福建中医药2022年7月第53卷第7期
Fujian Journal of TCM July2022，53（7）
八宝丹抑制TNF-α诱导C2C12成肌细胞Atrogin-1表达的研究 赵棋琴1，陈进晓1，沃达2，何嘉1，彭军1，3，朱伟东2，任丹妮1，3*
（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122；
2.福建中医药大学科技创新与转化中心，福建福州350122；
3.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州350122）
摘要：目的研究八宝丹（BBD）对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的C2C12成肌细胞中核因子κB（NF-κB）通路及下游通路UPS系统中萎缩相关基因1（Atrogin-1）的作用。方法①筛选BBD干预浓度实验：取对数生长期C2C12成肌细胞分别予0、0.125、0.25、0.5、0.75、1mg/mL不同浓度BBD干预48h，采用MTT法检测细胞活力；②筛选TNF-α刺激细胞的浓度和时间实验：取对数生长期C2C12成肌细胞，分别予0、1、10、50ng/mL TNF-α蛋白液刺激C2C12成肌细胞，Western blot法检测p-P65、Atrogin-1蛋白表达以筛选出TNF-α刺激细胞的最佳浓度；再根据TNF-α刺激细胞的最佳浓度干预C2C12成肌细胞0mi n、8min、15min、30min、1h、4h，West⁃ern blot法检测p-P65、Atrogin-1蛋白筛选出TNF-α刺激细胞的最佳时间；③BBD干预实验：将C2C12成肌细胞随机分为空白对照组、药物对照组、模型组、八宝丹组，药物对照组和八宝丹组分别加入BBD预处理2h，再根据筛选的TNF-α刺激细胞最佳浓度和时间，于模型组和八宝丹组中加入TNF-α刺激细胞，Western blot法检测p-P65、Atrogin-1的蛋白表达水平。结果①筛选BBD干预浓度实验结果表明，不同浓度BBD对C2C12成肌细胞活力无影响（P＞0.05），根据本课题组前期研究结果，最终选取0.75mg/mL作为BBD干预细胞浓度；②筛选TNF-α刺激细胞的浓度和时间实验结果表明，10ng/mL TNF-α刺激C2C12成肌细胞8min后p-P65蛋白表达明显升高（P＜
0.05），10ng/mL TNF-α刺激C2C12成肌细胞4h后Atrogin-1蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）；③BBD干预实
验结果表明，与空白对照组比较，模型组p-P65、Atrogin-1蛋白表达显著上调（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，八宝丹组p-P65、Atrogin-1蛋白表达显著下调（P＜0.05，P＜0.01）。结论BBD可抑制TNF-α诱导的NF-κB 信号通路中NF-κB的磷酸化水平及下游通路Atrogin-1蛋白表达。
关键词：八宝丹；C2C12成肌细胞；TNF-α；p-P65；Atrogin-1
中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1000-338X（2022）07-0021-05陈蓉 海藻
穿孔塞焊癌症是全球主要死因之一［1］，50%的晚期癌症患者都患有癌症恶病质［2］，癌症恶病质是癌症患者死亡的主要原因［3］。骨骼肌萎缩是癌症恶病质最主要的临床表现，其与患者器官功能障碍、生活质量降低以及抗癌的耐受性和疗效性降低相关［4］。目前缺乏肌肉萎缩的有效药物，所以迫切需要研发新的药物［5］。炎症是骨骼肌萎缩的主要原因，肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）是重要的肌肉萎缩诱导因子［6］，核因子κB （nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路作为经典炎症信号通路，是炎症因子诱导肌肉萎缩的一个重要步骤［7-8］，NF-κB信号通路可被炎症因子TNF-α激活，导致肌肉蛋白降解主要信号通路——泛素蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）的关键组分泛素连接酶表达过度上调，最终使UPS系统处于高度应激状态［9-10］，肌肉蛋白降解增多［11］。萎缩相关基因1（atrophy gene1，Atrogin-1）是一种泛素连接酶，在骨骼肌中特异性表达，其过度表达会导致肌肉蛋白降解增多［12-13］。八宝丹（Babaodan，BBD）为我国经典复方，临床实践证明BBD作为多种晚期癌症辅助用药可提高患者生活质量，缓解化疗出现的不良反应［14］，由此可见BBD可以缓解晚期癌症患者出现的不良状态，但目前尚无BBD癌症恶病质肌肉萎缩的相关研究。故本课题拟通过体外实验探讨BBD对TNF-α诱导的NF-κB信号通路及下游通路UPS系统中Atrogin-1表达的作用机制研究，为BBD抑制肌蛋白降解相关通路提供了体外实验数据，也为癌症恶病质提供新的思路。
1实验材料
1.1实验细胞C2C12成肌细胞购于中国科学院细胞库（目录号：SCSP-505）。
1.2实验药物BBD购自厦门中药厂股份有限公司（批号：190530）。
1.3实验试剂p-P65抗体、p-IκB抗体（美国CST 公司，货号：3033T、2859S）；GAPDH抗体（美国Pro‑teintech公司，货号：60004-1-Ig）；Atrogin-1抗体（英
收稿日期：2022-02-23
基金项目：福建中医药大学产业横向课题（HX2020008）；福建中医
药大学高层次人才科研项目（X2019001-人才，2021001-
人才，2021002-人才，2021003-人才）；福建中医药大学
青年科研拔尖人才项目（XQB202201）
作者简介：赵棋琴（1996—），女，硕士研究生，主要从事中西医结
合防治肿瘤基础研究。
通信作者：任丹妮（1982—），女，医学博士，教授，博士生导师。
E-mail：*****************
21
福建中医药第53卷
国Abcam公司，货号：ab168372）；Goat-anti-Mouse-IgG、Goat-anti-Rabbit-IgG（美国Signaling Antibody
公司，货号：L3032、L3012）；DMEM不完全高糖培养液（江苏凯基生物技术有限公司，货号：KGM12800 N-500）；胎牛血清（PEAK Serum公司，货号：S-FBS-SA-015）；青霉素和链霉素混合液、0.4%台盼蓝染液、NP-40裂解液（北京索莱宝科技有限公司，货号：SV30010、C0040、N8032）；1×PBS缓冲液（南京维森特生物技术有限公司，货号：311-010-CL）；0.25%胰蛋白酶（美国Gibco公司，货号：25200072）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，货号：AR0197）；MTT试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0009S）；蛋白酶抑制剂Cock‑tail、磷酸酶抑制剂CocktailⅠ、磷酸酶抑制剂Cock‑tailⅡ（MCE公司，货号：HY-K0010，HY-K0021、HY-K0022）；SuperKine TM超敏型ECL发光液（Abbkine公司，货号：BMU102-CN）；TNF-α蛋白液（美国R&D Systems公司，货号：410-MT）。
1.4实验仪器CO2培养箱（美国Thermo Fisher公司）；超净工作台（苏州净化设备公司）；Countstar全自动细胞计数仪（上海睿钰生物科技有限公司）；倒置显微镜（德国Leica公司）；多功能酶标仪（美国Thermo Fisher公司）；干式恒温金属浴（上海培青科技有限公司）；SDS-PAGE电泳仪（美国Bio-Rad公司）；Trans-Blot小型转膜槽转膜仪（美国Bio-Rad 公司）；旋转摇床（中国江苏其林贝尔仪器有限公司）；超高灵敏化学发光系统（美国Bio-Rad公司）。2方法与结果
2.1BBD药液制备称取25mg BBD溶于1mL PBS 缓冲液，制备成25mg/mL BBD药液，储存于-20℃冰箱中。
2.2细胞培养将C2C12成肌细胞培养于含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素混合液的DMEM不完全高糖培养液中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞汇合度至70%~80%进行后续实验。2.3统计学方法采用SPSS26.0统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（xˉ±s）表示，2组比较采用独立样本t检验。
2.4MTT法筛选BBD干预细胞浓度将C2C12成肌细胞以3×103个/100μL的密度接种于96孔板中，每孔100μL，待各组细胞汇合度至70%~80%，弃上清液，分别予0、0.125、0.25、0.5、0.75、1mg/mL BBD药液干预48h，每种浓度6个复孔，48h后弃上清液，每孔加入浓度为0.5mg/mL MTT溶液100μL，培养箱内继续孵育4h，每孔再加入100μL Forma‑zan溶解液，适当混匀，使用酶标仪在570nm处测吸光度，根据公式计算细胞活力。水塔水位控制
MTT法实验结果显示，不同浓度BBD对C2C12
成肌细胞活力无明显影响，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。结合本课题组前期研究结果，最终选用0.75mg/mL作为后续实验BBD的干预浓度［15］。
2.5筛选TNF-α上调p-P65蛋白表达的浓度和时间按3×105个/mL的细胞密度，将对数生长期C2C12成肌细胞接种于35mm2培养皿中，待细胞汇合度至70%～80%，分别加入0、1、10、50ng/mL TNF-α蛋白液干预C2C12成肌细胞8min。NP-40裂解液提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒定量，细胞总蛋白中加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（还原性，5×），再将其置于100℃干式恒温金属浴变性。20～30μL蛋白样本经聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳完全分离后，TBST洗膜3次，通过湿转法将蛋白转至PVDF膜上，TBST洗膜3次，5%脱脂奶粉常温封闭1h，TBST洗膜，抗体p-P65（1∶1000），GAPDH（1∶5000）4℃孵育过夜，随后TBST 洗膜3次，加Goat-anti-Mouse-IgG或Goat-anti-Rab‑bit-IgG（1∶5000）室温孵育1h，TBST清洗3次，使用SuperKine™超敏型ECL发光液显，将GAPDH 作为总蛋白内参，运用Image J软件分析各目的蛋白的灰度值，比较不同TNF-α浓度对p-P65蛋白相对表达量的影响，结果见图2。与0ng/mL比较，10、50ng/mL TNF-α分别刺激细胞后，p-P65蛋白表达均明显上调（P＜0.05），最终选取TNF-α刺激浓度为10ng/mL。
再筛选TNF-α上调p-P65蛋白表达的最佳时间，按3×105个/mL的细胞密度，将对数生长期C2C12成肌
细胞接种于35mm2培养皿中，10ng/mL TNF-α蛋白液分别在8min、15min、30min、1h刺激细胞，提取细胞总蛋白及Western blot法操作同前，结果见图3，10ng/mL TNF-α刺激细胞8min显著上调p-P65蛋白表达（P＜0.05），最终选取10ng/mL TNF-α刺激细胞8min作为后续实验干预浓度和
时间。
图1不同浓度BBD对C2C12细胞活力的影响
22
赵棋琴等：八宝丹抑制TNF-α诱导C2C12成肌细胞Atrogin-1表达的研究
第7期2.6筛选TNF-α上调Atrogin-1蛋白表达的浓度和时间Atrogin-1为NF-κB 信号通路下游通路指标，对TNF-α蛋白反应时间不同，因此再筛选TNF-α上调Atrogin-1蛋白表达的浓度和时间。取对数生长期C2C12成肌细胞按3×105个/mL 的细胞密度接种于35mm 2培养皿中，待细胞汇合度至70%～80%，分别加入0、1、10、50ng /mL TNF-α蛋白液干预C2C12成肌细胞4h ，Western blot 法步骤同前，Atrogin-1和GAPDH 抗体稀释比例分别为1∶1000和1∶5000，结果见图4。与0ng /mL 比较，1、10、50ng /mL TNF-α刺激细胞后，Atrogin-1蛋白
表达明显上调（P ＜0.05），为与前刺激浓度一致，最
终选取TNF-α刺激浓度为10ng /mL 。
再筛选TNF-α上调Atrogin-1蛋白表达的最佳时间，将对数生长期C2C12成肌细胞按3×105个/mL 的细胞密度接种于35mm 2培养皿中，10ng /mL TNF-α蛋白液分别在8min 、15min 、30min 、1h 、4h 刺激细胞，Western blot 法操作同前，结果见图5。10ng /mL TNF-α刺激细胞4h 显著上调Atrogin-1蛋白表达（P ＜0.05），最终选取10ng /mL TNF-α刺激细胞4h超声波打磨机
作为后续实验干预浓度和时间。
羊毛鞋垫
注：与0ng /mL 组比较，1）P ＜0.05。
图4
不同TNF-α浓度对Atrogin-1
蛋白表达的影响
注：与0min 组比较，1）P ＜0.01。
图5
不同TNF-α刺激时间对Atrogin-1
蛋白表达的影响
注：与0ng /mL 组比较，1）P ＜0.05。
图2
不同TNF-α浓度对p-P65
蛋白表达的影响
注：与0min 组比较，1）P ＜0.05。
图3
不同TNF-α刺激时间对p-P65蛋白表达的影响
23
福建中医药第53卷
2.7BBD 对p-P65、Atrogin-1蛋白表达的作用按
3×105个/mL 的细胞密度，取对数生长期C2C12成肌细胞接种于35mm 2培养皿中，设置空白对照组，药物对照组、模型组、八宝丹组，待细胞汇合度达到70%～80%，药物对照组和八宝丹组加入0.75mg /mL BBD 药液，同时空白对照组和模型组加入等体积PBS ，预处理2h 。①模型组和八宝丹组加入10ng /mL TNF-α蛋白液，与此同时空白对照组和药物对照组加入等体积PBS ，刺激细胞8min 后，冰PBS 收取细胞，与上述提取细胞总蛋白及Western blot 法步骤一致，检测各组p-P65蛋白表达；②模型组和八宝
丹组加入10ng /mL TNF-α蛋白液，同时空白对照组和药物对照组加入等体积PBS ，刺激细胞4h 后，冰PBS 收取细胞，与上述提取细胞总蛋白及Western blot 法步骤一致，检测各组Atrogin-1蛋白表达。
图6结果显示，与空白对照组比较，模型组p-P65蛋白表达显著上调（P ＜0.01），而与模型组比较，八宝丹组p-P65蛋白表达显著下调（P ＜0.01）。图7结果显示，与空白对照组比较，模型组Atrogin-1蛋白表达显著上调（P ＜0.05），而与模型组比较，八宝丹组Atrogin-1蛋白表达显著下调（P ＜0.05）。
3
讨论
肌肉萎缩是癌症恶病质患者死亡的预测因子［16］，在癌症恶病质的动物模型中，肌肉萎缩得到改善的动物模型病死率降低［17］，表明改善肌肉萎缩可能有助于提高恶病质患者生存率。成肌细胞是体外研究肌肉生长修复重要的细胞系，目前用于实验研究的成肌细胞主要是C2C12成肌细胞［18］。因此本研究选用C2C12成肌细胞作为研究对象。炎症是肌肉萎缩的常见触发因素，炎症因子是肌肉萎缩的有效诱导剂，TNF-α已被证明对骨骼肌有分解代谢作用［19］，主要是通过激活NF-κB 信号通路［7］，TNF-α通过结合并激活其同源受体TNF-αR 后，促使IKKα磷酸化IκBα而被降解，NF-κB-IκB 二聚体解离，NF-κB p65亚单位上的S536发生磷酸化，使得NF-κB 入核调控下游基因表达，从而导致
UPS 中泛素连接酶如Atrogin-1过度上调，肌肉蛋白
质降解增多［9］。故选取TNF-α蛋白液刺激C2C12成肌细胞模拟体内炎症引起的肌肉萎缩模型，因p-P65及下游通路指标Atrogin-1在不同时间点对TNF-α反应时间不一致，故分别筛选TNF-α上调p-P65、Atrogin-1表达的最佳浓度和时间。结果表明10ng /mL TNF-α刺激细胞8min 显著上调p-P65蛋白表达，而10ng /mL TNF-α刺激细胞4h 显著上调Atrogin-1蛋白表达。
癌症恶病质归为中医“虚劳”范畴［20］，原则为扶正固本、化痰祛湿、活血化瘀解毒以助癌毒消散［21］。BBD 由牛黄、蛇胆、羚羊角、麝香、珍珠、三七和两种保密药物组成，功效为清利湿热、活血解毒、通经止痛，其功效基本符合中医对癌症恶病质的原则［14］。本研究发现，BBD 可抑制
TNF-α
注：与空白对照组比较，1）P ＜0.01；与模型组比较，
2）P ＜0.01。
图64组C2C12成肌细胞p-P65
蛋白表达比较
注：与空白对照组比较，1）P ＜0.05；与模型组比较，
2）P ＜0.05。
图74组C2C12成肌细胞Atrogin-1蛋白表达比较
24
赵棋琴等：八宝丹抑制TNF-α诱导C2C12成肌细胞Atrogin-1表达的研究第7期
诱导的NF-κB信号通路中NF-κB的磷酸化水平及下游通路Atrogin-1蛋白表达，表明BBD可能通过抑制NF-κB通路的激活进而削弱UPS系统的活性，减少肌肉蛋白降解量。本研究为有效防治癌症恶病质肌肉萎缩提供了研究基础，但BBD对癌症恶病质肌肉萎缩动物模型的作用有待进一步研究探讨。
参考文献
［1］SUNG H，FERLAY J，SIEGEL R L，et al.Global cancer statistics 2020：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality world‑
wide for36cancers in185countries［J］.CA Cancer J Clin，
2021，71（3）：209-249.
［2］SADEGHI M，KESHAVARZ-FATHI M，BARACOS V，et al.Can‑cer cachexia：diagnosis，assessment，and treatment［J］.Crit Rev
Oncol Hematol，2018，127：91-104.
［3］刘婷，丁艳，杨婷婷，等.鲜枸杞子提取物通过p38MAPK信号通路抑制人肝癌细胞HepG2诱导小鼠恶病质的作用及机
制［J］.中国实验方剂学杂志，2019，25（9）：89-94.
［4］SCHMIDT S F，ROHM M，HERZIG S，et al.Cancer cachexia：more than skeletal muscle wasting［J］.Trends Cancer，2018，4（12）：
849-860.
［5］MOLFINO A，FORMICONI A，ROSSI FANELLI F，et al.Cancer cachexia：towards integrated therapeutic interventions［J］.Expert
Opin Biol Ther，2014，14（10）：1379-1381.
［6］SAKUMA K，AOI W，YAMAGUCHI A.Molecular mechanism of sarcopenia and cachexia：recent research advances［J］.Pflugers
Arch，2017，469（5/6）：573-591.
［7］CAI D，FRANTZ J D，TAWA N E，J R，et al.IKKbeta/NF-kappa
自行车棚制作B activation causes severe muscle wasting in mice［J］.Cell，
2004，119（2）：285-298.
［8］LADNER K J，CALIGIURI M A，GUTTRIDGE D C.Tumor necrosis factor-regulated biphasic activation of NF-kappa B is
required for cytokine-induced loss of skeletal muscle gene
products［J］.J Biol Chem，2003，278（4）：2294-2303.
［9］THOMA A，LIGHTFOOT A P.NF-κB and inflammatory cyto‑
kine signalling：role in skeletal muscle atrophy［J］.Adv Exp Med
Biol，2018，1088：267-279.
［10］HUANG Y，CHEN J，JIANG T，et al.Gallic acid inhibits the release of ADAMTS4in nucleus pulposus cells by inhibiting p65
phosphorylation and acetylation of the NF-κB signaling path‑
way［J］.Oncotarget，2017，8（29）：47665-47674.
［11］WEBSTER J M，KEMPEN L，HARDY R S，et al.Inflammation and skeletal muscle wasting during cachexia［J］.Front Physiol，
2020，11：597675.
［12］ARGILÉS J M，STEMMLER B，LÓPEZ-SORIANO F J，et al.In‑ter-tissue communication in cancer cachexia［J］.Nat Rev Endo‑
crinol，2018，15（1）：9-20.
［13］GOMES M D，LECKER S H，JAGOE R T，et al.Atrogin-1，a mus‑cle-specific F-box protein highly expressed during muscle atro‑
phy［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98（25）：14440-14445.［14］柯樱，赵亚红.八宝丹的临床应用研究进展［J］.中成药，2017，39（2）：386-389.
［15］XIE X，CHEN J，WO D，et al.Babao Dan is a robust anti-tumor agent via inhibiting Wnt/β-catenin activation and cancer cell
stemness［J］.J Ethnopharmacol，2021，280：114449.
［16］FEARON K，STRASSER F，ANKER S D，et al.Definition and classification of cancer cachexia：an international consensus［J］.
Lancet Oncol，2011，12（5）：489-495.
［17］ZHOU X，WANG J L，LU J，et al.Reversal of cancer cachexia and muscle wasting by ActRIIB antagonism leads to prolonged
survival［J］.Cell，2010，142（4）：531-543.
［18］LAWSON M A，PURSLOW P P.Differentiation of myoblasts in serum-free media：effects of modified media are cell line-spe‑
cific［J］.Cells Tissues Organs，2000，167（2/3）：130-137.［19］MITCH W E，PRICE S R.Transcription factors and muscle ca‑chexia：is there a therapeutic target?［J］.Lancet，2001，357（9258）：
734-735.
［20］曾普华.从炎性微环境探析肿瘤恶液质的“癌毒致虚”病机观［J］.陕西中医，2021，42（8）：987-990，1137.
［21］李克雄，曾普华，郜文辉，等.基于“癌毒致虚”理论探讨肿瘤恶病质的中医药［J］.亚太传统医药，2019，15（10）：
90-92.
Inhibitory Effect of Babaodan on Expression of Atrogin-1
in C2C12Myoblasts Induced by TNF-α
ZHAO Qiqin1,CHEN Jinxiao1,WO Da2,HE Jia1,PENG Jun1,3,ZHU Weidong2,REN Danni1,3 1Academy of Integrative Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian350122,China;
2Institute of Innovation and Transformation Center,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian,350122,China;
3Fujian Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatrics,Fuzhou,Fujian350122,China
ABSTRACT Objective:To study the effect of Babaodan(BBD)on NF-κB pathway and atrophy gene1(Atrogin-1)of UPS system in C2C12myoblasts induced by tumor necrosis factor-α(TNF-α).Methods:1)MTT assay was used to detect the cell viability of C2C12myoblasts pretreated with various concentrations of BBD(0,0.125,0.25,0.5,0.75,1mg/mL)for48hours to confirm optimum BBD concentrations.2)The Logarithmic growth phase cells was treated with different concentrations of TNF-α(0,1,10,50ng/mL) at different time intervals.Western blot analysis was used to detect the protein expression levels of p-P65and Atrogin-1to confirm the optimal concentration and time of TNF-αtreatment.3)C2C12myoblasts were randomly divided into blank control group,drug control group,model group and BBD group.The drug control group and BBD group were pretreated with BBD for2hours respec‐tively.The model group and BBD group were induced with TNF-αof the screened optimal concentration and time.Western blot anal‐ysis was used to detect the protein expression levels of p-P65and Atrogin-1.Results:1)Different concentrations of BBD had no sig‐nificant effect on C2C12myoblasts viability(P>0.05).Based on research basis and results of MTT,0.75mg/mL was selected as the BBD intervention concentration.2)The protein expression of p-P65was obviously increased at8minutes following10ng/mL TNF-αstimulation(P<0.05),whereas the protein expression of Atrogin-1was obviously increased at4hours following10ng/mL TNF-αstimulation(P<0.05).3)C2C12myoblasts pretreated with BBD(0.75mg/mL)significantly attenuated th
e TNF-α-induced activations of p-P65and Atrogin-1(P<0.05,P<0.01).Conclusion:BBD can inhibit the phosphorylation level of NF-κB in NF-κB signaling path‐way and the protein expression of Atrogin-1in downstream pathway in C2C12myoblasts induced by TNF-α.
KEY WORDS Babaodan;C2C12myoblasts;TNF-α;p-P65;Atrogin-1
25
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议