史景红①高立冬②张红②胡世雄②黄岳四③杨浩②白志永③余明东③李林会④黄涧菲⑤杨静①
汪立杰①陈涛①徐翠玲①舒跃龙①*
①中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206；②湖南省疾病预防控制中心长沙410005；
③湖南省岳阳市疾病预防控制中心岳阳414000；④湖南省岳阳市岳阳县疾病预防控制中心岳阳414100；
⑤湖南省岳阳市君山区疾病预防控制中心岳阳414005
摘要：为了解东洞庭湖地区野禽驯养繁殖基地禽流感病毒感染状况，2011年11月至2013年10月，
调查4家野禽驯养繁殖基地的养殖情况，同时采集环境标本（包括新鲜粪便标本和水标本）。利用PCR 和病毒分离方法对标本进行检测。部分标本进行了核酸检测，禽流感病毒（AIV）阳性率为36.62%，
支撑架2012年3月份阳性率最高（47.83%）。粪便标本、水标本的AIV阳性率分别为40.45%、30.19%，二者
无统计学差异。共分离到28株AIV病毒，亚型包括H10、H4、H5和N7、N8，集中于11 ~ 12月的
标本，主要来源于君山区野禽驯养繁殖基地的雁类和野鸭的新鲜粪便标本。野禽驯养基地的环境标本
中存在AIV病毒，以A(H10N7)为主，建议对其进行定期监测。
关键词：东洞庭湖地区；野禽驯养繁殖基地；环境标本；禽流感病毒
中图分类号：Q939 文献标识码：A 文章编号：0250-3263（2015）04-607-08
Investigation of Avian Influenza Viruses in Captive Wild Birds
at East Dongting Lake
SHI Jing-Hong①GAO Li-Dong②ZHANG Hong②HU Shi-Xiong②HUANG Yue-Si③
YANG Hao②BAI Zhi-Yong③YU Ming-Dong③LI Lin-Hui④HUANG Jian-Fei⑤
YANG Jing①W ANG Li-Jie①CHEN Tao①XU Cui-Ling①SHU Yue-Long①*
①National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Centre for Disease Control and Prevention, Beijing 102206; ②Hunan
Provincial Center for Disease Control and Prevention, Changsha 410005;③Yueyang City Centre for Disease Control and Prevention, Yueyang 414000; ④Yueyang County Centre for Disease Control and Prevention, Yueyang 414000;
⑤ Junshan District Centre for Disease Control and Prevention, Yueyang 414005, China
基金项目国际合作项目（No. 5U51IP000334-03）；
* 通讯作者，E-mail: ；
第一作者介绍史景红，女，助理研究员；研究方向：传染病流行病学；E-mail: 。
收稿日期：2014-09-03，修回日期：2015-03-16 DOI: 10.13859/j.cjz.201504013
·608·动物学杂志Chinese Journal of Zoology50卷
Abstract: We carried out a survey to understand avian influenza virus (AIV) infection status in the captive wild birds farmed at Eastern Dongting Lake, China. We collected 1 997 environmental samples, including fresh fecal and water samples, from 4 captive wild bird farms in the Eastern Dong
ting Lake area from November 2011 to October 2013. Environmental samples were tested for the presence of avian influenza virus using quantitative PCR assay and virus isolation technique. The results were analyzed using SPSS and excel software. AIV prevalence of as detected in part samples was 36.62%, and it was the highest (47.83%) in March 2012 (Fig. 2). The positive rates of AIV from fecal samples and water samples were 40.45%, 30.19% (Table 1), respectively, and there was no statistical difference between the both by χ2 test. We isolated 26 and
2 AIVs from the fecal samples and drinking water, respectively, including H10, H4, H5, and N7, N8. Most
AIVs were found in November and December (Fig. 1), primarily from fecal samples of wild ducks in Junshan district (Table 2). Therefore, the AIVs were found from the environmental samples collected from captive wild bird farms, and measures monitoring AIVs in Dongting lake throughout the year should be implemented.
Key words: East Dongting Lake area; Captive wild bird farms; Environmental samples; Avian influenza virus
水禽被认为是A型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）的天然宿主（Webster et al. 1992）。A
型流感病毒包括16种血凝素（hemagglutinin，HA）和9种神经氨酸苷酶（neuraminidase，NA）。2012年发现新的亚型H17N10（Zhu et al. 2013），来自蝙蝠。2013年中国首次报告H10N8、H7N9、H5N6、H6N1禽流感病毒感染人类，尤其是2013年2月人感染H7N9禽流感疫情暴发以来，已导致全球550人发病，200余人死亡（国家流感中心2015），同时大量家禽被宰杀（OIE 2014a）。这些都再次提醒人们，除高致病性禽流感病毒导致人类发病和死亡外，低致病性禽流感病毒同样对人类公共卫生健康造成威胁。
洞庭湖位于湖南省东北部，长江中游，是中国第二大的淡水湖泊，分为东、南、西三个水面较大的湖泊。洞庭湖湿地是中国最大的淡水湿地，为中国鸟类，尤其是水禽类提供了良好的生存、越冬环境，是中国鸟类主要的越冬栖息地之一，也是亚洲重要的水禽栖息地，尤其东洞庭湖是中国冬候鸟和夏候鸟迁徙的时空结合部，是亚太迁徙线上鸟类的主要停歇地和越冬地。洞庭湖鸟类物种多达300种，为发展野生动物驯养繁殖提供了得天独厚的条件。人工驯养繁殖是保护雁类的最有效途径之一（李世良等1999），而且总结出驯养野鸭、野鸡等系统方法（张晓丹2002，郭秉堂2005）。前期研究显示，在东洞庭湖地区的家禽和野禽分离到多种亚型禽流感病毒（Zhang et al. 2011a，b，Wang et al. 2012，Shi et al. 2014），但野禽驯养繁殖基地的禽流感病毒感染状况尚未知。本研究选择东洞庭湖周边野禽驯养基地进行调查，以了解其养殖野禽感染禽流感病毒情况，为禽流感防控提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 养殖户信息收集和标本采集
现场调查时分3 ~ 4个调查小组，每个小组包括1 ~ 2名调查质控员以及多名懂当地方言的调查员和多名采样人员。调查质控员负责填写调查登记表，及现场调查质控。调查员负责完成每个养殖户/场调查表。采样人员负责采集环境标本。采集标本的同时完成调查登记表的填写。2011年11月至2013年10月期间，对东洞庭湖地区的4家野禽驯养繁殖基地（编码分别为WF1、WF2、WF3、WF4）陆续进行禽流感病毒监测。2011年11月WF3纳入本研究。2012年11月WF1、WF2和WF4纳入本研究。
4期史景红等：东洞庭湖地区野禽驯养繁殖基地的禽流感病毒调查·609·
其中，WF1和WF2属于岳阳市君山区，WF3和WF4属于岳阳市岳阳县。WF3从2011年11月至2013年10月每月采集环境标本，WF1、WF2、WF4从2012年11月至2013年10月每月采集环境标本。环境标本包括新鲜粪便标本和水标本。采样原则为采集的标本尽量分散，同时为避免交叉感染，更换繁殖基地时必须更换手套。根据粪便标本形态区分野禽所属类别，但是暂无法明确更详尽的种属名称。
采集2 g左右（拇指头大小）的新鲜粪便标本置于含有4 ml采样液的试管中。采样液配制参考世界卫生组织（World Health Organization，WHO）动物流感病毒诊断和监测方案（WHO 2002），具体为M199培养液中包含0.5% BSA、10%甘油、2 × 106 U/L青霉素、200 mg/L链霉素、2 ×106U/L多黏菌素B、250 mg/L庆大霉素、60 mg/L盐酸左氧氟沙星、5 × 105 U/L制霉菌素。水标本包括禽类食用较
多、较浑浊的饮用水和禽类活动较多的池塘水，使用无菌吸管采集4 ml水标本置于空的无菌试管中。
1.2 核酸检测和病毒分离
所有标本均取200 μl使用QIAamp One-For-All Nucleic Acid试剂盒（QIAGEN，German）通过德国QIAGEN公司的BioRobot Universalsystem仪器提取核酸，具体操作方法按照试剂盒说明书完成，即200 μl标本加入100 μl裂解液后上机，经过柱纯化后，加入65 μl A VE（试剂盒洗脱液）洗脱待检。对提取的核酸使用AgPath-IDTM One-step RT-PCR KIT（AB，USA）利用针对甲型流感病毒M基因特异性的引物和探针（在www.who.int/ csr/resources/publications/swineflu/CDCrealtime RTPCRprotocol20090428.pdf?ua=1网站上查询获得）在Mx3005P QPCR仪（Stratagene，USA）上进行real time PCR检测。核酸检测阳性（Ct 值≤ 37）的原始标本用9 ~ 10日龄的SPF鸡胚，接种尿囊腔，每个标本接种2枚鸡胚，置35℃孵育箱培养48 h后，4℃冰箱过夜冷胚。收集鸡胚尿囊液，用1%火鸡红细胞悬液进行血凝实验。对于血凝阳性的标本使用RNeasy RNA Mini试剂盒（Qiagen, Germany），参照试剂盒操作手册提取核酸。对提取的核酸使用甲型流感病毒H1 ~ H12和N1 ~ N9特异性引物（表1）进行RT-PCR扩增，PCR产物在1%的凝胶上电泳，以确定分离到病毒的亚型。2012年11月以前的标本先采用核酸检测，如果标本阳性再进行病毒分离。2012年11月及以后的所有标本直接利用鸡胚进行病毒分离。
1.3 数据分析
便携式示波器
使用Excel 2007、epidata3.1建立数据库，SPSS 17.0软件进行统计分析，采用χ2检验，P < 0.05认为差异有统计学意义。季节划分：春季3 ~ 5月份，夏季6 ~ 8月份，秋季9 ~ 11月份，冬季12 ~ 次年2月份。
2 结果
城市规划模型2.1 野禽驯养繁殖基地信息和标本采集情况
由于研究期间所调查野禽驯养繁殖基地驯养的野禽种类和数量变化不很大，所以只在第一次调查时收集了野禽种类和数量的信息。4家野禽繁殖基地驯养的野禽种类不同。WF1饲养雁鸭类（Anatidae），包括灰雁（Anser anser）、鸿雁（A. cygnoides）、斑头雁（A. indicus）、斑嘴鸭（Anas poecilorhyncha）、绿头鸭（A. platyrhynchos）、赤麻鸭（Tadorna ferruginea）等；WF2主要饲养野鸭，包括斑嘴鸭、绿头鸭和野鸡（为七珍山鸡）；WF3主要饲养雁鸭类，包括豆雁（Anser fabalis）、绿头鸭、斑嘴鸭，有少量天鹅（Cygnus）、鸳鸯（Aix galericulata）；WF4主要饲养灰雁，有少量家鹅，且灰雁与家鹅分开饲养。4家基地的养殖物种多由自家繁殖基地繁殖，部分从外面引进，大部分接种禽流感疫苗和/或鸭瘟疫苗，都进行定期环境消毒。4家基地均为大笼饲养，但仅WF3不允许外人随便进入繁殖基地内部，每次采集标本均由其基地的工作人员完成，其他3家基地的采样工作由本项目调查人员完成。WF1的禽类饮
·大灯清洗装置
610·动物学杂志Chinese Journal of Zoology50卷
表1 HA（H1 ~ H10）和NA（N1 ~ N9）亚型鉴定引物
Table 1 Universal primer set for identification of HA (H1﹣H10) and NA (N1﹣N9) subtype
水来自繁殖基地附近的自然水（运河水）；WF2、WF3、WF4的禽类饮水均为地下水。
2011年11月至2013年10月，在4家野禽繁殖基地共采集1 997份环境标本，包括新鲜粪便标本1 562份，水标本435份。其中，2011年11月至2012年4月，仅采集WF3的环境标本。2012年11月至2013年10月，4家均采集标本，其中，由于2013年4 ~ 7月WF2基地的野禽全部卖掉，2013年7月WF3基地拒绝采样，部分月份未采集到标本（图1）。2.2 核酸检测结果
对2011年11月至2012年4月WF3采集的标本进行了核酸检测，AIV阳性率为36.62%，2012年3月阳性率最高（47.83%）（图2）。粪便标本、水标本的AIV阳性率分别为40.45%、30.19%，二者无统计学差异（表2）。
2.3 病毒分离
本项目的病毒分离率为1.40%。WF1、WF2共分离到28株AIV毒株，包括H10亚型17株，其中NA为N7的16株，NA未分型的1
小型塑料封口机4期史景红等：东洞庭湖地区野禽驯养繁殖基地的禽流感病毒调查·611·
图1 采集的环境标本和AIV病毒分布的情况
Fig. 1 Information of environmental samples in four captive wild bird farms and the distribution of
AIVs at the different times
a、b、c、d分别表示WF1、WF2、WF3、WF4不同采样时间采集标本情况。e表示不同采样时间分离到AIV病毒的情况。
复合酵素a, b, c, and d represented the distribution of samples at different times in WF1, WF2, WF3, and WF4. e represented the distribution of AIVs.
株，H5N8 1株，H4（均为NA未分型）6株，HA未分型（NA为N8）4株。上述毒株来源于2012年11月的16株，12月7株，2013年1月5株（图1）。26株病毒来自禽类粪便，2 株来自禽类饮水。分离到的所有粪便来源的AIV病毒中，96.15%来自雁类（46.15%）和野鸭（50.00%）的粪便标本，仅1株来自野鸡粪便标本（表3）。WF3、WF4未分离到病毒。
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