２０１５年２月Ｖｏｌ．３３Ｎｏ．２Ｆｅｂｒｕａｒｙ２０１５
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
１１６ １２２
研究论文
ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１１２３．２０１４．０９０３７
∗通讯联系人．Ｔｅｌ：（０１０）８０７２７７７７⁃１１２９，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｃａｉｙ３７３６＠１６３．ｃｏｍ（蔡㊀耘）；Ｔｅｌ：（０１０）８０７２７７７７⁃１１４２，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ａｕｎｐ＿ｄｎａ＠１２６．ｃｏｍ（秦伟捷）．
基金项目：国家重大科学计划项目（２０１３ＣＢ９１１２０４）；国家重大科学仪器设备开发专项项目（２０１１ＹＱ０９０００５０４）；国家自然科学基金
项目（２１２７５００５，２１２３５００１）．
收稿日期：２０１４⁃０９⁃２３
马胶配方的大全
时照梅１，２，㊀范㊀超２，㊀黄俊杰２，㊀白海红２，㊀秦伟捷２∗，㊀蔡㊀耘１，２∗，㊀钱小红２
（１．安徽医科大学研究生学院，安徽合肥２３００３２；２．军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
北京蛋白质组研究中心，蛋白质组学国家重点实验室，北京１０２２０６）
摘要：生物体内蛋白质的糖基化修饰调控着细胞识别㊁细胞黏附和迁移以及免疫应答等多种生理过程，并与多种人类重大疾病的发生㊁发展密切相关㊂因此对蛋白质糖基化修饰的鉴定，不仅能够为生物学机理研究提供重要信息，对疾病诊断标志物和靶标的发现也至关重要㊂然而在复杂生物体系中，大多数糖蛋白为低丰度蛋白质，其含量与现有质谱仪器的检测灵敏度之间存在较大差距，所以对含有不同糖型结构的糖蛋白进行全面／高效的富集，是实现高灵敏度糖蛋白鉴定的必由之路㊂凝集素富集作为一种有效的糖蛋白富集方法，已在糖蛋白质组学研究中得到了广泛的应用㊂针对现有凝集素功能化材料存在负载量偏低以及富集效率有限等问题，我们制备了两种以氧化石墨烯（ＧＯ）为载体的新型固定化凝集素，利用ＧＯ比表面积大，功能基团含量高，分散性㊁化学稳定性好等特点，实现了高负载量的凝集素固定（ＧＯ⁃ＣｏｎＡ２ ０７３ｍｇ／ｍｇ，ＲＳＤ＝１ ０％；ＧＯ⁃ＷＧＡ１ ９
０８ｍｇ／ｍｇ，ＲＳＤ＝０ １４％）㊂同时考察了材料的可重复使用性与稳定性：每隔３天测一次同一ＧＯ⁃ｌｅｃｔｉｎ材料对对应糖蛋白的富集效果，可以看出材料合成两周内富集效果都＞２００μｇ／ｍｇ㊂将该ＧＯ⁃ｌｅｃｔｉｎ成功应用于糖蛋白㊁糖肽的选择性富集，在糖蛋白质组学研究中体现出良好的应用潜力㊂
关键词：凝集素；氧化石墨烯；富集；糖蛋白；糖肽
中图分类号：Ｏ６５８㊀㊀㊀文献标识码：Ａ㊀㊀㊀文章编号：１０００⁃８７１３（２０１５）０２⁃０１１６⁃０７
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｇｒａｐｈｅｎｅｏｘｉｄｅｂａｓｅｄｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｌｅｃｔｉｎａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ
ＳＨＩＺｈａｏｍｅｉ１，２，ＦＡＮＣｈａｏ２，ＨＵＡＮＧＪｕｎｊｉｅ２，ＢＡＩＨａｉｈｏｎｇ２，
ＱＩＮＷｅｉｊｉｅ２∗，ＣＡＩＹｕｎ１，２∗，ＱＩＡＮＸｉａｏｈｏｎｇ２
（１．ＧｒａｄｕａｔｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ，ＡｎｈｕｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｈｅｆｅｉ２３００３２，Ｃｈｉｎａ；２．ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，ＢｅｉｊｉｎｇＰｒｏｔｅｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，
ＢｅｉｊｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＲａｄｉａｔｉｏｎＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０２２０６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｒｏｔｅｉｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｓｒｅｇｕｌａｔｅｓａｖａｒｉｅｔｙｏｆｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｃｅｓ⁃
ｓｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｃｅｌｌｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，ｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ａｎｄｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｉｔｉｓａｌｓｏｃｌｏｓｅｌｙ
ｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｍａｎｙｃｒｉｔｉｃａｌｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｌａｒｇｅｓｃａｌｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｎｏｔｏｎｌｙｐｒｏｖｉｄｅｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆ
ｂａｓｉｃｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｂｕｔａｌｓｏｉｓｃｒｕｃｉａｌｆｏｒｔｈｅｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆｎｅｗｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｂｉｏｍａｒｋｅｒｓａｎｄｔｈｅ
ｒａｐｅｕｔｉｃｔａｒｇｅｔｓ．Ｄｕｅｔｏｔｈｅｌｏｗａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｉｎｒｅａｌｂｉｏｌｏｇｉ⁃ｃａｌｓａｍｐｌｅｓ，ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｂｅｆｏｒｅｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＳ）ａｎａｌｙｓｉｓｉｓａｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｓｔｅｐｆｏｒａｃｈｉｅ⁃ｖｉｎｇｄｅｅｐｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅｃｏｖｅｒａｇｅ．Ｌｅｃｔｉｎｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ，ａｓａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｇｌｙｃｏｐｒｏ⁃ｔｅｉｎｓ／ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ，ｈａｓｂｅｅｎｕｔｉｌｉｚｅｄｗｉｄｅｌｙｉｎｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｏｓｏｌｖｅｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍｓｏｆｌｏｗｌｅｃｔｉｎｌｏａｄｉｎｇａｎｄｌｉｍｉｔｅｄｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｅｘｉｓｔｉｎｇｌｅｃｔｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｗｅｐｒｅｐａｒｅｄｔｗｏｋｉｎｄｓｏｆｎｅｗｇｒａｐｈｅｎｅｏｘｉｄｅ（ＧＯ）ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｌｅｃｔｉｎ．Ｂｅｓｉｄｅｓｇｏｏｄｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｉｎａｑｕｅｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎａｓｗｅｌｌａｓｇｏｏｄｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ＧＯｈａｓｅｘｔｒｅｍｅｌｙｌａｒｇｅ
ｓｐｅｃｉｆｉｃｓｕｒｆａｃｅａｒｅａａｎｄａｌｓｏｃａｒｒｉｅｓｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｒｏｕｐｓｏｎｉｔｓｓｕｒｆａｃｅ，ｗｈｉｃｈｉｓ
㊀第２期时照梅，等：氧化石墨烯固定化凝集素的制备及在糖蛋白／糖肽富集中的应用ｅｓｐｅｃｉ
ａｌｌｙｂｅｎｅｆｉｃｉａｌｆｏｒａｃｈｉｅｖｉｎｇｈｉｇｈｌｅｃｔｉｎｌｏａｄｉｎｇａｍｏｕｎｔ．Ａｓａｒｅｓｕｌｔ，ｌｅｃｔｉｎｌｏａｄｉｎｇａｓｈｉｇｈａｓ１ ９０ｍｇ／ｍｇｗａｓａｃｈｉｅｖｅｄｆｏｒＧＯ⁃ｌｅｃｔｉｎ（ＧＯ⁃ＣｏｎＡ２ ０７３ｍｇ／ｍｇ，ＲＳＤ＝１ ０％；ＧＯ⁃ＷＧＡ１ ９０８ｍｇ／ｍｇ，ＲＳＤ＝０ １４％）．ＯｎｅｍｉｌｌｉｇｒａｍＧＯ⁃ｌｅｃｔｉｎｃａｎａｄｓｏｒｂｍｏｒｅｔｈａｎ２００μｇｇｌｙｃｏｐｒｏ⁃ｔｅｉｎｅａｃｈｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉｎｔｗｏｗｅｅｋｓ．ＴｈｅＧＯ⁃ｌｅｃｔｉｎｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙａｐｐｌｉｅｄｉｎｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ／ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｗｉｔｈｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｉｔｓｇｏｏｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｎｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｒｅｓｅａｒｃｈ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌｅｃｔｉｎ；ｇｒａｐｈｅｎｅｏｘｉｄｅ；ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ；ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ
㊀㊀糖基化作为一种十分重要的蛋白质翻译后修饰，普遍存在于哺乳动物细胞中，对蛋白质的功能㊁结构有着重要的影响，并在多种生物进程中发挥着至关重要的作用，调控着蛋白质的折叠和运输，细胞⁃细胞㊁细胞⁃间质的识别㊁相互作用以及信息传递［１－３］㊂蛋白质糖基化修饰的异常被认为和癌细胞的分化和发展㊁癌症的转移有着密切的关系㊂美国食品药品管理局（ＦＤＡ）批准的肿瘤诊断
标志物中有１／３是糖蛋白，因此糖蛋白被作为癌症早期诊断标志物的重要候选蛋白质［４－６］㊂高灵敏度的糖蛋白定性㊁定量技术对新的糖蛋白肿瘤标志物的筛选与验证研究至关重要［７－１０］㊂然而在复杂生物体系中，蛋白质具有非常广泛的丰度动态范围，而且大多数糖蛋白为低丰度蛋白质［１１，１２］，其含量难以达到蛋白质组鉴定常用的质谱仪器的灵敏度，因此对复杂样本中的糖蛋白进行有效的富集分离是实现高效的糖蛋白鉴定和深入的功能研究的必要前提㊂
㊀㊀常见的糖蛋白／糖肽富集方法包括亲水相互作用谱（ＨＩＬＩＣ）富集法㊁肼化学富集法以及凝集素（ｌｅｃｔｉｎ）富集法等㊂ＨＩＬＩＣ富集法是利用糖肽上糖链的多羟基结构与亲水固定相间的相互作用进行富集，对具有不同糖链结构的糖肽均具有一定的富集效果㊂然而这种依赖弱相互作用的富集方法的富集效果容易受到肽段本身亲㊁疏水性的影响，富集效率和选择性有限［１３，１４］㊂肼化学富集法是利用高碘酸钠将糖链上的邻二羟基氧化成醛基，然后使用酰基功能化材料与醛基进行共价结合，从而实现对糖蛋白㊁糖肽的富集，因此具有较高的富集选择性；但共价键的生成导致糖链结构难以释放，无法对所富集的糖蛋白㊁糖肽进行糖型分析［１５，１６］㊂与ＨＩＬＩＣ富集法和肼化学富集法相比，凝集素富集法是目前应用最广泛的糖蛋白㊁糖肽富集方法㊂凝集素作为一类糖结合蛋白，能专一性地识别特定的单糖或聚糖结构，并与之实现可逆的非共价结合㊂目前已有超过１５０种商业化凝集素产品，可对多种不同的糖型结构进行特异性富集㊂然而传统的凝集素功能化富集材料一般是将凝集素固定在微米级琼脂糖凝胶基质上，由于基质材料的比表面积较小，导致凝集
素负载量偏低，影响了富集效率㊂近年来有大量文献报道使用硅胶颗粒及磁性纳米颗粒为基质，制备负载量更高的凝集素功能化材料，如李凤等［１７］报道的磁性纳米粒子固定化伴刀豆凝集素Ａ（ＣｏｎＡ）的固载量为（３２ʃ５）μｇ／ｍｇ，Ｐａｎ等［１８］报道的硅胶颗粒毛发状聚合物的凝集素平均固载量为ＣｏｎＡ７８ ５
μｇ／ｍｇ，麦胚凝集素（ＷＧＡ）８０μｇ／ｍｇ㊂
㊀㊀为进一步提高凝集素功能化材料的负载量和对糖蛋白㊁糖肽的富集效率，我们使用目前比表面积最大（２６００ｍ２／ｇ）的氧化石墨烯（ＧＯ）材料为基质，制备了新型的氧化石墨烯固定化凝集素（ＧＯ⁃ｌｅｃ⁃ｔｉｎ）㊂ＧＯ具有比表面积大㊁分散性好㊁功能基团含量高等特点［１９］，这使其成为一种理想的载体材料运用在固定化酶［２０］㊁生物传感器［２１］等领域㊂本研究将麦胚凝集素和伴刀豆凝集素Ａ的自由氨基与ＧＯ表面的羧基通过偶联反应，将凝集素键合在ＧＯ表面，成功合成了高负载量的氧化石墨烯固定化凝集素ＧＯ⁃ＷＧＡ和ＧＯ⁃ＣｏｎＡ（固载量＞１ ９０ｍｇ／ｍｇ），超过现有报道的其他凝集素功能化材料㊂由于不同的凝集素特异性识别的糖型不同，所以这两种固定化凝集素可以针对不同糖型的糖蛋白进行富集㊂该固定化凝集素材料制备容易，富集操作简单，凝集素负载量高，有望大大提高对糖蛋白㊁糖肽的富集效率，在糖蛋白质组学中具有较好的应用潜力㊂
１㊀实验部分
１．１㊀试剂与仪器
㊀㊀氧化石墨烯水溶液（ＧＯ）（２ｍｇ／ｍＬ，由中国科学院山西煤炭化学研究所提供）；ＷＧＡ㊁ＣｏｎＡ（美国ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ公司）；核糖核酸酶Ｂ（ｂｏｖｉｎｅｐａｎ⁃ｃｒｅａｔｉｃｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＢ，ＲＮａｓｅＢ，１７ｋＤａ）㊁牛胎球白蛋白（ｂｏｖｉｎｅｆｅｔｕｉｎ，ｆｅｔｕｉｎ，４８ ４ｋＤａ）㊁鸡卵清白蛋白（ａｌｂｕｍｉｎｆｒｏｍｃｈｉｃｋｅｎｅｇｇｗｈｉｔｅ，ＯＶＡ，４４ ３ｋＤａ）㊁牛晶体蛋白（ｔｈｅＡｃｈａｉｎｏｆｂｏｖｉｎｅｌｅｎｓα⁃ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ，α⁃ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ，１９ ７９ｋＤａ）㊁牛血清白蛋白（ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ，ＢＳＡ，６６ ４３
㊃７１１㊃
谱第３３卷
ｋＤａ）㊁甲基⁃α⁃Ｄ⁃吡喃甘露糖苷（ｍｅｔｈｙｌ⁃α⁃Ｄ⁃ｍａｎ⁃ｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）㊁Ｎ⁃乙酰⁃Ｄ⁃氨基葡萄糖（Ｎ⁃ａｃｅｔｙｌ⁃β⁃Ｄ⁃ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）㊁α⁃氰基⁃４⁃羟基肉桂酸（ＣＨＣＡ）㊁三氟乙酸（ＴＦＡ）㊁甲酸（ＦＡ）㊁１，４⁃二硫苏糖醇（ＤＴＴ）㊁碘乙酰胺（ＩＡＡ）㊁乙腈（ＡＣＮ）㊁１⁃乙基⁃（３⁃二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（ＥＤＣ）㊁Ｎ⁃羟基琥珀酰亚胺（ＮＨＳ）㊁２⁃（Ｎ⁃啉）乙磺酸（ＭＥＳ）（美国Ｓｉｇ⁃ｍａ公司）；ｐＨ７ ４ＰＢＳ缓
冲液（美国ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌ⁃ｏｇｉｅｓ公司）；胰蛋白酶（ｔｒｙｐｓｉｎ）（美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司）；ＰＮＧａｓｅＦ酶（美国ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ公司）；碳酸氢铵㊁浓盐酸㊁氢氧化钠㊁钠（ＣｌＣＨ２ＣＯＯＮａ）㊁Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ（ｐＨ７ ３）㊁氯化锰（ＭｎＣｌ２）㊁氯化镁（ＭｇＣｌ２）㊁氯化钙（ＣａＣｌ２）㊁氯化钠（ＮａＣｌ）㊁十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）㊁丙烯酰胺㊁过硫酸铵㊁四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ）（北京化学试剂公司）；实验用水由Ｍｉｌｌｉ⁃Ｑ纯水系统提供（美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司）㊂
㊀㊀４８００基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪（ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦ⁃ＴＯＦＭＳ，美国ＡＢＳＣＩＥＸ公司）；真空冰冻干燥机ＳＣ１００ＡＳｐｅｅｄｖａｃＰｌｕｓ（美国ＴｈｅｒｍｏＳａｖａｎｔ公司）；ＳａｒｔｏｒｉｕｓＢＰ２１１ｄ分析天平（德国Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司）；３Ｋ３０型高速离心机（美国Ｓｉｇｍａ公司）；ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００ｃ超微量分光光度计（美国ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司）；ＴｈｅｒｍｏＯｒｉｏｎＭｏｄｅｌ８１８型ｐＨ计（美国Ｔｈｅｒｍｏ公司），十二烷基磺酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ）跑胶系统（美国ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ公司）㊂
１．２㊀ＧＯ⁃ＷＧＡ和ＧＯ⁃ＣｏｎＡ的制备
㊀㊀取１ｍＬ氧化石墨烯水溶液（２ｍｇ／ｍＬ），以１５０００ｇ离心１５ｍｉｎ，弃去上清液，
加入２００μＬ水重悬，将２５ｍｇＮａＯＨ和２５ｍｇ钠溶于８００μＬ水中并加入上述重悬的石墨烯水溶液中，涡旋混匀，冰浴超声１５ｍｉｎ，将产物离心，弃去上清液，接着用１ｍＬ水洗去多余的ＮａＯＨ和钠，重复洗３次㊂
工字扣㊀㊀将上述处理好的ＧＯ加入到溶有４００ｍｍｏｌ／ＬＥＤＣ㊁１００ｍｍｏｌ／ＬＮＨＳ的１ｍＬｐＨ５ ２ＭＥＳ缓冲液中活化１０ｍｉｎ，接着用ｐＨ７ ４ＰＢＳ缓冲液清洗３次，以去除多余的ＮＨＳ和ＥＤＣ㊂将４ｍｇＷＧＡ或者ＣｏｎＡ溶于１ｍＬｐＨ７ ４ＰＢＳ缓冲液中并加入到上述处理好的ＧＯ中，并在４ħ下旋转反应过夜㊂将反应液以１４０００ｇ离心１０ｍｉｎ，取上清液，Ｎａｎｏ⁃Ｄｒｏｐ２０００ｃ超微量分光光度计定量，考察凝集素负载量，沉淀用ｐＨ７ ４ＰＢＳ缓冲液清洗３次，于４ħ下贮存备用㊂
１．３㊀标准糖蛋白／糖肽的富集与检测
㊀㊀氧化石墨烯固定化凝集素ＧＯ⁃ＷＧＡ和ＧＯ⁃Ｃｏ⁃ｎＡ使用之前用结合缓冲液（ｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ，２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ⁃ＨＣｌ（ｐＨ７ ４），５００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，１ｍｍｏｌ／ＬＭｎＣｌ２，１ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２，１ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２）洗两遍㊂含有不同糖型的标准糖蛋白包括ＲＮａｓｅＢ㊁牛胎球白蛋白㊁ＯＶＡ和牛晶体蛋白㊂分别取标准糖蛋白（１０μｇ）和ＢＳＡ，按照１ʒ０㊁１ʒ１０的质量比混合后，与合成的两种类型的ＧＯ⁃ｌｅｃｔ
ｉｎ各１ｍｇ混合在５００μＬ的结合缓冲液体系中，４ħ下旋转反应过夜㊂之后，使用５００μＬ的结合缓冲液清洗４次，以除去非特异性吸附的蛋白质，接着用３００μＬ洗脱液（ＣｏｎＡ：２００ｍｍｏｌ／Ｌ甲基α⁃Ｄ⁃吡喃甘露糖苷；ＷＧＡ：３００ｍｍｏｌ／ＬＮ⁃乙酰⁃β⁃Ｄ⁃氨基葡萄糖）洗脱两次，合并洗脱液，透析除盐，冻干备用㊂冻干的样品用ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ考察富集效果㊂
㊀㊀取标准蛋白牛胎球白蛋白㊁ＢＳＡ各１００μｇ分别溶于１００μＬ的５０ｍｍｏｌ／ＬＮＨ４ＨＣＯ３中，加入终浓度为１０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＤＴＴ，９５ħ水浴加热１０ｍｉｎ后，取出冷却至室温，加入终浓度为５０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＡＡ，暗处室温反应４５ｍｉｎ，按照蛋白质ʒ胰蛋白酶＝５０ʒ１（质量比）的比例分别加入２μｇ的胰蛋白酶，３７ħ水浴１２ｈ，脱盐冻干后分别用１００μＬ结合缓冲液重溶，其中１：取１０μＬ的牛胎球白蛋白酶切肽段加入到１００μＬ的ＢＳＡ酶切物中充分混合（牛胎球白蛋白ʒＢＳＡ＝１ʒ１０，质量比）；２：取１０μＬ的牛胎球白蛋白酶切肽段加入到１００μＬ的结合缓冲液中（牛胎球白蛋白ʒＢＳＡ＝１ʒ０，质量比）㊂将样品１㊁２分别加入到两管各１ｍｇ已活化好的ＧＯ⁃ＷＧＡ中，按照上述富集蛋白质的方法步骤富集洗脱以后，脱盐冻干，分别重溶于１０μＬ的５０ｍｍｏｌ／ＬＮＨ４ＨＣＯ３中，各加入１Ｕ的ＰＮＧａｓｅＦ酶，于３７ħ水浴酶切１２ｈ㊂然后进行ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦ质谱鉴定，鉴定条件同文献［１８］的２ ８节㊂
２㊀结果与讨论
２．１㊀ＧＯ⁃ＣｏｎＡ和ＧＯ⁃ＷＧＡ固定化凝集素的制备与表征
㊀㊀ＧＯ⁃ＣｏｎＡ和ＧＯ⁃ＷＧＡ固定化凝集素的制备过程如图１所示：将ＧＯ用钠和氢氧化钠处理后，使ＧＯ表面上的环氧基开环生成羧基，提高了ＧＯ表面羧基的含量，为下一步凝集素的固定提供了大量的结合位点，以提高凝集素的负载量㊂接着使用ＮＨＳ和ＥＤＣ对ＧＯ上的羧基进行活化，以提
㊃８１１㊃
㊀第２期
时照梅，等：氧化石墨烯固定化凝集素的制备及在糖蛋白／糖肽富集中的应用
高偶联反应效率，最后将凝集素ＣｏｎＡ和ＷＧＡ加入体系中，通过羧基与凝集素的自由氨基的偶联反应将其键合在ＧＯ的表面，得到富集糖蛋白㊁糖肽所需的ＧＯ⁃ＣｏｎＡ和ＧＯ⁃ＷＧＡ固定化凝集素㊂㊀㊀ＧＯ是一种在每一层的石墨烯单片上都引入了大量的氧基功能团（如羧基㊁环氧基㊁羰基等）的层状结构材料，具有良好的亲水性，可以很好地分散在水溶液中，同时可以很容易地通过高速离心实现分离㊂如图２所示，通过透射电镜（ＴＥＭ）对ＧＯ⁃ＣｏｎＡ和ＧＯ⁃ＷＧＡ的材料表面进行表征，可以看到相比ＧＯ而言，ＧＯ⁃ＣｏｎＡ和ＧＯ⁃ＷＧＡ的表面出现大量均匀的颗粒状结构，为ＷＧＡ和ＣｏｎＡ在ＧＯ表面的固定所致㊂
㊀㊀为进一步考察凝集素在氧化石墨烯表面是否固定成功，我们对固定前后的氧化石墨烯进行了氮元素的Ｘ射线光电子能谱（ＸＰＳ）分析㊂如图３所示，
在３９９ ９ｅＶ处，ＧＯ无明显的氮元素吸收峰，而凝集素修饰的ＧＯ⁃ＣｏｎＡ和ＧＯ⁃ＷＧＡ则出现了明显的氮元素吸收峰，可归结于来自凝集素中的氨基酸，因此证明凝集素已成功键合到ＧＯ表面㊂通过测定固定前后溶液中凝集素的浓度变化，可以计算得到ＧＯ表面的凝集素固载量㊂分别将３次测试结果（ＧＯ⁃ＣｏｎＡ：２ ０５８ｍｇ／ｍｇ㊁２ ０９７ｍｇ／ｍｇ㊁２ ０６４ｍｇ／ｍｇ；ＧＯ⁃ＷＧＡ：１ ９０７ｍｇ／ｍｇ㊁１ ９１１ｍｇ／ｍｇ㊁
中频炉炼钢１ ９０６ｍｇ／ｍｇ）取平均值得到ＧＯ表面的凝集素负载量为：ＧＯ⁃ＣｏｎＡ２ ０７３ｍｇ／ｍｇ，ＲＳＤ＝１ ０％；ＧＯ⁃ＷＧＡ１ ９０８ｍｇ／ｍｇ，ＲＳＤ＝０ １４％㊂该结果明显高于文献［１７，１８］中使用微米或纳米颗粒作为基质材料所获得的凝集素固载量㊂
㊀㊀上述结果充分表明在本实验中，按照以上条件，我们成功地在ＧＯ表面实现了高负载量的凝集素ＣｏｎＡ和ＷＧＡ的固定
无水氯化镁㊂
图１㊀ＧＯ⁃ｌｅｃｔｉｎ的制备流程图
Ｆｉｇ．１㊀Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ在线水分检测
ＧＯ⁃ｌｅｃｔｉｎ
图２㊀ＴＥＭ表征ＧＯ和ＧＯ⁃ｌｅｃｔｉｎ
Ｆｉｇ．２㊀Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ（ＴＥＭ）ｉｍａｇｅｓｏｆＧＯａｎｄＧＯ⁃ｌｅｃｔｉｎ
钢板切割㊃
９１１㊃
谱第３３
卷
图３㊀ＸＰＳ检测ＧＯ和ＧＯ⁃ｌｅｃｔｉｎ上的Ｎ元素
Ｆｉｇ．３㊀Ｘ⁃ｒａｙｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＸＰＳ）
ｓｐｅｃｔｒａｏｆＧＯａｎｄＧＯ⁃ｌｅｃｔｉｎ
２．２㊀糖蛋白／糖肽富集效果考察
㊀㊀为了考察我们合成的ＧＯ⁃ＣｏｎＡ和ＧＯ⁃ＷＧＡ固定化凝集素对糖蛋白的富集效果㊁选择性和重复使用的稳定性，我们以几种标准糖蛋白及其与非糖蛋白ＢＳＡ的混合物为样本，通过ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ进行验证㊂因为ＣｏｎＡ与甘露糖具有特异性亲和作用，ＷＧＡ与Ｎ⁃乙酰葡糖糖胺具有特异性亲和作用，所以在标准糖蛋白的富集实验中，我们使用ＧＯ⁃ＣｏｎＡ富集带有甘露糖糖链的ＲＮａｓｅＢ和ＯＶＡ，使用ＧＯ⁃ＷＧＡ富集带有Ｎ⁃乙酰葡糖糖胺结构的牛胎球白蛋白和牛晶体蛋白㊂为了进一步考察所合成的ＧＯ⁃ｌｅｃｔｉｎ材料对糖肽的富集效果，我们使用ＧＯ⁃ＷＧＡ对牛胎球白蛋白和ＢＳＡ的酶解肽段混合物进行富集，并用ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦＭＳ对富集产物进行鉴定㊂㊀㊀图４是在没有非糖蛋白ＢＳＡ干扰的情况下，分别使用ＧＯ⁃ＣｏｎＡ或ＧＯ⁃ＷＧＡ对标准糖蛋白的富集效果考察㊂可以看出在１㊁３㊁５㊁７泳道中，富集后的上清液中几乎无残留的标准糖蛋白对应的条带；而在２㊁４㊁６㊁８泳道中，洗脱液中出现了明显的标准糖蛋白对应的条带㊂说明ＧＯ⁃ＣｏｎＡ和ＧＯ⁃ＷＧＡ具有较高的富集效率，对标准糖蛋白可实现完全富集㊂图５是以标准糖蛋白与非糖蛋白ＢＳＡ的混合物（糖蛋白ʒＢＳＡ＝１ʒ５０，质量比）为样本的富集选择性评价㊂可以看出在１㊁３
㊁５㊁７泳道中，上清液只能看到ＢＳＡ对应的条带，而几乎无糖蛋白残留㊂而在２㊁４㊁６㊁８泳道中，洗脱液中只有糖蛋白对应的条带，几乎无ＢＳＡ的条带㊂在此基础上，我们以ＲＮａｓｅＢ㊁ＯＶＡ㊁牛胎球白蛋白和牛晶体蛋白４种糖蛋白的混合物为样本，对存在其他糖类物质／糖型干扰的情况下ＧＯ⁃ｌｅｃｔｉｎ的富集选择性进行了进一步考察㊂图６是４种糖蛋白按１ʒ１ʒ１ʒ１的质量比混合后为样本的ＧＯ⁃ｌｅｃｔｉｎ富集选择性评价㊂１㊁２
泳道分别对
图４㊀ＧＯ⁃ＣｏｎＡ和ＧＯ⁃ＷＧＡ在无ＢＳＡ干扰的情况下富集标准糖蛋白的ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ表征图
Ｆｉｇ．４㊀ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥｐｉｃｔｕｒｅｏｆα⁃ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ，ｆｅｔｕｉｎ，ＯＶＡａｎｄＲＮａｓｅＢａｆｔｅｒＧＯ⁃ｌｅｃｔｉｎｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｗｉｔｈ⁃
ｏｕｔＢＳＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ
㊀Ｌａｎｅ１：ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆα⁃ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎａｆｔｅｒｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；Ｌａｎｅ２：ｅｌｕｅｎｔｏｆα⁃ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎａｆｔｅｒｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；Ｌａｎｅ３：ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆｆｅｔｕｉｎａｆｔｅｒｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；Ｌａｎｅ４：ｅｌｕｅｎｔｏｆｆｅｔｕｉｎａｆｔｅｒｅｎｒｉｃｈ⁃ｍｅｎｔ；Ｌａｎｅ５：ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆＯＶＡａｆｔｅｒｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；Ｌａｎｅ６：ｅｌｕｅｎｔｏｆＯＶＡａｆｔｅｒｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；Ｌａｎｅ７：ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆＲＮａｓｅＢａｆｔｅｒｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；Ｌａｎｅ８：ｅｌｕｅｎｔｏｆＲＮａｓｅＢａｆｔｅｒｅｎｒｉｃｈ⁃ｍｅｎｔ．ＬａｎｅＭ：ｒｅｌａｔｉｖｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｓｓ
ｓｔａｎｄａｒｄｓ．
图５㊀ＧＯ⁃ＣｏｎＡ和ＧＯ⁃ＷＧＡ富集标准糖蛋白的ＳＤＳ⁃
ＰＡＧＥ图（糖蛋白ʒＢＳＡ＝１ʒ５０，质量比）
Ｆｉｇ．５㊀ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥｐｉｃｔｕｒｅｏｆα⁃ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ，ｆｅｔｕｉｎ，ＯＶＡａｎｄＲＮａｓｅＢａｆｔｅｒＧＯ⁃ｌｅｃｔｉｎｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ｇｌｙ⁃
ｃｏｐｒｏｔｅｉｎʒＢＳＡ＝１ʒ５０，ｗ／ｗ）
㊀Ｌａｎｅ１：ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆα⁃ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎａｆｔｅｒｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；Ｌａｎｅ２：ｅｌｕｅｎｔｏｆα⁃ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎａｆｔｅｒｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；Ｌａｎｅ３：ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆｆｅｔｕｉｎａｆｔｅｒｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；Ｌａｎｅ４：ｅｌｕｅｎｔｏｆｆｅｔｕｉｎａｆｔｅｒｅｎｒｉｃｈ⁃ｍｅｎｔ；Ｌａｎｅ５：ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆＯＶＡａｆｔｅｒｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；Ｌａｎｅ６：ｅｌｕｅｎｔｏｆＯＶＡａｆｔｅｒｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；Ｌａｎｅ７：ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆＲＮａｓｅＢａｆｔｅｒｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；Ｌａｎｅ８：ｅｌｕｅｎｔｏｆＲＮａｓｅＢａｆｔｅｒｅｎｒｉｃｈ⁃ｍｅｎｔ．ＬａｎｅＭ：ｒｅｌａｔｉｖｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｓｓｓｔａｎｄａｒｄｓ．
应ＧＯ⁃ＷＧＡ富集后的上清液和洗脱液，３㊁４泳道分别对应ＧＯ⁃ＣｏｎＡ富集后的上清液和洗脱液㊂根据相对分子质量的判断，可以发现在１泳道中的上清液中只能看到ＲＮａｓｅＢ和ＯＶＡ，而在泳道２中的洗脱液中只能看到牛胎球白蛋白和牛晶体蛋白；３泳道中的上清液中只能看到牛胎球白蛋白和牛晶体蛋白，而在泳道４中的洗脱液中只能看到ＲＮａｓｅＢ和ＯＶＡ㊂说明ＧＯ⁃ＣｏｎＡ对带有高甘露糖型的ＲＮａｓｅＢ和ＯＶＡ的高效㊁高选择性富集能力不会受到带有Ｎ⁃乙酰氨基葡萄糖的牛胎球白蛋白和牛晶体蛋白
㊃０２１㊃
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