http ：//hljnykx. haasep. cn
DOI ：10 11942/j issn1002-2767 2021 06. 0087
：黑龙江农业科学2021(6)：87-92Heilongjiang Agricultural Sciences
张浩楠，高建伟•玉米赤霉烯酮完全抗原的制备及鉴定［J ］•黑龙江农业科学,021(6):87-92. 玉米赤霉烯酮完全抗原的制备及鉴定
张浩楠，高建伟
(齐齐哈尔大学 食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔161000)
摘要：为了降低基层检测部门检测谷物中玉米赤霉烯酮(ZEN )的成本，研制国产化检测试剂盒非常必要，而试 剂盒的研制离不开完全抗原的支持。本试验的主要内容是将ZEN 肟化，生成玉米赤霉烯酮肟(ZENO )，再用 DCC-NHS 活性酯法将ZENO 与牛血清白蛋白(BSA )、鸡卵白蛋白(OVA)偶联合成ZEN 完全抗原，最后透析 将未偶联的小分子ZEN 除去，得到的即为完全抗原。包被原ZEN-BSA 浓度为1. 62 mg - mL 1，免疫原
ZEN-OVA 浓度为1. 33 mg-mL 1。采用UV 法、SDS-PAGE 法对完全抗原进行鉴定，同时建立间接ELISA 方 法验证包被原ZEN-BSA 。结果表明：采用活性酯法合成的ZEN 完全抗原在319 nm 处出现新的吸收峰，且
SDS-PAGE 图表明ZEN-BSA 分子量集中在60〜70 kDa,ZEN-OVA 分子量集中在40〜50 kDa，不同于BSA 和OVA 分子量，但相差不大。根据紫外扫描图计算得到ZEN-BSA 结合比为7. 0 ： 1，ZEN-OVA 结合比为 6.1：1。根据免疫学方法可知,OD 450 nm 值随着毒素浓度的增加而减小。本试验利用3种方法对ZEN 完全抗 原进行鉴定，证明ZEN 完全抗原偶联成功。
关键词：玉米赤霉烯酮；抗原合成；酶联免疫吸附试验；毒素检测
玉米赤霉烯酮(ZEN，也称为F2霉菌毒素) 是由某些镰刀菌产生的次级代谢产物，是饲料和
谷物中最常见的污染物之一［1］。ZEN 是具有生 殖毒性、肝毒性、遗传和免疫毒性的化合物［］。为 了减少ZEN 对人类和家畜健康造成的严重危害,
目前至少有100个国家制定了有关食品中ZEN 上限的明确规则。欧盟修订(EC) 466/2001法 规(G/SPS/N/EEC/253)对一些食品内的ZEN
规定了欧盟统一的最大限量，主要内容如下：未加
工谷物(除玉米外)最大残留限量100 g g-kg 1；谷
粉(除玉米粉外)限量为75 g g • kg 1 ；在面包、蛋
糕、饼干中，限量为50 M g-kg 10我国2017年实 行的《食品安全国家标准食品中真菌毒素限
量(GB 2761 — 2017)》⑶中规定：供人食用的小麦 及玉米中，ZEN 最大限量为60 g g^kg 1。
目前ZEN 的检测方法主要有仪器分析方法
和免疫学方法。仪器分析方法主要有薄层
收稿日期:2021-02-06
基金项目：黑龙江省教育厅高教强省优势特学科-玉米重 点专项(LTSW201729)；黑龙江省教育厅植物性食品加工技 术特学科专项(YSTSXK201826)齐齐哈尔市科技计划市 校合作项目(SXSP-2019003)；黑龙江省教育厅基本业务专 项(135509321)黑龙江省自然科学基金留学归国人员科学 基金(LC2017014)黑龙江省普通本科高等学校青年创新人 才培养计划项目(UNPYSCT-2017157)。
第一作者：张浩楠(1995 —)，女，在读硕士，从事食品营养与 安全研究。 。
通信作者：高建伟(1982 —)，男，博士，讲师，从事食品营养与 安全研究。 E-mail ：16900279@qqcom 。
谱(TLC )4、高效液相谱(HPLC )［］和液相 谱串联质谱(LC-MS/MS )［］等。由于TLC 方法 样品制备繁琐、检测时间过长、检测限高、零敏度 差、特异性差等缺点，近些年在安全检测中基本不 再使用该法；HPLC 和LC-MS/MS 样品制备过
程过于复杂、仪器采购和后期维护成本较高、检测 时间过长等缺点导致了该方法只适用于实验室中
的痕量检测及验证性检测，不适用于现场快检和 大批量的样品检测。免疫测定方法因其具有较好
的灵敏性、可靠性、快速性、实用性和便携性而被 广泛用于食品安全监测［710］。在我国国标《饲料
中玉米赤霉烯酮的测定(GB/T 19540 —
2004)》［11］中，采用了 ELISA 方法来检测饲料用
谷物原料中的玉米赤霉烯酮，该方法的检测限为
0.000 25 g g'kg 1。
建立免疫测定方法的第一步和关键步骤是获 得具有高特异性和亲和力的抗体，而具有高特异
性和亲和力的抗体的产生依赖于半抗原分子设计
和抗原合成［12］。本研究结合相关文献报道，将
ZEN 与羧甲氧基胺半盐酸盐反应，合成半抗原
ZENG 羧甲氧基胺(ZENoxime )。然后通过碳
二亚胺法将半抗原与载体蛋白偶联制备ZEN 全 抗原，本研究中主要采用的载体蛋白是BSA 和
OVA 。并采用了多种鉴定方法对所合成的偶联
抗原进行鉴定，为后续免疫动物、制备单克隆抗体 和开发试剂盒等提供技术支持。
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评价•检测•环保黑龙江农业科学6期
1材料与方法
1.1材料d570
1.1.1试剂玉米赤霉烯酮（ZEN，美国Sigma 公司），牛血清蛋白（BSA，美国Sigma公司）鸡卵白蛋白（OVA，美国Sigma公司）羧甲氧基胺半盐酸盐（上海麦克林生化科技有限公司）毗啶（阿拉丁试剂有限公司）N-羟基琥珀酸亚胺（NHS，美国Sigma公司）N、N-二环己碳二亚胺（DCC，美国Sigma公司）二甲基甲酰胺（DMF，上海麦克林生化科技有限公司）丙烯酰胺（美国Amres-co公司）TEMED（美国Sigma公司）Tween-20（美国Sigma公司）3,3，,5,5l四甲基联苯胺（TMB，美国Amresco公司）无水四氢咲喃（阿拉丁试剂有限公司）三羟甲基氨基甲烷（TRIS，美国Amresco公司）甘油（德国BioRFOXX公司）o
1. 1.2仪器与设备HZQ-Q全温振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）,WD-9413A 凝胶成像分析仪（北京市六一仪器厂）Victor酶标仪（美国GE）Lambda750紫外-可见-近红外分光光度计（PerkinElmer）DY-24DN型电泳仪（北京市六一仪器厂）96孔酶标板（美国康宁公司）o
1.2方法
1.2.1ZEN半抗原合成参考王元凯等［13］的方法并稍作修改，具体方法如下：取1mg ZEN溶于1.2mL毗啶中，加入2mg O-羧甲基羟胺，室温搅拌反应24h o氮气吹干后，溶于4mL蒸馏水，调节pH至8.0，分3次分别加入1mL苯，未反应的玉米赤霉烯酮通过苯除去，保留水相。水相调pH至3.0，溶液变浑浊，用10mL乙酸乙酯分4次抽提，保留脂相，用无水硫酸钠滤过后吹干，得到淡黄油状物质即为玉米赤霉烯酮6-羧甲氧肟。
1.2.2包被原ZEN-BSA合成采用DCC-NHS 活性酯法［14］合成ZEN完全抗原：将上述得到的黄油状物溶于0.4mL无水四氢咲喃中，再加入6mg DCC和3mg NHS,30°C振摇60min, 2500g离心20min，保留上清液，氮气吹干后用二甲基甲酰胺溶解残留物。将上述溶液缓慢加入含15mg BSA的3mL碳酸氢钠（0.13mol*L_1）缓冲液中，4C摇动过夜，取上清液在10mmol-L-1 PBS溶液中透析3d，所得即为ZEN完全抗原,4C储藏备用，若长期储藏则需放在一20C冰箱中。
1.2.3免疫原ZEN-OVA合成同包被原ZEN-BSA合成方法。
1.2.4全抗原鉴定蛋白质浓度测定。选用紫外吸收法测定蛋白质浓度［15］o绘制标准曲线，以吸光度为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标建立标准曲线，具体步骤如下：配制1mg-mL-1的BSA 标准溶液，用pH7.4的PBS将蛋白溶液稀释成0,0.1,0.2,0.3,0.4和0.5mg-mL_1，测定OD280nm值并以此为纵坐标，牛血清蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。将待测溶液用PBS稀释50倍测定OD280nm值。根据标准曲线测定ZEN-BSA蛋白含量。同理测定ZEN-OVA蛋白含量，绘制标准曲线。
紫外光谱鉴定。在200〜400nm范围内进行紫外扫描。浓度为蛋白标准液BSA 1mg-mL1,OVA1mg-mL1待测两种抗原溶液1mg-mL1，得到紫外吸收光谱图，根据吸收峰位置判断抗原是否成功合成。
电泳鉴定。使用SDS-PAGE电泳对BSA、ZEN-BSA.OVA.ZEN-OVA进行鉴定，根据分子量差距大小来判断抗原是否成功合成。
免疫学方法鉴定。采用本实验室已建立的ELISA方法进行操作，将ZEN-BSA稀释为一定浓度包被96孔酶标板,4C过夜。第2天取出恢复至室温洗板3次，每孔加100a L5%脱脂乳粉封闭液,7C温育1h o洗板拍干，将ZEN毒素标准品梯度稀释，每孔100a L，每孔再加入100a L单抗,7C温育1h o洗板拍干，加酶标二抗，37C温育1h o洗板拍干，加显液，15min 后加终止液，用酶标仪测OD450nm值。
1.2.5检测样品中的ZEN含量样品中ZEN 含量以国家食品安全规定的粮食中毒素含量最大残留限量60a g・kg-为基准，设定小于10a g・kg-为阴性样品，大于10ptg-kg1为阳性样品，其中大于60pig*kg"1为超标样品。2020年采集黑龙江省部分地区高粱样品32个，小米样品64个，小麦粉样品24个，用已合成的玉米赤霉烯酮完全抗原根据1.2.4中的方法建立ELISA方法，把以上各种样品进行前处理后进行检测，不仅可以检验出所检样品中是否含有玉米赤霉烯酮，也可以进一步验证所偶联的完全抗原是否成功。
样品的前处理过程如下所示：
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6期张浩楠等：玉米赤霉烯酮完全抗原的制备及鉴定评价•检测•环保
①取一定量的样品（—般为2~5g），粉碎后加入8mL的甲醇（甲醇浓度可适当调节）；
②使用旋涡机将其充分混合（约5mn）；
③使用离心机在离心5min（4000r*min_1）；
④取少量上清液，加入一定量的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释（一般为10倍稀释，可根据具体样品不同而适当调整），制得样品稀释液备用。
根据1.2.4中的ELISA方法进行测定，将其中ZEN毒素标品更换为上述所制得的样品稀释液，然后将其所测得的OD值，根据标准方程计算玉米样品中的玉米赤霉烯酮含量。
1. 2.6数据分析本试验所有数据采用Origin 8.0软件将实验数据进行作图及计算。
2结果与分析
2.1偶联物蛋白含量测定
选择紫外分光光度计对两种抗原在280nm 波长下进行检测，分别用OVA和BSA作为标准蛋白，得到OD值分别为0.233和0.098，代入方程，将结果扩大50倍，得到的浓度即全抗原蛋白浓度。通过紫外吸收法测定包被原ZEN-BSA的蛋白浓度为1.62mg-mL_1，免疫原
图2蛋白质浓度测定ZEN-OVA标准曲线图
2.2紫外吸收光谱法验证人工抗原
将合成的偶联抗原首先进行紫外（200〜400nm）扫描，其结果如图3所示，BSA和OVA 在278nm出现了吸收峰，偶联后的ZEN-BSA和ZEN-OVA在319nm处出现了新的吸收峰，从波形上来看，最大吸收峰位置出现偏移，说明新的吸收峰是由于载体蛋白分子上连接上了其它吸收基团（ZEN），且该结果与曹欢[16]等人的结果基本符合，可以初步判断完全抗原偶联成功。并根据公式计算结合比[17-18]:
结合比=（结合物—£载体）（：摩尔消光系数）
£半抗原
配制一定浓度的ZEN溶液，在319nm下进行紫外扫描，根据朗伯比尔定律A=w bc计算得到ZEN的平均摩尔消光系数。通过紫外吸收法测定包被原ZEN-BSA的蛋白浓度为1.62mg・mL「i，免疫原ZEN-OVA为1.33mg*mL_1。而根据人工抗原在319nm的吸光度值计算人工抗原的摩尔消光系数，根据载体
蛋白在278nm 的吸光度计算载体蛋白的摩尔消光系数。遂计算出ZEN-BSA结合比为7.0：1,ZEN-OVA结合比为6.1：1。
200250300350400
波长/nm
图3完全抗原紫外全波长扫描图
shlr2.3SDS-PAGE鉴定抗原
由于玉米赤霉烯酮（ZEN）的分子量较小，约为318，故采用分子量较大的牛血清蛋白（BSA，分子量约67000）和鸡卵白蛋白（OVA，分子量约45000）进行偶联，由于ZEN与蛋白之间的分子量差距太大，故两种蛋白与偶联后的完全抗原相比并无明显的变化，其结果如图4所示,ZEN-BSA与BSA之间的分子量差距并不大且都集中在60〜70kDa,ZEN-OVA与OVA之间的分子量差距并不大且都集中在40〜50kDa与孙亚宁等[19]结果相符，故可初步判断完全抗原偶联成功。
化石工艺品
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评价•检测•环保
黑龙江农业科学
6期
Prestained
Control ZEN-OVA OVA Protein Ladder
Prestained
Control ZEN-BSA BSA Protein Ladder
130 kDa 100 kDa 70 kDa
55 kDa 40 kDa
35 kDa 25 kDa
图4 BSA 和ZEN-BSA 的SDS-PAGE 电泳图（左）及OVA 和ZEN-OVA 的SDS-PAGE 电泳图（右）
2. 4间接竞争ELISA 法验证人工抗原将ZEN-BSA 包被酶标板，实验室保存的
ZEN 单抗作为一抗，然后根据加入不同浓度的 ZEN 毒素产生竞争作用，显后通过酶标仪能够
读取不同的吸光值。使用Origin&0软件选择参 数Logistic 作为拟合曲线绘制不同浓度的ZEN 作为横坐标，以B/B 。为纵坐标的标准曲线，得到 如图5所示标准曲线，其标准方程为：夕= 0. 398 87 + 0. 679 81/［1 + （狓 0. 311 99）0 490 03 ］,
R 2 = 0. 996 8 ，通过该方程计算ZEN 的 C 为
32.23 ng-mL-1。故可以进一步确认毒素能与偶
联抗原产生竞争性，故完全抗原偶联成功。与其他
文献如陈晓飞［0］计算的IC 50为74. 69 ng-mL"1，唐 宁［1］得到的IC 50为57. 88 ng-mL"1相比，检测灵敏
2.5检测粮食样品中的ZEN
由表1结果显示,2020年黑龙江省小麦粉样 品的玉米赤霉烯酮含量偏高，高粱样品次之，小米
样品未见超标，考虑到黑龙江省大部分地区的气
候条件较为接近，故产生这种现象的原因可能是
在采收、贮藏过程中，小麦样品所处环境更潮湿, 更容易产生和累积玉米赤霉烯酮。
表1 样品中ZEN 检出率
样品
样品数阳性均值/（g g*kg 1）阳性率/%超标率/%
高粱
3246 0418. 75 6. 25
电动车测功机
小米64
手机绑定
25 71
9. 37
0小麦粉
2453 7425. 00
8. 33
3 讨论
本研究采用目前比较成熟的半抗原合成方
法，将ZEN 与羧甲基羟胺半盐酸盐进行反应，引
出游离的羰基，与载体蛋白进行偶联［22］，采用此 方法制备的抗体的灵敏度比较高［14］。Thongrus-
samee 等［23 ］在设计ZEN 半抗原时，以ZEN 分子
中的酮基、羟基等具有活性的基团为基础，采用肟
化法进行改造，王景琳等［4］用这种方法将ZEN 毒素C 6位置（酮基）交联羧基（COOH ），经质谱 分析，采用此法可有效地将ZEN 毒素转化为带羧 基的ZEN 肟。此外，也有用丁二醇缩水甘油醚方 法将ZEN 与载体蛋白偶联制备单克隆抗体，获得
的抗体对ZEN 和ZAN 识别较好，对其他结构类 似物识别能力较差。常用的完全抗原合成方法有 碳化二亚胺法（EDC ）、活性酯法（NHS 酯法［、羧
基化法［N,N 〔羰基二咪唑（CDI ）］，混合酸酐法。 胥传来等［5］利用碳二亚胺法成功制备了磺胺二
甲基密啶人工抗原。刘琦等［6］利用碳二亚胺 EDC 将ZEN 与钥孔血蓝蛋白（KLH ）偶联制备出
免疫原。杨振东等［7］则先以氯甲基异丁酯与含 有羧基的ZEN 反应形成混合酸酐，然后先后与 BSA 和OVA 上的氨基反应得到较高质量的
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6期张浩楠等：玉米赤霉烯酮完全抗原的制备及鉴定
ZEN人工抗原。本试验采用的DCC和sulfo-
mp3手表NHS结合使用也是一种有效的抗原合成
方法［8］。
目前，对于完全抗原的鉴定主要有较为简单
的紫外光谱法、电泳法，较为复杂的谱法、TN-
BS法等。本研究采用的紫外光谱法是将其在
200〜400nm波长下进行全波长扫描，然后根据
在不同波长下的吸光度和峰面积的区别来初步判
断偶联是否成功。唐宁［□通过紫外扫描图，确定
偶联物在273nm特征波长，计算得到ZEN-BSA
结合比为12：1,ZEN-OVA结合比为21：1o电泳
法较多的是采用SDS-PAGE法，它是根据不同分
子量蛋白质在凝胶中迁移速率不同，在电流的作
用下将不同的蛋白质在分离胶中分离开来，进而
鉴定蛋白质。但是这种方法对于蛋白质分子量相
差较大的两种蛋白的比较有更好的效果，而BSA
分子量为67000kDa，ZEN分子量为318kDa，这
两种物质偶联成功后其分子量并无明显的差别，
两个条带间的区别并不大，故使用该方法鉴定完
全抗原并不完全合适。当半抗原或全抗原在紫外
区无吸收或不明显时，可采用TNBS法［9］。曹欢
等［i6•利用TNBS法计算得到ZEN-BSA和ZEN-
OVA结合比分别为20：1和13：1o陈晓飞［0］利
用TNBS法测得偶联结合比nZONO:nBSA=
12.7：1、nZONO：nOVA=6.6：1。虽然结果更为
精确，但其操作难度更大，对实验仪器要求更高。
本试验主要根据紫外吸收光谱图来计算结合比,
得到ZEN-BSA的偶联比为7•0：1o同理可求得
ZEN-OVA的偶联比为6.1：1o此方法可在验证
人工抗原合成成功的同时计算结合比，且操作简
便。杨振东等［7］用此方法得到ZEN人工免疫抗
原的偶联比为12.04：1，人工检测原的偶联比为
8.28：1。
为了减少上述两种方法鉴定完全抗原带来的
不确定因素，本研究使用竞争ELISA方法对
ZEN-BSA进行鉴定，在不同浓度毒素的作用下,
能够产生竞争性，且能够得到标准曲线。从而从
另一个角度来佐证完全抗原偶联成功。赵红
艳［30］采用间接ELISA方法验证人工抗原ZEN-
OVA，当抗体从100倍稀释至800倍时，OD450nm
值逐渐减小，说明人工抗原与ZEN答抗发生特异
性结合，进而证明人工抗原合成成功。将制得的
ZEN-BSA按照ELISA法检测黑龙江省内高粱、
小米和小麦粉中的ZEN含量，结果显示，该完全
抗原能检测出天然样品中的ZEN，并且从阳性率
和超标率可以看出，针对不同浓度的ZEN产生的评价•检测•环保
竞争性不同，说明本试验制备的完全抗原对ZEN 灵敏度较高，能够应用到实际的检测中。
4结论
合成完全抗原是构建免疫分析方法的第一步。由于ZEN是小分子物质，仅有反应原性没有免疫原性。必须将ZEN与大分子蛋白偶联才能刺激机体产生特异性抗体。本试验通过对ZEN C6位的酮基与O-羧甲基羟氨反应，形成玉米赤霉烯酮肟化物，再通过活性酯法获得具有免疫原性的ZEN-BSA和ZEN-OVA o两种完全抗原的蛋白浓度分别为1.62和1.33mg-mL-1，结合比分别为7.0：1和6.1：1。经SDS-PAGE电泳和紫外扫描鉴定两种抗原合成成功。用间接竞争ELISA方法鉴定ZEN-BSA，得到标准曲线狔= 0.39887+0.67981/[1+(狓0.31199)049003], R2=0.9968。天然样品检测结果表明，用此完全抗原检出的高粱样品超标率为6.25%，小麦粉超标率为8.33%。在此基础上，本实验室将继续开展动物免疫、单抗合成等后续试验，为开发稳定性高、检测限低的国产试剂盒提供技术支撑。
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