王邹璐琪1，李立煌1，李丹阳1，艾超超1，任磊1,*，孙本强2,*
（1.厦门大学材料学院，福建厦门361005；2.厦门医学院附属口腔医院，福建厦门361005）
摘 要：构建下转换荧光-适配体免疫层析试纸条用于食品中黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的快速高效检测。体系中AFB1存在会减弱下转换荧光-适配体纳米颗粒层析至T线时与AFB1半抗原的结合能力，从而导致下转换荧光信号衰减，进而实现对AFB1的高效检测。该方法在AFB1质量浓度1～40 ng/mL范围内与荧光信号呈良好的线性关系，线性相关系数为0.994，检测限为0.287 ng/mL。该方法利用稀土掺杂荧光纳米颗粒的长寿命发光及近红外荧光特性，有效降低了生物背景荧光干扰并提高了检测体系的特异性。该方法在AFB1的快速高灵敏检测中具有良好的应用前景。
关键词：稀土掺杂荧光纳米颗粒；荧光免疫层析；黄曲霉毒素B1；快速检测
Construction of Down-conversion Fluorescence-Aptamer Immunochromatographic Strip for Rapid Detection of Aflatoxin B1 WANG Zouluqi1, LI Lihuang1, LI Danyang1, AI Chaochao1, REN Lei1,*, SUN Benqiang2,*
优化训练
(1. College of Materials, Xiamen University, Xiamen361005, China;
2. Stomatological Hospital of Xiamen Medical College, Xiamen361005, China)
Abstract: In this study, a down-conversion fluorescence-aptamer immunochromatographic strip was constructed for the rapid and efficient detection of aflatoxin B1 (AFB1) in foods. The presence of AFB1 in the system will weaken the binding ability of down-conversion-aptamer fluorescent nanoparticles to the hapten AFB1 when down-conversion-aptamer fluorescent nanoparticles reach the T-line, thus leading to the attenuation of down-conversion fluorescence signal and consequently highly efficient detection of AFB1. In the range of 1–40 ng/mL, the concentration of AFB1 had a good linear relationship with the fluorescence signal, showing a correlation coefficient of 0.994, and the detection limit for AFB1 was
0.287 ng/mL. By taking advantage of the long-lived luminescence and the near infrared fluorescence characteristics of rare
earth doped fluorescent nanoparticles, this method effectively reduced the interference of biological background fluorescence and improved the specificity of the detection system, making it a promising candidate for application in the rapid and sensitive detection of AFB1.
Keywords: rare earth doped fluorescent nanoparticles; fluorescence immunochromatographic assay; aflatoxin B1; rapid detection DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191030-337
中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2021）12-0295-07引文格式：
王邹璐琪, 李立煌, 李丹阳, 等. 构建下转换荧光-适配体的免疫层析试纸条用于快速检测黄曲霉毒素B1[J]. 食品科学, 2021, 42(12): 295-301. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191030-337.
WANG Zouluqi, LI Lihuang, LI Danyang, et al. Construction of down-conversion fluorescence-aptamer immunochromatographic strip for rapid detection of aflatoxin B1[J]. Food Science, 2021, 42(12): 295-301. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191030-337.
收稿日期：2019-10-30
基金项目：福建省自然科学基金项目（2017Y0078）；国家自然科学基金面上项目（31870994）
第一作者简介：王邹璐琪（1996—）（ORCID: 0000-0002-7715-1267），女，硕士研究生，研究方
向为生物医学材料。
E-mail:****************
*通信作者简介：任磊（1968—）（ORCID: 0000-0003-2131-1601），女，教授，博士，研究方向为生物医学材料。
E-mail:**************
孙本强（1968—）（ORCID: 0000-0003-4573-7981），男，副主任医师，学士，研究方向为生物医学材料。
E-mail:********************
黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉等菌株代谢产生的天然真菌毒素，目前已分离出十几种类型[1-2]。国际癌症研究机构将黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、黄曲霉毒素B2（aflatoxin B2，AFB2）、黄曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1）和黄曲霉毒素G2（aflatoxin G2，AFG2）列为人类致癌物。其中AFB1对于人类和动物而言毒性最强，具有肝毒性、致畸性和致突变性，可引起慢性肝炎、肝硬化、肝坏死等损害[3-5]。AFB1广泛存在于发霉的粮食谷物中，微量的AFB1存在就可能对人类健康产生严重危害[6-7]。因此开发一种快速检测AFB1的方法对于食品安全具有重大意义。
目前，根据GB 5009.22—2016《食品中黄曲霉毒素B 族和G族的测定》，检测AFB1的谱法主要包括薄层谱法、高效液相谱-柱前衍生法、高效液相谱-柱后衍生法等。虽然谱法能定量检测AFB1，但处理样本过程较为复杂，检测时间长且不能同时检测多个样品，因此谱法的使用范围受限[8-12]。检测AFB1的免疫分析法即酶联免疫吸附筛查法，相比于谱法，具有样本处理简单、能同时检测多个样品、高特异性等优点[13-14]。然而，酶联免疫吸附筛查法中使用的抗体价格昂贵，限制了酶联免疫吸附筛查法在现场检测AFB1方面的应用[15]。
核酸适配体是一段DNA或RNA的寡核苷酸，能够通过分子内相互作用折叠成独特的三级构象，与靶向分子特异性结合[16]。与抗体相比，核酸适配体具有易于制备、成本低、可重复使用、不受物理或化学不稳定性及潜在免疫原性的困扰等优势，在免疫层析检测领域具有广阔的应用前景[17-18]。荧光免疫层析技术是以免疫分析技术、谱分析技术及荧光技术为基础而发展起来的新型免疫检测技术[19-21]。该技术不仅结合了免疫分析技术与谱分析技术的优势，还结合了荧光技术而提高了检测灵敏度并缩短了检测时间，已广泛应用于生物医学检测、食品药品监控等领域[22]。
稀土掺杂的下转换荧光纳米颗粒（down-conversion fluorescent nanoparticles，DCNPs）相比于传统的荧光材料具有发光稳定、毒性低、耐光化学降解、荧光寿命长等优势，因而在免疫层析检测领域具有应用潜力[23]。由于DCNPs具有长的荧光寿命特点，可通过时间分辨荧光技术区别低检测限的生物标记物如抗原和核酸，有效消除背景荧光的干扰[24]。因此利用DCNPs作为免疫层析检测的标记探针，
中轴旋转门
能够显著提高对待测物的检测灵敏度及检测特异性。
为此，本研究将DCNPs与AFB1核酸适配体相结合，构建一种具有低成本、快速、抗干扰性强、灵敏度高等优点的新型下转换荧光-适配体免疫层析试纸条，以期实现对AFB1的快速痕量精准检测。1 材料与方法
1.1 材料与试剂
散装花生厦门市新华都超市厦大店；食用油 中粮福临门食品有限公司；面条河北金沙河集团。
六水合氯化铕（E u C l3·6H2O）、油酸钠（NaOA）、六水合氯化钇（YCl3·6H2O）、氟化铵（NH4F）、聚丙烯酸（polyacrylic acid，PAA）美国Sigma公司；N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，N H S）、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydro，EDC）吉尔生化（上海）有限公司；玻璃纤维素膜（NC膜）、吸水垫、样品垫、PVC板厦门信德科创生物科技有限公司；AFB1标准品、链霉亲和素、AFB1偶联抗原（AFB1-BSA）、AFB1适配体、适配体互补DNA 生工生物工程（上海）股份有限公司；实验中所用试剂均为分析纯。
氨基修饰的AFB1适配体序列：5’-NH2-TT TTT TTT TTT TTT GTT GGG CAC GTG TTG TCTC TCT
GTG TCT CGT GCC CTT CGC TAG GCC CACA-3’；生物素修饰在DNA末端，DNA探针序列：5’-AAA AAA AAA AAA AA-3’。
1.2 仪器与设备
FLS980荧光光谱仪爱丁堡科学仪器有限公司；JEM2100型高分辨透射电子显微镜日本JEOL公司；Is10红外光谱仪赛默飞世尔科技（中国）有限公司；UV-2550型紫外-分光光度计岛津企业管理（中国）有限公司；免疫荧光分析仪厦门信德科创生物科技有限公司。
1.3 方法
金刚石碎片
1.3.1 适配体偶联荧光纳米颗粒的制备
参考文献[25]，通过高温溶剂热法制备油相DCNPs。制备过程如下：在超纯水、无水乙醇和正己烷体积比为3∶4∶7的混合溶液中加入物质的量比为1∶3的EuCl3·6H2O 与NaOA，1 000 r/min快速搅拌下升温至70 ℃，冷凝回流4 h。待反应自然冷却后，静置过夜，收集上清液通过旋蒸法获得前驱体油酸铒Eu(OA)3。用Y3Cl·6H2O替换Eu3Cl·6H2O，依据相同操作获得前驱体油酸钇Y(OA)3。在体积比为3∶7的油酸（oleic acid，OA）与1-十八烯（1-octadecene，ODE）的混合溶液中加入物质的量比为0.2∶0.3∶0.125∶2的Eu(OA)3、Y(OA)3、NaOH及NH4F，在N2氛围下升温至300 ℃，反应1 h。将生成的油相DCNPs 在12 000 r/min离心20 min收集，溶于甲苯中并配制为10 mg/mL备用。
参考文献[26]方法，通过配体交换法使用聚丙烯酸（polyacrylic acid，PAA）置换掉DCNPs表面OA配体，
从而获得羧基化水相DCNPs。制备过程如下：取体积比为8∶1的二乙二醇与PAA混合溶液在N2氛围下加热至80 ℃，再加入1 mL质量浓度为10 mg/mL的溶于甲苯的NaYF4∶Eu纳米颗粒。将溶液升温至240 ℃，反应1 h。反应结束后以12 000 r/min离心20 min收集样品，并用纯水离心清洗3 遍，将样品溶解于磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）中并配制为0.1 mg/mL溶液置于4 ℃保存备用。
采用经典的EDC/NHS法将羧基化修饰的DCNPs与氨基修饰的AFB1适配体进行偶联。取5 mL质量浓度为0.1 mg/mL溶有DCNPs的PBS，避光条件下加入10 mg的EDC和10 mg的NHS进行活化，1 h后加入0.3 mg氨基修饰的AFB1适配体，反应24 h，12 000 r/min离心10 min收集产物，并置于4 ℃冰箱内备用。
1.3.2下转换荧光-适配体免疫层析试纸条的构建
取400 μL的PBS溶液、50 μL的0.3 mg/mL生物素修饰的DNA及50 μL的2 mg/mL链霉亲和素，在室温下共孵育1 h。以12 000 r/min离心30 min，去除未反应的生物素修饰的DNA，将产物溶于500 μL的PBS，置于4 ℃冰箱内备用。
取质量浓度为0.8 mg/mL的AFB1-BSA溶液和上述制备的链霉亲和素偶联溶液，通过划线机以0.8 cm的间距分别喷涂到NC膜上形成T/C线。待T/C线构建后，将NC 膜、吸水垫和样品垫按图1的顺序组装在PVC底板，并切成8 cm的长条，放置于干燥处保存备用。
车位管理系统
ṧ T㓯C㓯
≤
㓔㔤㍐㟌AFB
1
-BSA
T C
DNA-SA
图 1 下转换荧光-适配体的免疫层析试纸条示意图
Fig. 1 Schematic diagram showing the fabrication of down-conversion fluorescence-aptamer immun
ochromatographic test strip
1.3.3AFB1的检测
将AFB1标准品配制成不同质量浓度的标准溶液，将其与等体积AFB1适配体DNA修饰的DCNPs共孵育10 min。取50 μL滴加在样品垫上，待试纸条晾干后，用荧光免疫分析仪读取T/C线的荧光信号。每次独立实验进行5 次平行实验，所得数据取平均值进行分析。
1.3.4实际样品的检测
称取实际样品（花生、食用油、面条、发霉花生）2 g，研磨粉碎并加入2 mL的70%甲醇溶液，振荡5 min后以4 000 r/min离心5 min。取上清液加入等体积超纯水。将实际样品提取物与等体积AFB1适配体DNA修饰的DCNPs 共孵育10 min，并用所构建的AFB1试纸条进行检测。2 结果与分析
2.1 DCNPs的表征
基于高温溶剂热法制备了DCNPs，通过透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）、高分辨透射电子显微镜（high resolution transmission electron microscope，HRTEM）以及选区电子衍射（selected area electron diffraction，SAED）表征（图2a～c）可以看出，DCNPs对应（100）晶面的晶格间距为0.51 nm。由计算可得，晶面衍射环分别对应（100）、（110）、（111）
及（211）晶面。从X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）表征（图2d）可看出，DCNPs与NaYF4的标准晶体衍射峰（JCPDS∶28-1192）一致，因此DCNPs与NaYF4晶体有相同晶格，且无其他晶体产生。由DCNPs的制备过程可知，可能有杂质NaCl产生，结合能量散X 射线光谱（energy dispersive X-ray spectroscopy，EDX）分析结果（图2e）可知，并无Cl元素产生，表明所制备的DCNPs中无其他杂质生成。
100 nm 5 nm
m
˄
˄
˄
˄
a b c
20
d
1030405060
NaYF4
7080
2θ/˄°
˅
㜭䟿/keV
e
a. TEM图；
b. HRTEM图；
c. SAED图；
d. XRD图；
e. EDX图。
图 2 DCNPs的表征
Fig. 2 Characterization of DCNPs
通过配体交换以及EDC/NHS法制备了适配体DNA 修饰的DCNPs，用于荧光免疫层析定量检测AFB1。通过TEM表征（图2a、3a、3b）可以看出，在经过PAA 及DNA配体修饰后的纳米颗粒（DCNPs/PAA/DNA）
的粒径略有增加，这与水合粒径表征一致（图3c ）。DCNPs 表面电位为20.6 mV ，随着PAA 和适配
体DNA 修饰后变为－23.5 mV 和0 mV （图3c ），较强的表面负电位有利于粒子在溶液中单分散，因此在TEM 图中，PAA 修饰后的荧光纳米颗粒（DCNPs /PAA ）分散性最好。从傅里叶转换红外光谱（Fourier-transform infrared spectroscopy ，FTIR ）表征结果（图3d ）可以看出，在经过PAA 配体交换后，DCNPs /PAA 显示出归属于PAA 在1 732 cm －1
处的C ＝O 特征吸收峰，表明经配体交换后，
其表面带有羧基（—COOH ），DCNPs 成功转变为水溶性的DCNPs /PAA ；AFB 1的DNA 适配体连接后（DCNPs /PAA /DNA ），C ＝O 特征峰发生红移，出现了N —H 伸缩振动吸收峰（3 387 cm －1）及O —H 伸缩振动吸收峰（3 504 cm －1
），主要与DNA 的结构有关，表明其成功地被适配体DNA 修饰。此外，从紫外-可见（ultraviolet-visible ，UV-vis ）吸收光谱可以看出，经过适配体DNA 修饰后，DCNPs /PAA /DNA 在275 nm 波长处显示出典型的适配体DNA 吸收峰（图3e ）。这些结果表明PAA 成功将DCNPs 表面的OA 配体进行有效置换，并且成功将适配体DNA 修饰于DCNPs /PAA 上。DCNPs /PAA /DNA 相比DNCPs 和DCNPs /PAA 在615 nm 波长处的荧光强度衰减仅为8.1%和3.4%（图3f ），表明经PAA 配体交换后及适配体DNA 修饰后的DCNPs /PAA /DNA 仍保持较高的荧光特性，有利于AFB 1的荧光免疫层析检测。此
外，所构建的DCNPs /PAA /DNA 在615 nm 波长处的荧光寿命可达到5.58 ms （图3g ），对比传统的半导体荧光量子点（CdS 、ZnSe 等）的荧光寿命仅为15～50 ns [27-29]。DCNPs 较长的荧光寿命可用于时间分辨荧光检测技术领域，从而有效降低生物背景荧光的干扰，进一步提高检测灵敏度及特异性。
a
b
3015904560750
0ˉ15304515ˉ30
㋂ /n m
Zeta ⭥ս/mV
D C N
D C N P
s /P A D C N
P s /P A A /D N 4 000
草甘膦母液
3 000 2 000
1 000
⌒ /cm ˉ1
DCNPs
DCNPs/PAA
DCNPs/PAA/DNA
d
200250300
400450350500
⌒䮯/nm
DCNPs
DCNPs/PAA
DCNPs/PAA/DNA
0.40.20.1
0.30.50.0
e
450500550
650700600750
⌒䮯/nm
DCNPs
DCNPs/PAA
DCNPs/PAA/DNA
1.60.80.4
1.2
2.00.0㦗 ˄h 106˅
f
䰤/ms
㦗
a 、b.分别为DCNPs /PAA 、DCNPs /PAA /DNA 透射电子显微镜图；c.平均粒径及Zeta 电位结果；d. FTIR ；e. UV-vis 光谱；f.荧光光谱；g. DCNPs /PAA /DNA 在615 nm 波长处的荧光寿命曲线。图 3 DCNPs 、DCNPs /PAA 和DCNPs /PAA /DNA 的材料表征Fig. 3
Characterization of DCNPs, DCNPs /PAA and DCNPs /PAA /DNA
2.2 基于荧光免疫层析法检测AFB 1
构建的下转换荧光-适配体免疫层析试纸条的检测原理如图4所示。取适配体DNA 修饰的DCNPs 与检测样本
共混，若检测样本中没有AFB 1，则该适配体DNA 修饰的DCNPs 随着层析向右移动到检测区后，表面的AFB 1适配体与T 线上的AFB 1-BSA 特异性识别从而可以被检出检测荧光峰（F T ）。当适配体DNA 修饰的DCNPs 层析到质控区后，表面修饰的适配体DNA 末端的T 14与C 线上的生物素修饰的DNA 与链霉亲和素偶联的复合物（SA-A 14）识别并结合，从而截留在上面可以被检出质控荧光峰（F C ）。即两条线均显示出荧光信号时，结果为阴性。若检测样本中存在AFB 1时，DCNPs 适配体先与AFB 1识
别形成DCNPs-AFB 1复合结构，随着样本中AFB 1含量的增加，DCNPs 与T 线的结合量逐渐减少，
导致检出F T 值降低。而在质控区识别的机制与AFB 1质量浓度无关，因此所检出的F C 值较为稳定。根据F T 和F C 的比值，即F T /F C ， 可以实现对AFB 1的检测同时较大程度消除背景噪声信号及不同批次实验间的干扰。检测样本的AFB 1质量浓度
越大，T 线检出的F T 值越弱，对应的F T /F C 也越小。根据这一原理，可以在一定区间内获得荧光信号与AFB 1质量浓度依赖的线性关系，从而应用于对AFB 1含量的精确检测。
䱤
䱣
㦗 ⯛ Ԛ⍻䈅
AFB 1-BSA DCNP S -Ṩ䞨䘲䝽փ ⍻⏢DNA-SA
图 4 下转换荧光-适配体免疫层析试纸条检测AFB 1原理
Fig. 4
Schematic diagram showing the principle of down-conversion
fluorescent-aptamer immunochromatographic test strip for detecting AFB 1
2.3 检测条件的优化
2.3.1
样品溶液pH 值对试纸条检测的影响
样品溶液pH 值对适配体DNA 修饰的DCNPs 解离平衡
影响较大，从而影响检测的灵敏度，因此有必要对样品溶液的pH 值进行研究（图5）。结果表明，在相同条件下，当样品溶液为酸性时，F T /F C 值较小；当样品溶液为中性时，F T /F C 值较样品溶液为酸性时高；当样品溶液为碱性且pH 8时，F T /F C 值达最大，在此条件下，最有利于检测的灵敏度。因此，选择pH 8的样品溶液进行AFB 1的
检测。
0.40.21.20.60.81.00.0
F T /F C
5
6
78
9
pH
图 5
AFB 1溶液pH 值对试纸条的影响
Fig. 5
Effect of pH of AFB 1 solution on test strip performance
2.3.2 样品溶液甲醇体积分数对试纸条检测的影响
AFB 1在有机溶剂中具有较大的溶解度，甲醇是AFB 1
的常用溶剂，探究样品溶液中甲醇含量对于AFB 1实际样品检测具有重要意义。如图6所示，甲醇体积分数为15%时获得最大的F T /F C 值，表明该体积分数下最有利于检测的灵敏度。因此，选择含有15%
体积分数甲醇的样品溶液。
0.41.20.80.0
05
10152025
⭢䞷փ〟 /%
F T /F C
图 6
AFB 1溶液中甲醇体积分数对试纸条的影响
Fig. 6 Effect of methanol addition to AFB 1 solution on test strip performance
2.4
AFB 1的线性检测
配制含有不同质量浓度AFB 1的标准品溶液（甲醇体
积分数15%、pH 8），利用构建的下转换荧光-适配体的
免疫层析试纸条进行检测，再利用式（1）进行线性拟合可得，在AFB 1质量浓度为1～40 ng /mL 范围内与荧光信号呈良好的线性关系，线性相关系数为0.994。检测限的计算以AFB 1质量浓度为0时所检测到的（B 0－B ）/B 0值加上3 倍的标准误差下对应的质量浓度，经计算可得检测限为0.287 ng /m
L ，高于GB 2761—2011《食品中真菌毒素限量》中对于AFB 1的检测限（20 ng /mL ），表明构建的下转换荧光-适配体免疫层析试纸条对于AFB 1具有高灵敏检测作用。
＝ax ＋b B 0－B功率变送器原理
B 0
（1）
式中：B 0为空白样品中的F T /F C ；B 为含有AFB 1标准品时的F T /F C ；x 为AFB 1的质量浓度；a 为响应因子；b 为误差因子。2.5
试纸条检测的准确性与特异性
为了验证构建的下转换荧光-适配体免疫层析试纸条在检测中的准确性，选取不同质量浓度的标准样品AFB 1进行测试，结果如表1所示，由下转换荧光-适配体免疫层析试纸条检测AFB 1质量浓度与标准样品AFB 1质量浓度的相对误差均小于10%。
表 1
下转换荧光-适配体免疫层析试纸条检测AFB 1的结果Table 1
Results of AFB 1 detection by test strip
标准样品AFB 1
质量浓度/（ng /mL ）
检测AFB 1质量浓度/（ng /m L ）
相对误差/%
00.34 2.00 1.87 6.505.00 4.66 6.8010.009.128.8015.00
15.71
4.73
豫公网安备41160202000603
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