收稿日期:２０２０Ｇ１０Ｇ２５.
基金项目：国家自然科学基金资助项目(３１４７１６４８
).作者简介：刘晓芳(１９９１－)，女，硕士生.∗通信作者：付金衡(１９７０－)，男，副教授.E Ｇm a i l :f u j i n h e n g
＠n c u ．e d u ．c n .㊀㊀文章编号:１００６Ｇ０４６４(２０２１)０１Ｇ００３４Ｇ０７
刘晓芳１a ,b ，刘㊀贝１a ,b ，周方月b ，黄云祥１a ,b ，钟引凤１a ,b
，张茹云b ，梁宇芳b ，王㊀丹２∗，付金衡b ∗
(１．南昌大学a ．生命科学学院，江西南昌㊀３３００３１;b ．中德联合研究院，江西南昌㊀３３００４７;
２．江西农业大学，江西南昌㊀３３００４５
)摘㊀要：将增强型绿荧光蛋白(E n h a n c e dG r e e nF l u o r e s c e n tP r o t e i n ,e G F P )免疫 羊驼后构建纳米抗体免疫库，固相淘选e G F P 纳米抗体；构建E ．c o l i R o s e t t a 表达载体，诱导表达纳米抗体，并鉴定其结合活性及特异性；辣根过氧化物酶(H o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ,H R P ) 标纳米抗体，确定其工作浓度及稳定性；将纳米抗体与纳米磁珠偶联应用于免疫沉淀B １３ＧE G F P 融合蛋白.四免后抗血清滴度超过１．２８ˑ１０６，获得库容量为１．８５ˑ１０８
c f u 的抗e G F P 纳米抗
体噬菌体展示文库；原核表达１０种独特基因序列的纳米抗体，均为可溶性表达；采用F o r t e B i oO c t e t 确定出纳米抗 体４－２８与e G F P 的亲和常数(K D )最高，达到９．６７ˑ１０－１１
M ；纳米抗体４－２８与e G F P ㊁绿荧光蛋白(G r e e nF l u o Ｇ
r e s c e n tP r o t e i n ,G F P )特异性结合;H R P 标记纳米抗体４－２８检测范围是１ １００００~１ ２５０００(浓度１００~４０n g m L －１)，比市场上现有的检测二抗(稀释范围１ ５０００~１ ２００００)灵敏度更高；纳米抗体４－２８偶联羧基化纳米磁珠，免疫沉淀B １３－e G F P 融合蛋白，实现了简单快速分离目的蛋白B １３－e G F P .关键词：纳米抗体;e G F P ；噬菌体展示;E L I S
A ;I P 中图分类号:Q ８１９㊀㊀㊀㊀文献标志码:A
S c r e e n i n g a n da p p l i c a t i o no f h i g ha f f i n i t y e
G F Pn a n o b o d i e s L I U X i a o f a n g １a ,b ,L I U B e i １a ,b ,Z HO U F a n g y u e b ,HU A N G Y u n x i a n g １a ,b
,
Z HO N G Y i n f e n g １a ,b ,Z H A N G R u y u n b ,L I A N G Y u f a n g b ,WA N G D a n ２,F UJ i n h e n g
b ∗
(１a ．I n s t i t u t e o fL i f eS c i e n c e s ,N a n c h a n g U n i v e r s i t y ,N a n c h a n g ３
３００３１,C h i n a ;b ．S i n o ＧG e r m a n y J o i n tR e s e a r c h I n s t i t u t e ,N a n c h a n g U n i v e r s i t y ,N a n c h a n g ３
３００４７,C h i n a ;２．J i a n g x iA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,N a n c h a n g ３
３００４５,C h i n a )A b s t r a c t :T h e p e r i p h e r a l b l o o d o f e G F P i mm u n i z e d a l p a c aw a s u s e d t o c o n s t r u c t a n a n o b o d y
i mm u n e l i b r a r Ｇy ,a n d t h e e G F Pn a n o b o d y w a s s o l i d Ｇp h a s e p a n n e d ．T h e E ．c o l i R o s e t t ae x p
r e s s i o nv e c t o rw a s c o n s t r u c t e d a n de x p r e s s e dn a n o b o d y ．T h eb i n d i n g a c t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y o f n a n o b o d y w e r e i d e n t i f i e d ．T h ew o r k i n g c o n Ｇc e n t r a t i o na n d s t a b i l i t y o f t h e e n z y m e Ｇl a b e l e dn a n o b o d y w a s v e r i f i e d a f t e rH R Pe n z y m e Ｇl a b e l e dn a n o b o d y
．T h en a n o b o d y a n dn a n o m a g n e t i cb e a d sw e r e c o u p l e d t oo b t a i nt h eB １３ＧE G F Pf u s i o n p r o t e i nb y i
mm u n o Ｇp r e c i p i t a t i o n ．A f t e r f o u r i mm u n i z a t i o n s ,t h e a n t i s e r u mt i t e r e x c e e d e d １．２８ˑ１０６
a n d t h e e G F Pn a n o
b o d y l
i Ｇb r a r y w i t ha s t o r a g e c a p a c i t y o f １．８５ˑ１０８c f uw a s o b t a i n e d ．N a n o b o d i e s o f t e nu n i q u e g e n e s e q
u e n c e sw e r e e x p r e s s e d i n p r o k a r y o t i c c e l l s ,a n d t h e y w e r e a l l s o l u b l e i n t r a c e l l u l a r l y
．N a n o b o d i e s ４－２８h a v e t h e b e s t a f Ｇf i n i t y c o n s t a n t (K D )w i t he G F Pb y F o r t e B i oO c t e t ,r e a c h i n g ９．６７ˑ１０－１１
M ;N a n o b o d y ４－２８s p e c i f i c a l l y
b i n d sw i t h e G F Pa n dG F P ．T h e d e t e
c t i o n r a n g e o f t h eH R Pe n z y m e Ｇl a b e l e dn a n o b o
d y ４－２
８w a s １ １００００~１ ２５０００(１００~４０n g m L －１),w h i c h i sh i g h e r t h a ne x i s t i n g d e t e c t i o ns e c o n d a r y a
n t i b o d i e so nt h e m a r k e t (d i l u t i o n r a n g e １ ５０００~１ ２００００)．N a n o b o d y ４－２８w a s c o u p l e dw i t hc a r b o x y l a t e d m a g
n e t i c n a n o b e a d s t o i mm u n o p r e c i p i t a t e t h eB １３Ｇe G F Pf u s i o n p r o t e i n ,l e a d i n g t oas i m p l ea n dr a p i ds e p
a r a t i o no f t h e t a r g
e t p r o t e i nB １３Ｇe G F P ．K e y w
o r d s :N a n o b o d y ;e G F P ;P h a g e d i s p l a y ;E L I S A ;I P 第４５卷第１期２０２１年２月
㊀㊀㊀
㊀㊀㊀
南昌大学学报(理科版)
J o u r n a l o fN a n c h a n g U n i v e r s i t y
(N a t u r a l S c i e n c e )V o l ．４５N o ．１
F e b ．２０２１
㊀
㊀㊀S h i m o m u r e等首次分离出的G F P[１]具有β桶和αＧ螺旋使其性质稳定[２]，研究者常把它作为一种标签分子应用于抗体检测[３－４]㊁单分子荧光成像[５]㊁细胞内定位[６－７]等领域[８].G F P/e G F P作为最常用的工具蛋白，在生命科学研究中具有很高的研究与应用价值，抗G F P/e G F P纳米抗体应运发展.与传统抗体相比，具有小体积,１５K D a分子质量；耐酸耐热较高稳定性㊁穿透力强㊁易于基因工程改造及表达㊁亲和性高等优点[９－１０]的纳米抗体被广大科学研究者应用于各领域[１１]，例如在发育生物学中的有机体和细胞培养系统中[１２－１３]，作为稳定生物学中构象状态的结晶伴侣[１４,１５]；作为酶的活性调节剂或抑制剂[１６,１７]；作为生物化学分析的免疫组化试剂[１８]或作为 二抗 检测抗鼠抗I g的免疫印迹和免疫荧光[１９]等.特异性结合G F P/e G F P的抗G F P/e G F P纳米抗体在亚细胞定位[２０]㊁细胞内信号通路研究和活细胞成像[２１－２２]以及靶向纳米材料[２２]等方面被广泛应用.但对高亲和力的抗G F P/e G F P纳米抗体的研究鲜少报道.
ccenter本研究以e G F P蛋白免疫羊驼皮下部位，构建抗e G F P纳米抗体噬菌体展示文库；经过四轮淘选获得能与e G F P结合的纳米抗体，通过基因克隆技术在大肠杆菌R o s e t t a中表达，获得了高亲和力的纳米抗体４－２８,H R P酶标纳米抗体４－２８作为检测 二抗 ，简化E L I S A实验操作，纳米抗体４－２８偶联纳米磁珠，免疫沉淀B１３Ｇe G F P融合蛋白，为抗e G F P纳米抗体的应用奠定基础.
１㊀材料与方法
１．１㊀实验材料与试剂
led数码管显示屏M１３辅助噬菌体㊁噬菌粒载体p C o m b３X S S㊁E．c o l i T G１㊁E．c o l i D H５α㊁R o s e t t a(D E３)㊁p E T－２５b (＋)载体均由本实验室保存；弗氏佐剂购自S i g m a 公司；质粒提取试剂盒㊁D N A纯化试剂盒㊁割胶纯化试剂盒购自天根生物有限公司;T a q酶㊁核酸内切酶㊁D N A连接酶等均购自T a K a R a公司;M１３B a cＧt e r i o p h a g eA n t i b o d y(H R P)购自北京义翘神州科技有限公司;H R P A n t iH i sＧT a g M o u s e M o n o c l o n a l A n t i b o d y购自北京康为世纪生物科技有限公司；人外周血淋巴分离液㊁所需引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司. 巢式P C R扩增V HH基因，所需引物分别为:
V HＧL D:C T T G G T G G TC C T G G CT G C
C H２ＧR:G G T A C G T G C T G T T G A A C T G T TC C
V HH１:C A T G C C A T G A C T G T G G C C C A GＧG C G G C C C A G K T G C A G C T C G T G G A G T C
V HH２:C A T G C C A T G A C T C G C G G C C G G CＧC T G G C C A T G G G G G T C T T C G C T G T G G T G C G V HH３:C A T G C C A T G A C T C G C G G C C G G CＧC T G G C C G T C T T G T G G T T T T G G T G T C T T G G G １．２㊀实验仪器与设备
台式高速冷冻离心机㊁酶标仪㊁N a n o D r o p购自T h e r m o公司；超声波细胞粉碎机购自宁波新芝公司；凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司；电泳仪购自B I OＧR A D公司；恒温培养箱和恒温摇床购自上海一恒科技公司;P C R仪购自艾本德公司;
D Y YＧI I I I稳压电泳购自为北京六一仪器厂.１．３㊀方法
１．３．１㊀噬菌体展示文库的构建
分别取免疫前静脉血作阴性组和每次免疫后静脉血，监测血清效价；取e G F P四免羊驼后的静脉血５０m L提取总R N A，然后反转录成c D N A，两步巢式P C R进行扩增V HH基因，将纯化后的V HH基因克隆至M１３噬菌粒载体p C o m b３X S S上，电转至E．c o l i T G１感受态细胞中，得到噬菌体文库.１．３．２㊀抗e G F P纳米抗体的淘选与鉴定
采用固相亲和淘选的方法，以e G F P为靶标从噬菌体文库中淘选特异性结合e G F P的纳米抗体.淘选策略如下,１)逐轮降低抗原包被在酶标板孔中的浓度:１００~１μg m L－１;２)每轮均投入纳米抗体文
库:１．０ˑ１０１２c f u,３)逐轮降低抗体库与抗原结合时间：第１轮结合６０m i n，第２轮结合３０m i n，第３~４轮结合１５m i n;４)逐轮增加洗涤次数：第一轮分别用磷酸盐吐温缓冲液(P B S T)和磷酸盐缓冲液(P B S)各洗涤５次，第二㊁三㊁四轮各洗涤１０,１５,２０次;５)噬菌体洗脱：先采用p H４．０的甘氨酸－盐酸洗脱掉亲和力较低的噬菌体，然后再采用p H２．２的甘氨酸－盐酸洗脱得到特异性噬菌体，每一轮的洗脱条件一致.采用间接p h a g eＧE L I S A鉴定从第３,４轮测定洗脱物滴度的平板上各随机挑取的４５个单菌落，确定阳性克隆.
１．３．３㊀抗e G F P纳米抗体的原核表达与纯化１)P C R扩增出阳性噬菌体克隆子片段;N c oI 和N o t I分别酶切４－２８基因与p E T－２５b(＋)，将纯化的目的片段与表达载体用T４D N A连接酶１６ħ过夜连接，连接产物转化至R o s e t t a(D E３)感受态中；菌落P C R验证随机挑取的１０个克隆子并测序.
５３
第１期㊀㊀㊀㊀㊀刘晓芳等：高亲和力抗e G F P纳米抗体的筛选与应用
２)１％接种量转接至１００m L培养基,３７ħ２２０r m i n－１震荡培养至O D６００ʈ０．６－０．８时加入终浓度为０．１mm o l L－１I P T G,３０ħ２２０r m i n－１震荡培养６h；收集培养物;P B S重悬离心后的菌体，将超声破碎后的上清经N iＧN T A R e s i n纯化,S D SＧP A G E分析纯化结果.
１．３．４㊀E L I S A鉴定抗e G F P纳米抗体活性及特异性
１)将１μg m L－１的e G F P４ħ过夜包被; P B S T甩洗３次,４％脱脂乳３７ħ封闭１h;P B S T甩洗３次,１００μL 孔－１加入稀释至不同浓度纯化后的纳米抗体４－２８,３７ħ孵育３０m i n;P B S T洗板３次，加入二抗,３７ħ孵育３０m i n;P B S T甩洗拍干６次，加入预热的T M B单组份显液,３７ħ孵育８－１０m i n，最后加入浓H２S O４终止液终止反应，酶标仪测O D４５０.
２)分别将e G F P,G F P，黄荧光蛋白(Y F P)，牛血清白蛋白(B S A)，卵清蛋白(O V A)稀释至１μg m L－１包被于酶标板中，按照１)的实验方法进行操作，测O D４５０.
１．３．５㊀亲和力测定
采用O C T E T系统生物传感器测定纳米抗体４－２８与e G F P的亲和力，将２００μL生物素化的e GＧF P固定在链酶亲和素的探针上，洗涤，加入２００μL 纳米抗体，使抗原抗体结合，结束后进行解离；最后通过软件进行拟合运算计算出动力学参数.１．３．６㊀H R P偶联纳米抗体４－２８及工作浓度和稳定性鉴定
１)采用过碘酸钠法将H R P偶联抗e G F P纳米抗体４－２８，向０．３m g的溶于H A cＧN a A c㊁(p H５．６)溶液中H R P中加入N a I O４，使其H R P表面的糖分子氧化成醛基,１mm o l L－１醋酸钠
缓冲液(p H４．４)每隔４h透析两次后，加入１５０μg的纳米抗体(４－２８)４ħ反应４h，加入C H３B H N a(５m o l L－１)反应后用乙醇胺封闭，加入终饱和度４５％的硫酸铵粉末，离心取沉淀即为偶联物.２)直接E L I S A鉴定其工作浓度及稳定性，分别包被e G F P和B S A/O V A１μg m L－１，封闭后加入稀释不同倍数的H R P偶联纳米抗体４－２８，加入预热的T M B单组份显液反应８－１０m i n后终止，测O D４５０值.分别将放置－２０ħ２个月和６个月的H R P偶联纳米抗体４－２８直接E L I S A(同上)的实验操作验证其稳定性.
１．３．７㊀B１３ＧE G F P融合蛋白的原核表达与纯化
分别将e G F P P C R产物和p E T－２５bＧB１３经H i n d I I I㊁N h e I双酶切后T４D N A连接酶连接，钙转至R o s e t t a(D E３)感受态中；随机挑选５个克隆子菌落P C R后测序.诱导表达与纯化参照１．３．３操作.
１．３．８㊀纳米抗体４－２８偶联纳米磁珠及免疫沉淀B１３ＧE G F P融合蛋白
１)羧基化的纳米磁珠偶联高亲和力的纳米抗体４－２８，在磁力架的作用下，将磁珠固定在离心管壁上，活化３~４次，加入活化缓冲液㊁E D C和S u l f oＧN H S，室温孵育１５m i n；磁珠被固定在管壁上后吸弃上清，加入纳米抗体４－２８适时反应后４ħ过夜偶联；重复封闭两次，加入保存液４ħ保存备用.２)根据抗原抗体反应原理，免疫沉淀B１３Ｇe GＧF P融合蛋白.将含有p E T－２５bＧB１３
Ｇe G F P质粒的R o s e t t a细胞诱导表达后超声破碎，加入抗e G F P 纳米抗体４－２８偶联磁珠，并用碳酸盐缓冲液(C B S)洗涤磁珠沉淀物３次，去除未结合的杂蛋白, S D SＧP A G E鉴定上清液和磁珠沉淀物.
２㊀结果与讨论
２．１㊀噬菌体展示文库的构建
四免后的羊驼抗血清滴度超过１．２８ˑ１０６(图１a).采用两步巢式P C R扩增V HH基因，第一步扩增得到了约７５０b p的片段(图１b)，第二步扩增得到了约５００b p的目的基因(图１c)；将V HH基因克隆至M１３噬菌粒载体p C o m b３X S S后转化至E．c o l i T G１，收获到库容量为１．８５ˑ１０８c f u纳米抗体原始库，经M I３K O７救援后得到滴度为４ˑ１０１３c f u m L－１的噬菌体展示文库.
２．２㊀抗e G F P纳米抗体的淘选与鉴定
抗体的亲和常数K D＝K o f f(解离常数)/K o n (结合常数),K D值越小，抗体的亲和力越高.本研究拟获得高亲和力的抗e G F P纳米抗体，因此在原有的基础上适当调整了淘选策略.通过逐轮降低抗
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
1：2
1：4
1：8
1：16
1：32
1：64
1：1281：1
阴性血清
三免血清
四免血清
O
D4
5
稀释比/W
(a)
６３ 南昌大学学报(理科版)２０２１年㊀
750bp
(b
)500bp
(c
)㊀㊀泳道M :D N A m a r k e rD L ２０００；泳道１：巢式P C R 第一步扩增产物；泳道２：巢式P C R 第二步扩增产物(V HH １和
V HH ２引物对扩增)泳道３：巢式P C R 第二步扩增产物(V HH １和V HH ３引物对扩增)
.图１㊀血清效价(a )及巢式P C R 扩增产物电泳图(b ㊁c )原包被浓度㊁逐轮减少抗体文库与抗原的结合时间，以期保留K o n 值较大的纳米抗体;
通过逐轮增加洗涤次数㊁并在洗脱前用p H ４．０的甘氨酸盐酸除去
K o f f 相对较大的纳米抗体，淘选数据(表１)中表明抗e G F P 特异性纳米抗体有效富集(
富集度为５２．１７
)；由于第三四轮淘选时，包被抗原的浓度依次从２０降低到５再到１μg m L －１以及逐轮增加淘选条件严格程度，使第三轮和第四轮的回收率和富集度没有明显增加，甚至出现了一定程度的降低(富集度小于１)，该结果表明，本研究采用的淘选策略有效的富集了高亲和力纳米抗体，除掉了低亲和力纳米抗体.采用间接E L I S A 鉴定第３㊁４轮克隆子，结果如图２㊁３所示，阳性率达到了９５．５６％和９７．７８％;
２采用D N A s t a r 软件进行多序列对比分析，得到了１０
表１㊀淘选结果
淘选
轮次噬菌体投入量/c f u
噬菌体洗脱量/
(c f u m L －１)
回收率富集度１１．０ˑ１０１２
１．３８ˑ１０７１．３８ˑ１０－５
２１．０ˑ１０
１２７．２ˑ１０
８７．２ˑ１０－４
５２．１７３１．０ˑ１０
１２１．９８ˑ１０８１．９８ˑ１０－４０．２７５４
１１．０ˑ１０
１２
２．２３ˑ１０
８
２．２３ˑ１０－４
１．１３
种纳米抗体序列；将这１０种纳米抗体的噬菌体分别稀释至同一浓度，采用E L I S A 测试其结合活性，结果如图４所示，克隆
内嵌模组４－２８的O D ４５０最高.
O D 450
2
1
N C ：阴性对照;B K :
空白对照.图２㊀间接E L I S A 鉴定阳性克隆
平行流冷凝器
O D 450
21
N C ：阴性对照;B K :
空白对照.图３㊀间接E L I S A 鉴定阳性克隆
2.01.51.00.50
1：6401：3201：1601：801：401：201：11
：1280O D 450
3-2
3-63-333-353-44
3-454-184-284-33
4-38
稀释比
图４㊀E L I S A 测定阳性噬菌体克隆
２．３㊀原核表达载体的构建与表达
按照１．３．３的方法构建原核表达载体，菌落P C R 验证如图５所示，将７５０b p 处条带测序且测序结果显示序列正确，表达载体构建成功.将构建好
的表达载体转化至大肠杆菌R o s e t t a 感受态中,I P T G
750bp
㊀㊀泳道M :D N A m a r k e rD L ２０００；泳道１－１０:
随机挑取的转化子.图５㊀转化子菌落P C R 验证
７３ 第１期㊀㊀㊀㊀㊀
刘晓芳等：高亲和力抗e G F P 纳米抗体的筛选与应用
(０．１mm o l L －１)３０ħ诱导表达６h 后超声破碎，破碎上清经N i ＧN T A R e s i n 纯化后得到与预期大小相符的２０k D a 左右的纳米抗体４－２８蛋白(
图６),B C A 定量蛋白浓度为１．２m g
m L －１.20KDa
97.266.444.329.020.1
14.3
KDa ㊀㊀M ：蛋白m a r k e r ；泳道１：诱导前菌体总蛋白；泳道２：诱导后菌体总蛋白；泳道３：破碎上清；泳道４：破碎沉淀；泳道
５：镍柱纯化流穿液；泳道６ ２０mm o l L －１咪唑洗涤液；泳道７ １００mm o l
L －１咪唑洗脱液.图６㊀４－２８在E ．c o l i B L ２１(D E ３)中诱导表达的S D S ＧP A G E ２．４㊀抗e G F P 纳米抗体的结合活性及特异性分析
采用E L I S A 分析的结合活性，如图７所示，随着抗e G F P 纳米抗体４－２８浓度的增加，其O D ４５０值逐渐升高并趋于稳定，表明纳米抗体４－２８结合活性良好；将e G F P /G F P /Y F P /B S A /O V A 稀释至相
同浓度包被后，加入相同浓度的纳米抗体，测
O D ４５０，如图８所示，该抗体和e G F P ㊁G F P 蛋白结合，和Y F P ㊁B S A ㊁O V
A 结合很弱或不结合,
表明纳2.21.8
1.41.00.6
O D 450
1
0.1
10
抗体浓度/(μ
g m L －１
)(a
) 2.01.5
1.00.50
O D 450
GFP eGFP YFP OVA
BSA 抗原
(b
)㊀㊀e G F P ：增强型绿荧光蛋白;G F P :
绿荧光蛋白;Y F P ：黄荧光蛋白;B S A ：牛血清白蛋白;O V A :
卵清蛋白.图７㊀纳米抗体结合活性(a )和特异性验证(b
)米抗体４－２８特异性良好.
２．５㊀亲和力测定分析
采用F o r t e B i oO c t e t 研究纳米抗体与e G F P 的亲和力.结果如图８所示，纳米抗体４－２８的结合
常数(K o n )和解离常数(K o f f )
分别为２．７４ˑ１０５
M －１和２．６５ˑ１０－５M －１s －１，则K D 为９．６７ˑ１０－１１
M .表２为１０种独特序列的抗e G F P 纳米抗体的亲和力
常数(K D )，其中３－２和３－４５未检测到信号.纳米抗体作为单价抗体，只有一个结构域，其亲和力与传统单克隆抗体相比较低，已有文献报道的纳米抗体亲和力常数多在１μM－１n M .本研究获得的纳米抗体４－２８亲和力相对较高，表明实验中采用的淘选策略是正确的.
1.00.80.60.40.20
B q i n d i n g /n m Concentration/nm
miad530100
25
Sensor Fit
400
2000T /s
图８㊀４－２８与e G F P 动力学结合曲线
表２㊀１０种纳米抗体亲和力常数
抗体编号
３－６３－３３３－４４３－４５４－１８４－２８
４－３２４－３８３－２
３－３５K D (n M )
５．３５
０．５９
５．６７
０．１２
４．７９
０．０９６７０．４４９
０．３１９
２．６㊀H R P 标记纳米抗体４－２８工作浓度及稳定性
鉴定
如图９所示,４ħ放置一周后,
抗体活性下降,－２０ħ放置,
时间长短对抗体活性无影响，由图９可知该酶标抗体的使用稀释范围为１ １００００~１
２５０００(浓度１００~４０n g
m L －１)，相比于市场上现有的检测二抗(稀释范围１ ５０００~１ ２００００)其灵敏度更高.
27.5g bt
２．７㊀融合蛋白的诱导表达及免疫沉淀
表达后的B １３Ｇe G F P 融合蛋白经N i 柱纯化时，仅用１００mm o l
L －１咪唑洗脱目的蛋白，结果如图１０a 所示，获得分子量为４５k D a 左右的胞内可溶性
８３ 南昌大学学报(理科版)
２０２１年㊀
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