两亲性高分子功能化氧化石墨烯的制备与生物相容性评价 儿童画写板王欢欢;胡祥龙
【摘 要】二维的氧化石墨烯(GO)的细胞毒性低,且有良好的生物相容性,是良好的光热与成像材料,同时还可以作为纳米载体,用来输运化疗药物、基因等.由于氧化石墨烯的片层之间有较强的范德华力,极易团聚,从而影响其在生物医学方面的进一步应用.本文通过二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基(DSPE-PEG-NH2)功能化修饰氧化石墨烯,改善了石墨烯在水相中的稳定性、低毒性及生物相容性.功能化氧化石墨烯在水相中放置两周以上仍然具有良好的分散性,且对细胞没有明显的毒副作用,有望在生物医学领域发挥巨大作用.%Two-dimensional graphene oxide ( GO) has low cytotoxicity and good biocompatibility, which can be employed as good photothermal/imaging agents as well as nanocarriers for the delivery of chemotherapeutic drugs/genes. However, there are strong Vander Waals forces among the layer of GO, which can cause deteriorating effects of the ag-glomeration of GO, and is unfavorable for biological applications. In this work, 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoeth-anolamine-peg-amine ( DSPE-PEG-NH2 ) was employed to decorate GO, affo 电机线圈绕线机rding hybrid GO nanoparticles, DSPE-PEG-GO. The well-dispersed DSPE-PEG-GO was kept stable in aqueous solution for even more than two weeks, and it had no obvious cytotoxicity, which is promising in biomedicine.
【期刊名称】《激光生物学报》
【年(卷),期】2017(026)006
【总页数】4页(P540-543)
【关键词】虹吸式屋面雨水排水系统氧化石墨烯;稳定性;生物相容性;生物医学
【作 者】王欢欢;胡祥龙
【作者单位】华南师范大学激光生命科学研究所, 激光生命科学教育部重点实验室, 生物光子学研究院, 广东 广州510631;华南师范大学激光生命科学研究所, 激光生命科学教育部重点实验室, 生物光子学研究院, 广东 广州510631
【正文语种】中 文
【中图分类】Q225
石墨烯是一种二维碳纳米材料[1-2]，于2004年首次报道[3]，英国曼切斯特大学德烈·盖姆和康斯坦丁·诺沃肖洛夫两位科学家共同发现并制备出单层的石墨烯。单层石墨烯的碳-碳键是以sp2杂化的。从化学成分上比较，氧化石墨烯是在石墨烯结构的基础上引入了丰富的含氧官能团(羟基、羧基、羰基、环氧基)[4-6]。单层氧化石墨烯厚度在1 nm左右，具有低毒性、生物相容性好等优良特征[7-9]，广泛作为光热、成像材料及纳米输运载体[10-14]。但是由于氧化石墨烯自身的难溶性以及片层之间存在范德华力和Π-Π堆积作用，一般情况下氧化石墨烯容易在水及有机介质中聚集沉淀，这些在很大程度上限制了无机材料氧化石墨烯的生物医学应用[15-16]。因此，为了推动氧化石墨烯的进一步应用，对其功能化以提高其稳定性就显得尤为重要[17-18]。
本工作中我们充分利用氧化石墨烯表面和边缘的丰富的羧基与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基的氨基进行酰胺化反应。从而赋予产物DSPE-PEG-GO拥有聚乙二醇良好的亲水性和生物相容性，更好地发挥氧化石墨烯纳米生物医学领域、生物医药方面的应用价值。
氧化石墨烯(graphene oxide, GO)，购于南京先丰纳米有限公司；钙黄绿素/碘化吡啶(Calc
ein-AM/PI)活细胞/死细胞双染试剂盒，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT, 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromide)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基(DSPE-PEG-NH2)等均购于Sigma公司。二甲基亚砜等溶剂均采购自国药集团。
水相中纳米粒子的尺寸采用Malvern Nano ZS表征。透射电子显微镜(TEM)测试在JEOLJEM-2100电子显微镜完成，加速电压80 kV，样品制备时，吸取10 μL样品溶液滴在铜网上，然后至于干净的环境自然干燥。紫外-可见光谱采用Unico UV/vis 2802 PCS紫外可见分光光度计测试。酶标仪采用infinite M200 Tecan。
将GO(1 mg/mL，1 mL)，水浴超声10 min，加入EDC(100 mmol/L，500 μL)和NHS(100 mmol/L，1 mL)，超声30 min后，调pH至弱碱性[19]。然后加入DSPE-PEG-NH2(1 mmol/L，1.2 mL)，搅拌24 h。将所得产物用截留分子量为2 kD透析膜透析纯化24 h，得DSPE-PEG-GO，冻干浓缩至1 mg/mL备用。
量取2 mL DSPE-PEG-GO的水分散液(100 μg/mL)于玻璃瓶中，于阴凉处静置0、7、14天后，分别拍照记录并用马尔文粒度仪测量粒径的变化。另外取1 mL DSPE-PEG-GO(1 mg/
mL)于1.5 mL的样品管中，拍照记录分散液在离心前后的状态。由图2a，2b知，DSPE-PEG-GO粒径稳定，两星期内分散性良好，未观察到聚集。结合图2c，DSPE-PEG-GO即使在6 000 r/min的转速下离心3 min依然具有良好的分散性，说明了DSPE-PEG-GO有着优良的稳定性。
本工作中，我们选用NIH-3T3小鼠胚胎成纤维细胞系，利用MTT法检测该纳米粒子的细胞毒性。先将NIH-3T3小鼠胚胎成纤维细胞接种到96孔板上，每个孔添加100 μL DMEM培养液，初始密度约为每孔5 000个细胞，培养过夜使细胞贴壁，而后换用新鲜培养液与不同浓度的DSPE-PEG-GO共孵育，每组设5个平行孔，培养时间为24 h。每孔加入15 μL的MTT(5 mg/mL)试剂，继续培养4.5 h后，吸出DMEM培养液，加入150 μL DMSO，酶标仪检测490 nm处的吸光度值。每个实验条件均采集五个数据，所得到的最终数据是五个平行试验的平均值并计算出标准差及细胞存活率(如图3a所示)。
共聚焦显微镜成像观察钙黄绿素/碘化吡啶两种染料染细胞，观察细胞状态。先将NIH-3T3小鼠胚胎成纤维细胞接种到共聚焦皿中，每孔添加500 μL DMEM培养液过夜至细胞贴壁，重新换取新鲜的培养液，分别与DSPE-PEG-GO(100 μg/mL)孵育0 h、24 h。之后用C
alein-AM/PI染细胞，如Fig.3b所示，DSPE-PEG-GO与细胞共孵育24 h并没有使细胞死亡。结合图3a，说明DSPE-PEG-GO在浓度高达100 μg/mL对正常细胞基本无损伤，细胞的毒副作用可以忽略。DSPE-PEG-GO的细胞毒性低，具有良好的生物相容性，有助于GO用于药物传输和疾病诊疗的载体。
石墨烯理化性能独特，其在各个领域的应用都受到广泛关注[20]，但其在水相中的分散与稳定性问题是个制约因素，因此对石墨烯进行功能化就显得尤为重要。而氧化石墨烯作为石墨烯重要的派生物，表面有丰富的含氧官能团，有利于功能化。
透气盖目前常用的功能化改性试剂有有机胺类、异氰酸酯类和硅烷偶联剂。有机胺类有氨基基团可以和GO表面的羧基发生酰胺化反应，而且反应操作简单可控[21-22]，因此本文选用有机胺类二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基(DSPE-PEG-NH2) 对GO进行功能化修饰。DSPE-PEG-NH2与GO通过简单的酰胺化反应，合成了功能化的氧化石墨烯，即两亲性高分子DSPE-PEG-GO。并用紫外可见吸收光谱、透射电子显微镜对DSPE-PEG-GO进行表征，用马尔文粒度仪检测DSPE-PEG-GO的粒径随其放置时间的变化及离心或长时间放置后DSPE-PEG-GO在水中分散性的变化，并用MTT及Calcein-AM/PI评估其对细胞的毒性。
结果表明，DSPE-PEG-GO仍旧具有氧化石墨烯的二维形态及在230 nm附近的特征吸收峰；对于氧化石墨烯易聚沉的性质，DSPE-PEG-GO的稳定性有了极大的改善，可以稳定放置至少两周；高浓度的DSPE-PEG-GO对细胞毒性低，有着良好的生物相容性，而高浓度GO对细胞有明显毒性[23-24]。初步实验表明DSPE-PEG-GO有望作为生物医药的安全载体，后期工作将进一步推动其生物医学应用。
*通讯作者： 胡祥龙(1984-)，男，汉族，安徽六安人，华南师范大学 研究员，博士，主要从事生物医用高分子研究。(电话*************；()*************
压缩胶囊【相关文献】
[1] MOON H, KUMAR D, KIM H, et al. Amplified photoacoustic performance and enhanced photothermal stability of reduced graphene oxide coated gold nanorods for sensitive photoacoustic imaging [J]. ACS Nano, 2015, 9(3):2711-2719.
[2] SHENG Z, SONG L, ZHENG J, et al. Protein-assisted fabrication of nano-reduced graphene oxide for combined in vivo photoacoustic imaging and photothermal therapy[J]. Biomaterials, 2013, 34(21):5236-5243.
[3] ZHANG L, XIA J, ZHAO Q. Functional graphene oxide as a nanocarrier for controlled loading and targeted delivery of mixed anticancer drugs[J]. Small, 2010, 6(4):537-544.
[4] WANG H, ZHANG Q, CHU X. Graphene oxide-peptide conjugate as an intracellular protease sensor for caspase-3 activation imaging in live cells[J]. Angewandte Chemie, 2011, 50(31):7065-7069.
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