维持离体细胞生长和生存的溶液 主要成分：1）无机盐：大量元素、微量元素 P:细胞组织分化，大量，参与核酸、能量代谢 K：直接影响培养基中酶活性。微量元素：是很多酶和辅酶的重要成分，直接影响蛋白质活性。 2）有机营养成分有机碳源如糖类，作用a:维持培养基的合适渗透压，对出生细胞核原生质体完整性又十分重要的作用b：糖类是合成有机物的碳源维生素类：对于植物组织的生长和分化有良好的促进作用含氮化合物 3）植物生长调节剂生长素：促进细胞生长及生根 2，4--D：脱分化，诱导不定根的形成细胞分裂素（KT、6-苄基腺嘌呤）：促进细胞分裂，诱导愈伤组织、不定芽和不定胚的形成赤霉素（GA）和脱落酸（ABA）GA促进器官的形成，ABA抑制细胞促进休眠4）附加成分：琼脂、活性炭、椰乳、硝酸银等。
2、常用的消毒剂消毒流程
对灭菌药剂的要求是灭菌效果好，从植物组织上易清除，对人体无害，无环境污染。 常用的植物灭菌剂：次氯酸钙，次氯酸钠（易清除），漂白粉，过氧化氢（最易清除），溴水，(消毒效果最好，但较难去除)，酒精，抗菌素，硝酸银。 灭菌的一般过程：1）材料前处理：取材后，先用自来水冲洗10min，减去伤残部分后再冲洗2）消毒液处理：先用75%的酒精消毒30s，0.1%消毒5--30min，3）无菌水冲洗3--5次，每次把镊子、小刀等器械进行酒精灯灼烧消毒。注意；2）、3）要在超净工作台进行。
3、如何控制污染：污染的病原主要分细菌和真菌两大类。细菌：菌斑呈粘液状，接种后1-3天即可发现；真菌：污污染部分张有不同颜的霉菌，接种或10-30天发现。1、操作环节：1）改善环境条件2）严格执行无菌操作3）严查接种材料 2、内源细菌 ：1）在培养基中加入杀菌剂 2）反复茎尖培养 3）降低PH值
4、配置母液及配制培养基的基本流程
第4章 植物胚胎培养及离体授粉
掌握1、幼胚培养中的三种不同的生长方式：1)胚胎发育， 维持正常的胚性生长，形成成
熟胚再按种子萌发途径出苗形成完整植株。2）早熟萌发，不能为耻正常得培性发育，超过正常胚发育阶段，在未达到生理和性成熟的情况下，萌发形成幼苗。3）形成愈伤组织，多数情况下，幼胚在离体培养中，首先细胞分裂形成愈伤组织，再分化形成植株。
2、胚培养的方法和和影响因素
幼胚培养的方法：固体培养基、胚乳看护培养
影响因素；1）培养基；无机盐：成熟胚培养常采用简单培养基(Tukey\Randolpn\White) 幼胚培养基（MS：钾离子、钙离子的水平较高，铵离子的水平低）碳水化合物：糖在胚培养中的作用：a,调节培养基渗透压b作为碳源和能源c，防止幼胚早熟萌发 成熟胚的蔗糖浓度约为2%,幼胚培养时较高：其他成分，水解咯蛋白：抑制早熟萌发作用 维生素（硫胺素、吡哆醇、烟酸、泛酸钙）植物生长调节剂：幼胚培养的关键问题是使加入的外源生长调节物质与植物内源激素间保持某种平衡，以维持幼胚的胚性生长。天然有机物 2）、环境条件：温度，25--30度；光照：幼胚培养是黑暗或弱光 3）、胚柄，对幼胚的存活是关键
3、胚乳培养的最佳取材时期（处于旺盛生长期的）影响其培养的因素：1）培养基与培养条件常用的培养基有White、MS、LS、MT培养基中还要添加一些有机物，如水解酪蛋白和酵母提取物等，而而且同时加入细胞分裂素和生长素，其诱导愈伤组织的能力优于单一的使用细胞分裂素或生长素蔗糖浓度一般为3%--5%；2）胚在胚乳培养中的作用：胚乳培养中，通常有带胚培养和不带胚培养两种方式，带带胚培养更易形成愈伤组织，当形成愈伤组织后，除去胚并不影响胚乳的组织的增繁殖；3），胚乳发生型和发育程度
4、胚珠和子房培养的方法 1）胚珠培养是指将授粉的子房在无菌条件下解剖后，取出胚珠置于培养基中培养的过程。胚珠培养的方法：材料的选择和灭菌，培养基对胚乳培养的影响，胚座和子房对胚珠培养的影响，胚发育时期的影响。2）子房培养是指将子房从母体上分离下来，置于培养基上，使其进一步发育成幼苗的技术。子房是雌蕊基部膨大的部分，由子房壁、胎座和胚珠组成。培养的方法：子房外植体的准备，子房培养的方法，培养子房的发育。
5、离体授粉的概念和分类 离体授粉（试管受精）是指将未授粉的子房或胚珠从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌授粉，使之在试管内实现受精的技术。
意义在于克服远源杂交过程中受精前障碍，获得可育性种子。根据无菌花粉授予离体雌蕊的位置，分为离体柱头授粉、离体子房授粉、离体胚珠授粉。
6、离体授粉的程序及影响因素 1）离体授粉的程序：确定开花、花药开裂、授粉、花粉管进入胚珠和受精的时间，去雄后将花蕾套袋隔离，制备无菌子房或胚珠，采集花粉，试管受精。 采集花粉：把尚未开裂的花药从花蕾中取出，至于无菌培养皿上直至花药开裂，从已开放的花中摘取花药，将花药进行表面消毒。 离体授粉成功的标志是授粉后能由子房或胚珠形成有生活力的种子。2）影响因素：外植体a、柱头和花柱的影响b、胎座的影响c、外植体的生理状态。培养基 常用于离体授粉的培养基有Nitsch,White,MS等，钙离子具有刺激花粉萌发和花粉管生长的作用，有机附加物是水解酪蛋白、椰子汁、酵母提取液等。加入少量激动素、生长素，能提高子房的结实数。培养条件：黑暗或弱光，20--25度。
了解7,、胚培养的四个应用：1）克服远源杂交不亲和性2）打破种子休眠，缩短育种周期3）提高种子萌发率4）克服种子的自然不育性。 胚乳培养的应用：1）、获得三倍体幼苗或植株 2）、得到不同染体组合的胚乳植株，染体工程3）、为研究淀粉、蛋白质、脂类的生物合成及其代谢提供良好的试验系统。
第5章 植物花药和花粉培养（离体培养的花药和花粉，使小孢子改变原有的配子体发育途径，转为孢子体发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株，并从种鉴定出单倍体植株后，使之二倍体的技术）
掌握1、花粉培养的方法（选幼年树花蕾--取下花蕾--低温处理--消毒--预培养数天取花药）1)花药分离和纯化：自然散落法、挤压法、机械游离法。2）材料消毒：花蕾用v/v为70%的酒精浸泡30s，无菌水清洗，无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分，放入0.1%的溶液中2-4分钟，无菌水冲洗3-5次3）培养方式：平板培养（固化培养基上培养，形成花粉胚状体）、液体培养（液体浅层培养、悬浮培养）、双层培养（下固上液）、看护培养（花粉-滤纸-固体培养基）微室培养、条件培养基4）培养基选择Nitsch,MS常用于双子叶植物花药培养，No则用于单子叶植物花药培养
2、单倍体植株的应用1）培养单倍体植株，单倍体育种，缩短育种年限，加速F1代杂合体的纯化2）培养多倍体植株3）加速获得自交系4）突变体选择，排除显隐性基因的干扰。
3、花药和花粉培养取材时要注意什么1）花粉发育时期的选择：一般情况下，对大多数植株来说，在单核时期的花粉比较容易培养成功，确定花粉发育时期的方法可用涂片发来进
行，四分体--单核早期--单核中期--单核晚期--双核期--三核期金丝雀定位 ，在培养花药之前，需要制片镜检（醋酸洋红)，确定花粉发育时期。2）基因型 供体植株遗传背景，对花药和花药培养成败至关重要，在进行花药和花粉培养时，应选择那些容易成功的材料。3）生理状态的选择 短日照与低温 4）材料处理对花粉培养的影响：低温处理（作用机理：改变第一次有丝分裂的纺锤体轴向，形成两个均等的细胞；使使花粉保持较长时间活性)、离心处理、乙烯处理（促使花粉细胞和发生分裂）
4、花药和花粉培养预处理的方法有：高低温处理，离心，使用乙烯剂促进愈伤组织的形成。5、花药和花粉培养分化途径有哪些花粉植株的形态发育有两种途径；胚状体发育途径和愈伤组织发育途径。
第6章 植物细胞培养
植物细胞培养是指对植物器官和愈伤组织上分离出单细胞（或小细胞团）进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。
细胞培养的意义在于：1）有利于进行细胞生理代谢及各种不同物质对细胞代谢影响的研究
2）通过单细胞克隆化，即细胞克隆，可以把微生物遗传技术应用于高等植物，进行农作物的改良。3）细胞培养的繁殖速度快，适合大规模悬浮培养，把植物组织培养像微生物一样应用于发酵产业，生产一些特有的产物
掌握：1分离单细胞的方法：（物理法、化学法）1）机械法：先将叶片组织轻轻研碎，或用组织捣碎机将组织细胞破碎，然后再通过过滤和离心将细胞纯化。具体方法是：在在研钵中放入10g叶片和40ml研磨介质（20umol调节臂蔗糖+10umolMgcl2+20umolTris+HCL缓冲液，Ph7.8）轻轻轻研磨之后，将匀浆用两层细纱布过滤，滤液经过低速离心，游离细胞就会沉降到细胞底部，得到纯化细胞。 特点是：细胞不受酶的伤害，不会发生质壁分离。一般机械法分离的细胞能够分裂形成愈伤组织，只有再薄壁细胞组织排列松散、细胞间接触面积很小时，用机械法分离细胞才能成功。2）酶解法：利用果胶酶处理植物叶片，使细胞间的中胶层发生降解，分离出具有代谢活性的细胞。具体方法：首先取烟草植株上充分展开的叶片进行表面消毒，无菌蒸馏水冲洗干净，用镊子撕取下表皮，用解剖刀将死去下表皮的叶片切成4*4的小块，放入经过过滤灭菌的酶液（果胶酶0.5%+甘露醇0.8%+硫酸葡聚糖钾1%），用真空泵抽气，使酶液渗入叶肉组织内，在摇床上保温培养，每30min更换一次酶液，将第一次30min后换出的酶液弃掉，第二次30min后，酶液中主要分离出海绵薄壁细胞，第三次和第四次主要分离出栅栏细胞。3）由培养的愈伤组织中分离出单细胞，首先通过固体培养基诱导外植体脱分化，把未分化和易散碎的愈伤组织转移到装有液体培养基的三角瓶中，将这些悬浮培养物在摇床上进行震荡培养，并得到游离细胞。震荡的作用：
对细胞团施加一定的缓和压力，使之破碎成小细胞团或单细胞促进培养基和容器内的气体交换，保证细胞正常的呼吸代谢。 2、单细胞培养的基本方法有哪几种方法 由于培养集中细胞在遗传和生理生化上会出现变异，形成的植株也表现出一定差异，反映在产量、品质、抗虫性和抗逆性等方面。1）平板培养（最常用）：将悬浮培养的细胞接种到未固化的薄壁培养基中，使其与培养基充分融合，再倒入培养皿中进行培养的方法。具体做法：先进行过滤，除去较大的细胞团，留下游离的单细胞和小细胞团，过滤的悬浮培养材料先进行细胞计数，是悬浮培养达到最终要求的细胞培养密度。将含有0.6%-1%蓝牙对讲的琼脂的培养基进行灭菌后，冷却到负离子节能灯35度，放到恒温水浴中，将细胞悬浮液接种进去，充分融合后倒入培养皿中，当培养基凝固后，细胞能够均匀分布并固定在很薄一层的培养基中，最后将培养皿放在25度条件下暗培养，经过25天再计数每只培养皿中出现细胞团的数目。2）看护培养：将单细胞放在一块活跃生长的愈伤组织上进行培养，愈伤组织和培养的细胞之间有一片滤纸相隔3）微室培养：将细胞放到人工制造的一个小室中进行培养的方法。优点;在培养过程中可以进行连续观察，把一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全过程记录下来。但不适合大量培养。4）条件培养基培养：在培养基中加入高密度的细胞进行培养，一定时间后这些细胞就会向培养基中分泌一些促进细胞生长的活性物质，使培养基条件化，
是原来在合成培养基上不能分裂的细胞分裂。在培养基上培养过一定时间一定材料的培养基均可为条件培养基。
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