汪海波;梁艳萍;李云雁;王敏;方成;汪海婴飞羽辅助
【摘 要】In this study, the effect of crosslinking method on biological properties of grass carp skin collagen sponge was discussed. Collagen was extracted from skin of grass carp ( Ctenopharyngodon idellus) and collagen sponge was prepared from this collagen. Then,this collagen sponge was crosslinked with different methods,such as UV, dehydrothermal, EDC/NHS and glutaraldehyde crosslinking processes. At the same time, the biological and mechanical properties of those collagen sponges, including degree of crosslinking, denaturation temperature,tensile strength and enzymatic sensitivity in vitro,were evaluated and compared. Experiment results indicated that the grass carp skin collagen was type I collagen. The degree of crosslinking of different crosslinking methods decreased in the order of glutaraldehyde (72. 0% ) > EDC/ NHS(32. 5% ) > dehydrothermal(29. 9% ) > UV( 15. 6% ). Compared with control collagen sponges,the denaturation temperature (67. 4 ℃), tensile strength ( 125. 6 kPa)and enzymatic sensitivit
y in vitro of collagen sponges crosslinked by glutaraldehyde were significantly improved ( P < 0. 05 ); EDC/NHS crosslinking could lead to obvious increasing in denaturation enthalpy (6. 86 J/g)and moderate improving on tensile strength (98.6 kPa) and enzymatic sensitivity for collagen sponge ( P < 0. 05). The changes of biological and mechanical properties of collagen sponges after being crosslinked by dehydrothermal and UV crosslinking processes were not notable. The results of FTIR showed that glutaraldehyde crosslinking could improve properties of collagen sponges by forming new covalent bond in triple helix structure of collagen, while EDC/NHS crosslinking do that by forming new hydrogen bonds among collagen molecules. This research shows that glutaraldehyde and EDC/NHS crosslinking could lead to obvious improvement in properties of collagen sponges but the influences on properties of collagen sponges after being crosslinked by dehydrothermal and UV crosslinking processes were limited.%为探讨不同交联方法对草鱼皮胶原蛋白海绵材料性能的影响,实验以草鱼鱼皮为原料,提取、纯化胶原蛋白并制备胶原海绵材料.在此基础上,分别用紫外交联、热交联、戊二醛交联以及EDC/NHS交联方法处理胶原海绵,通过测定材料的交联度、热变性温度、拉伸强度和体外抗酶降解性能,比较了不同 方法的交联效果.结果发现,提取所得的草鱼皮胶原蛋白为典型的Ⅰ型胶原；经不同方法交联处理后,海绵材料交联度依次为戊二醛(72.0％) ＞EDC/NHS(32.5％)＞热交联(29.9％)＞紫外交联(15.6％)；与对照胶原材料相比,戊二醛处理后,胶原材料的热变性峰值温度(67.4℃)、最大拉伸强度(125.6 kPa)和体外抗酶降解性能均有显著提升(P＜0.05)；EDC/NHS处理后,胶原材料的热变性焓显著提升(6.86 J/g),同时材料的拉伸强度(98.6 kPa)和体外抗酶降解性能也得到适度增加(P＜0.05).紫外交联和热交联对草鱼皮胶原材料性能的改善作用比较有限,并可能导致胶原分子的部分变性.红外光谱的分析结果表明,戊二醛处理可导致草鱼皮胶原三螺旋分子内产生新的共价键交联从而使材料性能改善,而EDC/NHS处理主要导致胶原分子间产生新的氢键交联并可提高胶原材料的稳定性.研究表明,戊二醛和EDC/NHS交联能有效提高胶原海绵材料的性能,而热交联和紫外交联对材料性能的改善作用非常有限.
【期刊名称】《水产学报》
【年(卷),期】2013(037)001
【总页数】9页(P132-140)
【关键词】草鱼;鱼皮;胶原蛋白;交联
【作 者】汪海波;梁艳萍;李云雁;王敏;方成;汪海婴
【作者单位】武汉工业学院化学与环境工程学院,湖北武汉430023;武汉工业学院化学与环境工程学院,湖北武汉430023;武汉工业学院化学与环境工程学院,湖北武汉430023;武汉工业学院化学与环境工程学院,湖北武汉430023;武汉工业学院化学与环境工程学院,湖北武汉430023;华中科技大学同济医学院,湖北武汉430030现浇箱梁施工
【正文语种】中 文
【中图分类】TS254.9
胶原蛋白(collagen)是机体结缔组织(皮肤、跟腱等)中最主要的结构蛋白之一，根据其结构和功能的不同又可细分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等27种类型［1］。由于胶原蛋白具有低免疫原性、良好的细胞相容性等诸多优良的生物学特性，近年来胶原蛋白在生物医学材料领域中得到了广泛的应用［2］。如胶原海绵敷料被应用于外科手术的止血、空腔填充以及创面组织的快速修复;胶原蛋白与壳聚糖或羟基磷灰石形成的复合材料应用于骨组织工程领域;以胶原蛋白
为主要细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的支架材料(scaffolds)被应用于体外成纤细胞培养等皮肤再造组织工程。目前，应用于生物材料领域的胶原蛋白主要来源于哺乳动物的结缔组织，如牛、羊或猪的皮肤和跟腱。但近年来随着疯牛病、口蹄疫等人畜共患疾病的频繁爆发导致该类来源胶原产品的安全性越来越受到使用者的质疑。与此同时，相对更为安全、制备成本更为低廉的鱼源胶原蛋白及其在生物材料领域的潜在应用价值正逐步受到学者的关注。国内外学者围绕鱼源胶原蛋白的提取、结构及相关理化性能已开展了诸多研究工作，为鱼胶原蛋白的开发利用提供了大量有价值的科学信息［3－8］。
与人工合成的生物材料(如聚乳酸、聚羟基乙酸等)相比，热变性温度过低、机体内降解速率过快以及材料机械性能不理想是天然胶原蛋白的主要不足之处。国内外学者围绕天然胶原蛋白的性能改进开展了大量前沿研究，其中分子交联技术是改善天然胶原蛋白性能的常用手段之一。胶原蛋白的分子交联可分为物理交联法和化学交联法，其中热交联和紫外交联是最常用的物理交联手段，而戊二醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)是常用的化学交联试剂［9］。针对这些交联方法在哺乳动物源胶原蛋白中的应用及性能改进已有相关研究［10－12］，而有关鱼源胶原蛋白的交联技术应用及其对胶原材料性能的影响却鲜有报道。为此，本研究以草鱼(Ctenopharyngodon ide
llus)鱼皮为原料，提取鱼皮胶原蛋白，并尝试利用不同的交联方法对该胶原材料进行交联处理，评价不同交联方法对鱼皮胶原性能的影响，为鱼源胶原在生物材料领域中的应用提供有价值的科学信息。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
铅笔加工原材料 新鲜草鱼(平均体质量每条约1 000 g，购于武汉市常青花园武商量贩超市)，人工分离鱼皮后去除鱼皮上附着鱼肉，随后对鱼皮进行充分洗涤并切成小片，冻藏(－20℃)备用。
样本制作
地热电缆试剂和仪器 NaOH、NaCl、Na2CO3、乙酸、戊二醛等化学试剂均为国产分析纯;胃蛋白酶(800～2 500 U/mg)购置于丰达生物科技有限公司;Ⅰ型胶原蛋白酶(酶活力为30 U/mg)购置于Sigma公司;Ⅰ型猪皮胶原蛋白，实验室自制。
数显鼓风恒温干燥箱，GZX-9070MBE，英峪予华仪器厂;PHS-3C pH计，杭州东星仪器设备厂;Cary-50紫外可见分光光度计，美国VARIAN公司;HHSH-2电热恒温水浴锅，北京长安
科学仪器厂;V-1100可见光分光光度计，上海美谱达仪器有限公司;LGJ-10D冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂;NEXUS傅里叶红外光谱分析仪，美国Thermo Nicolet公司;VARIAN高效液相谱仪，美国VARIAN公司;QX-W100微机控制电子万能材料试验机，上海企想公司;S-3000N扫描电镜，日本日立公司;DSC-Q10差示扫描量热仪，美国TA公司。
1.2 实验方法
草鱼皮胶原蛋白的提取、纯化［13］ 以下所有操作均在低于20℃的条件下进行。解冻后的鱼皮原料用0.1 mol/L的NaOH溶液浸泡24 h脱除杂蛋白，随后用去离子水充分洗涤至中性并用10%的正丁醇溶液浸泡脱脂24 h。脱脂鱼皮用去离子水反复洗涤、沥干后用含有1.0%(w/v)胃蛋白酶的0.5 mol/L 乙酸(1∶40，w/v)搅拌提取48 h，离心。向上清液中添加NaCl至盐浓度为0.9 mol/L，静置盐析24 h后过滤，胶原蛋白沉淀用0.5 mol/L的乙酸溶液复溶后依次用0.1 mol/L的乙酸和蒸馏水透析，最后冷冻干燥得到草鱼鱼皮胶原蛋白样品。
胶原蛋白的结构表征 分别采用高效液相谱法和SDS-PAGE垂直凝胶电泳分析胶原样品的氨基酸组成和肽链组成。胶原样品经盐酸水解后测定氨基酸组成，测定条件［14］:Sopium Amino Acid Analysis谱柱，线性梯度洗脱，A相为0.2 mol/L柠檬酸钠水
溶液pH 3.00，B相为0.2 mol/L硼酸钠水溶液pH 9.80，洗脱液流速为0.4 mL/min，柱温为65℃;SDS-PAGE垂直凝胶电泳分析条件［15］:样品缓冲液为 60 mmol/L Tris-HCl(pH 6.8，含 25% 甘油，2%SDS，14.4 mmoL/L β-巯基乙醇，0.1%溴酚蓝)，染液为0.1%考马斯亮蓝R-250甲醇水染液，脱液为酸甲醇水(含10%乙酸，10%甲醇)，12%分离胶，5%堆积胶，电泳缓冲液为 Tris-甘氨酸缓冲液(pH 8.3，0.1%SDS)。
胶原海绵及其交联样品的制备 冻干的鱼皮胶原蛋白样品用0.05 mol/L的乙酸充分溶解并配置成浓度为10 mg/mL的胶原蛋白溶液，负压脱气处理后，将胶原蛋白溶液注入内径14 mm，长20 cm的硅胶管中，于－45℃条件下冻干处理48 h，制得干燥成形的柱状胶原海绵材料，4℃条件下密闭保存备用。制备所得的柱状胶原海绵材料分别采用以下几种方法进行交联处理:(1)热交联［16］:将冻干成型的胶原海绵材料置入真空干燥箱，150℃真空热交联48 h。在保持真空的状态下缓慢降温至室温后将材料取出，得到热交联胶原蛋白海绵材料，4℃下密闭保存备用;(2)紫外交联［17］:将冻干胶原海绵材料放在铝箔上，用医用紫外灯(功率30 W)进行紫外照射交联，照射距离20 cm，波长254 nm，48 h后得到紫外交联胶原蛋白海绵材料，4℃条件下密闭保存备用;(3)戊二醛交联［10］:将冻干胶原海绵材料浸泡于含0.2%戊二醛的0.05 mol/L的乙酸溶液中，4℃条件下交联处理24 h，随后取出材料并依
次用PBS缓冲液和去离子水反复冲洗，冻干，得到戊二醛交联胶原蛋白海绵材料，4℃条件下密闭保存备用;(4)EDC/NHS 交联［12］:将 50 mmol/L 2-N-啉乙磺酸(MES)溶液(pH 5.5)与无水乙醇按体积比2∶3配置成缓冲液，取该缓冲液100 mL，将胶原海绵材料浸入，室温下浸泡30 min，然后依次向缓冲液中加入200 mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和50 mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，反应4 h后，将胶原海绵取出，用0.1 mol/L的Na2HPO4缓冲液漂洗两次，每次1 h，最后用蒸馏水冲洗4次，冲洗干净后将胶原海绵冻干备用。
胶原海绵性能分析 在胶原海绵材料制备的基础上，开展材料的相关性能分析。(1)交联度测定［18］:采用测定交联前后胶原蛋白分子中游离氨基基团数量变化的方法评价胶原海绵的交联度，测定方法为精确称取2～4 mg的胶原冻干材料，浸入1.0 mL 4%(w/v)的 NaHCO3溶液，随后加入1.0 mL 0.5%(w/v)的 2，4，6 － 三硝基苯磺酸(TNBS)溶液，40℃反应2 h后加入3.0 mL浓度为6 mol/L的HCl溶液，60℃保温反应90 min后向反应液中加入5.0 mL的去离子水，定容至10 mL，测定该反应液345 nm处吸光度值。交联度(%)=［1－(交联样品的吸光度值/交联样品的质量)/(未交联样品的吸光度值/未交联样品的质量)］×100;(2)热稳定性分析:采用差式扫描量热仪测定样品变性温度，仪器测定前用金属铟进行校正，用空铝盒
做对照，扫描温度范围20～80℃;升温速率2℃/min，样品室氮气流量为20 mL/min;(3)体外酶降解性能分析［19］:准确称取胶原蛋白材料样品40 mg置于20 mL的胶原蛋白酶溶液中(胶原蛋白酶浓度0.5 mg/mL，缓冲体系为含0.8 mmol/L NaN3和5 mmol/L CaCl2的0.01 mol/L Tris-HCl，pH 7.4)，随后将该样品液转移至透析袋中(截留分子量＞14 000 u)，37℃条件下透析，透析外液为总体积100 mL的0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)。实时测定透析外液中羟脯氨酸总含量并绘制胶原蛋白样品的体外酶降解曲线。采用分光光度法定量测定羟脯氨酸含量［20］，测定标准曲线为 Y=0.110 6x+0.019 3(R2=0.999 8，x代表羟脯氨酸的质量浓度，Y代表吸光值)。胶原蛋白降解率(%)=(透析外液中羟脯氨酸总量/胶原蛋白材料中初始羟脯氨酸总量)×100;(4)材料机械性能分析:将冻干成型的胶原蛋白柱状材料剪成大约7 cm长的样品，用游标卡尺测量材料外径后将材料两端固定在电子万能材料试验机的拉伸测定夹具上，材料的有效拉伸长度为40 mm，以50 mm/min的速率匀速拉伸至材料断裂，每组材料重复测定5次，计算材料的抗张强度(T/S，kPa)。抗张强度 =Tmax/S，其中，Tmax为材料最大拉伸力(N)，S为材料横截面积(mm2)。
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