三氧化⼆砷三元复合物纳⽶递送系统的构建及评价
摘要：⽬的以⽜⾎清⽩蛋⽩（bovineserum albumin ，BSA ）为天然药物载体，通过形成砷硫键负载三氧化⼆砷（arsenictrioxide ，ATO ），酰胺化反应连接光敏剂⼆氢卟吩e6 （chlorin e6 ，Ce6 ），构建基于BSA 的载ATO 三元复合物纳⽶递送系统，旨在解决ATO 在脑胶质瘤时体内⽣物分布不良、难以跨越⾎脑屏障（bloodbrain barrier
，BBB ）等问题，使其更有效地⽤于脑胶质瘤。⽅法通过形成砷硫键和酰胺化反应分别将ATO 和Ce6 与BSA 结合制备三元复合物纳⽶粒ATO-BSA@ Ce6 ，采⽤纳⽶粒度分析仪考察ATO-BSA@Ce6 的粒径分布、多分散系数（polydispersity index ，PDI ）、ζ电位；透射电⼦显微镜（TEM ）观察其形态；紫外可见分光光度计（UV-visspectrophotometer ）考察UV-vis 吸收光谱；荧光分光光度计考察荧光光谱和制剂活性氧（reactiveoxygen species ，ROS ）产⽣；傅⾥叶变换红外（Fourier transforminfrared ，FTIR ）光谱验证ATO 的载⼊；电感耦合等离⼦体质谱（inductively coupledplasma mass spectrometry ，ICP-MS ）和UV-vis 分光光度计分别测定ATO 和Ce6 的包封率、载药量；透析袋法考察不同pH 值下的体外释放⾏为。对ATO-BSA@Ce6 进⾏细胞摄取及机制、细胞毒性、LIVE/DEAD 染⾊、ROS ⽔平和体外跨越BBB 等体外细胞学研究，并通过⼩⿏尾iv 对其脑靶向性进⾏考察。结果成功制备了三元复合物纳⽶粒ATO-BSA@Ce6 ，在TEM 下可观察到其形态规整，呈圆整球状分布，⼤⼩均匀，测得其粒径为（112.73±4.91 ）nm ，ζ电位（−10.86 ±1.19 ）mV 。通过ICP-MS 测定ATO 的包 兔子全自动设备
封率为（66.72 ±1.43 ）% 、载药量为（10.83±0.21 ）% ；Ce6 的包封率为（91.50 ±0.51 ）% 、载药量为（3.45 ±0.32 ）% 。UV-vis 吸收光谱、荧光光谱及FTIR 光谱结果证明Ce6 、ATO 与BSA 的成功连接。体外ROS ⽣成实验结果表明Ce6 与BSA 的结合不影响其ROS 产⽣。体外释放实验结果表明ATO 及Ce6 具有pH 响应性释放。细胞摄取和细胞毒性实验表明其具有较强的⼊胞能⼒和体外抗肿瘤活性。体内活体成像实验表明其具有较强的跨越BBB 的能⼒并到达脑部。结论 ATO-BSA@Ce6 纳⽶递送系统能够有效增加ATO 跨BBB 转运，增强对GL261 细胞的细胞毒性，为脑胶质瘤提供了新策略。三氧化⼆砷（arsenic trioxide ，ATO ）为传统中药的主要成分，经砒⽯升华⽽得，常温下呈⽩⾊霜状粉末，⽆臭⽆味，微溶于⽔。⾃古以来，中医药就应⽤砷和含砷药物各种难治性疾病[1]，但其毒性限制了其医学应⽤。20 世纪70 年代，我国学者⾸次将ATO ⽤于急性早幼粒细胞⽩⾎病（acute promyelocytic leukemia ，APL ）的，并且疗效显著[2-4]。随着ATO 在APL 中的成功，ATO 在其他⾎液肿瘤和实体瘤中的应⽤得到了积极的研究。最近的研究表明，ATO 通过诱导肿瘤细胞⾃噬、凋亡等发挥抗肿瘤作⽤，有效抑制肝癌、肺癌和乳腺癌等实体瘤的⽣长[5-8]。在胶质瘤中，ATO 通过靶向胶质瘤相关癌基因（glioma-associated oncogene homolog ，GLI ）转录效应物对抗刺猬（Hedgehog，Hh ）信号通路，抑制肿瘤细胞的⽣长与发展[9-10]；通过诱导细胞凋亡和⾃噬、诱导细胞有丝分裂周期阻滞发挥抗肿瘤作⽤[11-12]；促进细胞内活性氧（reactive oxygen species ，RO
S ）的产⽣，导致氧化损伤[13]。ATO 可以降低胶质瘤⼲细胞标志物SOX2 、CD133 的表达，抑制Hh 和Notch 通路，抑制其DNA 修复能⼒，降低耐药性[14-15]。此外，ATO 还可增强放疗和化疗的效果。然⽽，由于其较差的⽣物安全性和狭窄的药物安全窗⼝，静脉给药到达肿瘤部位并进⼊肿瘤细胞的量极低。⾼剂量下的不良反应、⾼肾清除率和低⾎脑屏障（blood brain barrier ，BBB ）通透性阻碍了其在胶质瘤中的应⽤。
纳⽶技术的迅速发展为提⾼化疗疗效和降低化疗毒性提供了可能的途径。纳⽶粒在肿瘤组织中独特的增强渗透性和保留（enhanced permeability and retention ，EPR ）效应以及其结构特征（单分散性、均匀性、形态、表⾯修饰和可调⼤⼩）为ATO 的肿瘤杀伤作⽤提供了基础。纳⽶材料被⽤作ATO 的载体以促进其抗肿瘤作⽤，克服其肿瘤富集不⾜的限制，同时减少其不良反应[16]。学者们研究了多种材料作为ATO 的纳⽶载体，包括脂质体[17-18]、蛋⽩质[19]、聚合物[20-21]、⽆机纳⽶粒等[7,22]。其中，基于蛋⽩质的纳⽶载体由于其⾼结构稳定性、优异的⽣物相容性、极好的⽣物降解性和易于裁剪性，已迅速成为极具吸引⼒的药物递送载体[23]。
⽜⾎清⽩蛋⽩（bovine serum albumin ，BSA ）是⾎浆中含量丰富的内源性蛋⽩质。BSA 不仅对⾎浆中的内源性溶质（包括⾦属离⼦、脂肪酸、氨基酸和代谢物）具有⾮凡的结合亲和⼒，⽽且对许多外源物也具有⾼效的结合亲和⼒，例如紫杉醇、铂基药物和⼆氢卟吩e6 （chlorin e6 ，Ce6 ）[24]。受先前研究的启发，通过砷- 硫键将ATO 与负载
光敏剂Ce6 的BSA 分⼦结合，开发了⼀种具有脑胶质瘤靶向性、促BBB 渗透的多功能三元复合物纳⽶药物递送平台（ATO-BSA@Ce6 ）。通过联合Ce6 的光动⼒（photodynamic therapy ，PDT ）作⽤，起到协同抗肿瘤的效果，增强ATO 靶向性的同时，降低其不良反应。
1仪器与材料
2⽅法与结果
2.1ATO-BSA@Ce6的制备
将0.88 mg Ce6 ，0.28 mg EDC ，0.18 mg NHS 与200 µL DMSO 混合，室温搅拌1 h 。加⼊⾄含BSA （2 mg/mL ）的PBS 缓冲液中，避光磁⼒搅拌过夜。14 800 r/min 离⼼5 min ，去除聚集物，此为BSA@Ce6 。将制备的BSA@Ce6 ⽤60 mmol/L GSH 处理1 h ，破坏分⼦内⼆硫键并暴露游离巯基。加⼊1 mL ATO 溶液，室温搅拌2 h 。将所得的三元复合物在超纯⽔中于4 ℃下透析（截留相对分⼦质量8000 ～14 000 ）24 h ，以去除过量的ATO 和GSH 。
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2.2 ATO-BSA@Ce6的表征
2.2.1UV-vis 光谱测定通过UV-vis 分光光度计扫描含相同Ce6 质量浓度（2 µg/mL ）的Ce6 、BSA@Ce6 和ATO-BSA@Ce6 溶液，测定其在紫外、可见和近红外范围内的吸收光谱，以验证制备
成功。结果如图1 所⽰，BSA@Ce6 和ATO-BSA@Ce6 在404 nm 及660 nm 处有2 个典型的特征峰，这与Ce6 的紫外吸收峰保持⼀致，证明Ce6 与BSA 的成功结合。
手机绑定2.2.2荧光光谱通过荧光分光光度计扫描含相同Ce6 质量浓度（2 µg/mL ）的Ce6 、BSA@Ce6 和ATO-BSA@Ce6 溶液，测定其在500 ～800 nm 的荧光光谱。如图2 所⽰，BSA@Ce6 和ATO-BSA@Ce6 在665 nm 处有明显的发射峰，相较于Ce6 在650 nm 处的发射峰位置有所偏移，这可能是酰胺键的形成导致发射峰发⽣偏移。
2.2.3FTIR 光谱采⽤KBr 压⽚法对ATO 、BSA 、BSA@Ce6 、ATO ＋BSA ＋Ce6 的物理混合物、ATO-BSA@Ce6 进⾏红外光谱分析以验证ATO 的成功载⼊。光谱波长记录范围为400 ～4000 cm −1，分辨率2 cm −1。研究了游离未结合BSA 的3 种模式，包括由C ＝O 拉伸（1700 ～1600 cm −1）产⽣的酰胺带I 、由N-H 弯曲和CN 伸缩振动（1600 ～1480 cm −1）产⽣的酰胺带II 和由于C-N 拉伸模式与⾯内N-H 弯曲和3300 cm −1处的N-H 振动耦合产⽣的酰胺带III （1400 cm−1）。ATO、BSA、BSA@Ce6、ATO＋BSA＋Ce6 的物理混合物、ATO-BSA@Ce6 的FTIR 光谱如图3 所⽰。在ATO 的光谱中，于800 cm −1处检测到特征As-O 峰。在ATO ＋BSA ＋Ce6 的物理混合物组中也可以看到相同的峰以及具有BSA 特征的其他峰，且基本仅是图谱的叠加，说明ATO 与BSA 未发⽣反应，
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仅是简单的混合物形式存在。在与ATO 相互作⽤后，纯BSA 在1395 cm −1处的酰胺III带移⾄1402 cm−1，且强度增强[25]。物理混合物组显⽰存在BSA 的所有峰，没有峰位移。相对于纯BSA 和BSA@Ce6 ，ATO-BSA@Ce6 峰的偏移表明与ATO 的成功结合。
2.2.4粒径与ζ电位考察分别取BSA@Ce6 和ATO-BSA@Ce6 纳⽶粒溶液少许，加⼊适量蒸馏⽔稀释，使⽤动态光散射激光粒度仪测定其粒径、PDI 和ζ电位，结果见表1 。BSA@Ce6 的平均粒径为（66.1
5 ±0.58 ）nm ，PDI 为0.231
±0.060 ，负载ATO 后的ATO-BSA@Ce6 粒径明显增⼤，为（112.73 ±4.91 ）nm ，PDI 为0.269 ±0.020 ，ζ电位由BSA@Ce6 的（−5.76 ±0.99 ）mV 降低⾄（−10.86 ±1.19 ）mV 。粒径增⼤也表明ATO 的成功负载。
2.2.5外观形态分别取少量BSA@Ce6 和ATO-BSA@Ce6 纳⽶粒溶液，⽤蒸馏⽔稀释⾄合适的浓度，取10 µL 滴于200⽬碳膜铜⽹上，室温晾⼲后，⽤2% 磷钨酸负染，滤纸吸去磷钨酸染液，室温静置，晾⼲后在透射电镜下观察。结果如图4 所⽰，ATO-BSA@Ce6 粒径略⼤于BSA@Ce6 ，进⼀步表明ATO 的成功荷载。ATO-BSA@Ce6 呈规则球形，形态规整，分散均匀，粒径在60 nm 左右，略⼩于动态光散射激光粒度仪测定结果。
2.2.6包封率和载药量测定ICP-MS 测定载ATO 的包封率和载药量。取ATO-BSA@Ce6 纳⽶粒溶液0.2 mL ，依次加⼊浓硝酸、30% 过氧化氢以及浓盐酸加热消解。⽤超纯⽔稀释消解液⾄5 mL 后过0.45μm 滤膜，ICP-MS 进样测定。设定ICP-MS 仪器测试参数：射频功率1150 W ，等离⼦体体积流量13 L/min ，辅助⽓体积流量0.7 L/min ，雾化⽓体积流量0.9 L/min ，载⽓⾼纯氩⽓。根据以下公式计算ATO 的包封率和载药量分别为（66.72±1.43）%、（10.83±0.21 ）% 。通过测定紫外吸收测定Ce6 的包封率和载药量分别为（91.50 ±0.51 ）% 、（
3.45 ±0.32 ）% 。铜管焊接
2.2.7放置稳定性考察将ATO-BSA@Ce6 纳⽶粒溶液放置在4 ℃避光保存，在0 、2 、4 、6 d 取适量，测定粒径、ζ电位，考察放置稳定性。结果如表2 所⽰，4 ℃放置6 d ATO-BSA@Ce6 粒径和电位⽆明显变化，表明三元复合物纳⽶粒在溶液状态下具有良好的放置稳定性。
2.3ATO-BSA@Ce6ROS⽣成考察
光敏剂在适当波长的激光照射下可产⽣ROS ，从⽽诱导细胞损伤和凋亡。利⽤活性氧荧光探针DCFH-DA 检测ATO-BSA@Ce6 在激光照射过程中产⽣的ROS 。将DCFH-DA ⽤NaOH （0.01 mol/L ）处理30 min ，使其⽔解形成DCFH ，随后激光照射（635 nm ，120 mW/cm 2）含相同Ce6 质量浓度（2 µg/mL ）的Ce6 、BSA@Ce6 和ATO-BSA@Ce6溶液5 min ，产⽣的ROS 能氧化⽆荧光的DCFH ⽣成有荧光的DCF ，通过荧光分光光度计测定在激发波长504 nm 、发射波长529 nm 处的荧光强度。由表3 可知，ATO-BSA@Ce6 与BSA@Ce6 、Ce6 产⽣的ROS 荧光强度⽆显著性差异，表明Ce6 经过制剂制备及ATO 负载后其性质未发⽣改变，依然展现良好的ROS ⽣成能⼒。
2.4体外释放考察
三元复合物纳⽶粒的体外药物释放⾏为采⽤透析法进⾏，使⽤pH 7.4 或pH 6.5 的PBS 缓冲溶液为释放介质，或加10 mmol/L 的GSH 。将透析袋（截留相对分⼦质量8000 ～14 000 ）剪成合适长度的⼩段，置于20 mg/mL 的NaHCO 3和1 mmol/L EDTA 中煮沸10 min 进⾏预处理，并⽤超纯⽔洗净。吸取1 mL ATO-BSA@Ce6 溶液加⼊到处理好的透析袋中，两端⽤透析夹夹紧。置于100 mL PBS 溶液（漏槽条件）中，温度为（37.0 ±0.5 ）℃，转速 100 r/min ，分别在0.5 、1 、2 、4 、6 、8 、12 、24 h 的时间点吸取0.2 mL 透析介质中的溶液，并⽴即补充0.2 mL 新鲜的相应透析介质。样品加⼊2% 硝酸溶液稀释⾄5 mL ，放置过夜，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，通过ICP-MS 测定其中As 3+的含量，Ce6 含量参照上述测定步骤进⾏UV-vis 分析，计算累积释药率，并绘制释药曲线。体外释放结果如图5 ，游离ATO 在不同pH 值条件下释放较快，前2 h 释放量已经达到90% ；相反，纳⽶粒中ATO 在pH 7.4 条件下释放较为缓慢，24 h
在不同pH 值条件下释放较快，前2 h 释放量已经达到90% ；相反，纳⽶粒中ATO 在pH 7.4 条件下释放较为缓慢，24 h 后累积释药率为（57.03 ±2.61 ）% 。在pH 6.5 条件下初始释放速度较快，2 h 时即有（43.51 ±2.29 ）% 的累积释药率，具备明显的pH 敏感性，⽽后逐渐趋于平缓，24 h 的累积释放率为（68.37 ±4.03 ）% 。在含GSH 的弱酸性条件下，纳⽶粒中ATO 在24 h 时累积释放率为（90.37 ±3.49 ）% ，接近释放完全。游离Ce6 与纳⽶粒中的Ce6 在不同释放介质中均缓慢释放，且ATO-BSA
@ Ce6 中Ce6 释放同样具有pH 响应性，在pH 6.5 条件下，24 h 时累积释放率为（68.72 ±2.90 ）% 。
2.5GL261细胞对ATO-BSA@Ce6的细胞摄取
柱面投影
为了验证ATO-BSA@Ce6 是否能够有效地被肿瘤细胞摄取，⽐较了Ce6 和ATO-BSA@Ce6 在GL261 细胞中的摄取⾏为。将GL261 细胞以1 ×10 6个/ 孔的密度接种于12 孔培养板中，在37 ℃培养24 h 后，吸去培养液，PBS 洗涤3 次，分别加⼊含Ce6 和ATO-BSA@Ce6 （Ce6 2 µg/mL ）的⽆⾎清培养液孵育4 h ，随后⽤冷的PBS 洗涤细胞3 次，胰蛋⽩酶消化，收集细胞，并通过流式细胞术进⾏分析。结果见图6 ，GL261 细胞对ATO-BSA@Ce6 纳⽶粒的摄取远⾼于Ce6 ，表明ATO-BSA@Ce6 增强了GL261 细胞对Ce6 摄取的能⼒。纳⽶粒中药物细胞摄取量的增加有望提⾼抗肿瘤效果。
2.6GL261细胞对ATO-BSA@Ce6的细胞摄取机制考察
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