铁皮石斛外植体可选择叶片、茎段、种子、细胞、组织等器官，但为了适合药用铁皮石斛工厂化育苗的需要，通常选用未成熟种子（未成熟胚）作为外植体，有时也可选择茎段作为外植体。 1．种子作为外植体
1.1种子的制备及消毒
每年5-6月对铁皮石斛的亲本进行人工授粉，11月取未成熟蒴果，带入实验室，用流水冲洗2～3min，去污剂浸泡10min（其间不时摇晃），然后流水冲洗10min，带入超净工作台，先用70%酒精浸润30s，0.1%浸泡5～10min，无菌水冲洗3～5次，备用。
1.2铁皮石斛无菌播种
将铁皮石斛蒴果置于无菌纸上，用解剖刀将蒴果切开，将种子匀均播种于原球茎诱导培养基（改良N6+NAA0.5mg/L+马铃薯提取液80g/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH5.6）中，置于培养室中培养，培养条件为25±2℃，光照1000Lx，光照周期12h/d（开始7天给予暗培养），培养3个月后，铁皮石斛种子被诱导成原球茎（图9-3）。 a b c
图9-3 铁皮石斛播种后培养不同时间原球茎诱导情况
a.播种30d；
b.播种60d；
c.播种90d
1.3原球茎分化增殖与壮苗生根培养
将原球茎转接至铁皮石斛分化增殖培养基（改良N6+NAA1.0mg/L+香蕉汁80g/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH5.6）中，置于培养室中培养，培养条件为25±2℃，光照1500Lx，光照周期12h/d，培养3个月后，原球茎分化成苗（图9-4），再将分化出的幼苗重新转接至壮苗生根培养基（改良N6+NAA1~2mg/L+香蕉汁80g/L+活性炭18g/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH5.6）中，每瓶接种20～25株（以550ml兰花瓶计），从转接至培养3个月即可出瓶移栽（图9-5～图9-7）。
a b c
图9-4 铁皮石斛原球茎分化培养
a. 分化培养7d
b. 分化培养45d
美微乳c.分化培养75d
图9-5 铁皮石斛试管苗生产车间接种室（照片由厦门塔斯曼生物工程有限公司提供）
图9-6 铁皮石斛试管苗生产车间培养室（照片由四川千草生物技术股份有限公司提供）
塑料染图9-7 铁皮石斛试管苗（照片由四川千草生物技术股份有限公司提供）
2．以铁皮石斛茎段作为外植体
2.1茎段的预处理及消毒
将铁皮石斛带节的茎段先用洗洁精清洗干净，剥去叶片和膜质叶鞘，流水冲洗10～5
分钟，剪成1～1.5cm的带节小段，带入超净工作台，先用75%酒精浸润30s，用0.1%浸泡10min，无菌水漂洗4～5次，最后用无菌滤纸吸干水分。
粉尘收集2.2茎段的初代培养分质供水设备
将铁皮石斛茎段接入初代培养基（½MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖3%+活性炭
倒挂器0.8g/L+琼脂7g/L），置于25±2℃，光照强度1500Lx，光照周期12h/d条件下进行培养，培养中每25d继代一次，75d后可获得茎段腋芽。
2.3丛生芽诱导
将铁皮石斛初代培养产生的腋芽从茎段上切下，重新接种到丛生芽诱导培养基
（½MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖3%+活性炭0.8g/L+琼脂7g/L）上，置于25±2℃，光照强度1500Lx，光照周期12h/d条件下进行培养40d，可在腋芽基部产生大量的丛生芽簇，增殖系数可达5以上，产生的丛生芽簇可继续切割增殖培养，也可用于壮苗生根培养。
2.4壮苗生根培养
将铁皮石斛丛生芽诱导培养中产生的丛生芽簇切割成单芽，重新接种到壮苗生根培养基（½MS+IBA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖3%+活性炭0.8g/L+琼脂7g/L），培养条件为25±2℃，光照强度1500Lx，光照周期12h/d，培养90～120d后，铁皮石斛小苗长至3cm高，有3～4条根，即可移栽。
1．驯化：铁皮石斛驯化采用瓶内驯化的方式，将铁皮石斛组培苗置于温室中，不开盖驯化10d，然后打开瓶盖再驯化3d。
2．洗苗：将铁皮石斛组培苗从瓶中取出，用清水仔细洗去基部的培养基，然后用0.8%高锰酸钾溶液浸根30s，置于通风处将根晾干即可移栽。
3．基质准备：铁皮石斛基质要求通气、透水，通常铁皮石斛的基质以松鳞：石子=2-3：1的比例进行配制。 4．移栽：铁皮石斛栽培可以采用容器栽培（图9-9）、地面栽培（图9-10）或苗床栽培（图9-11），容器栽培即将基质置于花盆或穴盘内，然后将铁皮石斛组培苗栽种于其中，每丛3株左右；苗床栽培
需在苗床上铺设3cm左右石子，石子上方铺设10cm左右基质，将组培苗种植其中，每丛3株左右，株行距为10×10cm～15×15cm。
图9-8 容器栽培
图9-9 地面栽培
图9-10苗床栽培
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