第24卷第2期V o1.24,No.2
2004年4月Apr.2004
生殖与避孕
Reproduction奄Contraception
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人早孕期绒毛和绒毛外细胞滋养细胞的
分离，培养及鉴定
吴霞李大金袁敏敏王明雁
(复旦大学附属妇产科研究所，上海,2O0011)
目的：建立人早孕期绒毛细胞滋养细胞(vi1louscytotrophoblastS,VCT)及绒毛外细胞
滋养细胞(extravi1louscytotrophoblastS,EVCT)的分离，培养方法.方法：利用不同的胰
酶消化条件，收集人早孕期绒-t3J~织的VCT及EVCT并分别培养.倒置显微镜，扫描电镜观察VCT 及EVCT的形态学特征；免疫细胞化学鉴定细胞来源及纯度.结果：胰酶短期，温和消化获得的
EVCT，可生长于Matrigel包被的培养器皿上，并表达特异性标志物c-crbB-2；延长消化时间，增
加胰酶浓度获得的VCT，种植于塑料或玻璃培养器皿上可聚集并融合形成合体滋养细胞.VCT不表
达c—crbB-2.结论：采用不同的胰酶消化及体外培养条件，可简单，快捷地分别获得高纯度人早
孕期VCT及EVCT.
关键词：绒毛细胞滋养细胞；绒毛外细胞滋养细胞；细胞培养
中图分类号:R71文献标识码:A文章编号:0253=357X(2004)02-0070-04
滋养细胞来自滋养外胚层(trophecto—derm),
是母一胎界面唯一与母体免疫系统直接接触的胎儿细
胞，在胚胎植入，母一胎免疫耐受过程中发挥重要作
甩.许多产科疾病，如反复自然流产，妊娠高血压综
合征及胎儿生长受限(原名胎儿宫内生长迟缓)等，均
伴有滋养细胞某些生物学功能的异常.晚期囊胚着床
后，滋养细胞分裂，增殖，并可沿绒毛和绒毛外两个
方向分化，最终形成生物学特性明显不同的绒毛细胞宁波溲疏
滋养细胞(villouscytotrophoblasts,VCT)及绒毛
过氧化氢浓度测定
外细胞滋养细胞(extravi11ouscytotrophoblasts,
EVCT)(图1).VCT位于绒毛的内层，其有丝分裂活
跃，形成新滋养细胞；新滋养细胞膜消失则融合形成绒毛外层的合体滋养细胞(syncytiotrophob1ast, ST).EVCT具有侵袭能力，向子宫间质和螺旋动
本文为复旦大学”985工程”项目资助
通讯作者：李大金:Tel:+86-21—63787331
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发布任务70-
脉腔内侵袭性生长，并形成固定绒毛(.anchoring
vi11US).采用恰当的分离，培养方法，获得足
够数量的纯化VCT及EVCT，是深入研究滋养细胞各种功能的重要环节.然而，目前建立的滋养细胞
细胞滋养细胞Cytotrophoblast(CT)
绒毛外cT:ExtravillouscT绒毛cT:VillousCT
增殖P~oliferation融合Fusion
丫●
迁移Migration合体滋养细胞S’copho
,
ynytiblast
侵袭In
+vasi功能：分泌，交换qn侵袭’功能：内分泌，交换Functions:~ndocfine,exchange
巨细胞血管内细胞
GiantcellEndovascular(ell
图l原始细胞滋养细胞分化途径
耐老化测试Figure1Thetwodifferentiationpathwayof humanprimarycytotrophob1astsstem
cel1S
培养方法尚不够完善，特别是未能在同一次实验中
分别分离，培养VCT及EVCT.鉴于此，本研究利
用不同的胰酶消化条件获得VCT及EVCT并分别培养，以期建立一种简捷，稳定的早孕期VCT及EVCT 分离，培养方法.
1材料和方法
1.1材料来源
1.1.1绒毛组织正常妊娠5l0周绒毛组织从复
旦大学附属妇产科医院门诊手术室人工流产术获取, 置于Dulbecco’SmodifiedEagle’Smedium
(DMEM-HighGlucose)培养液中快送实验室.
1.1.2试剂DMEM-HighGlucose(Gibco),De—finedFBS(HyClone)，胰蛋白酶(TryPSin,
Difco),MatrigelBasementMembraneMatrix
(肋),Percoll(AmershamPharmacia)，一抗：鼠
抗人细胞角蛋白(cytokeratin)及鼠抗人波形蛋白(vimentin)单克隆抗体(华美生物工程公司)，兔
抗人c—erbB一2多克隆抗体(武汉博士德公司)，二抗：碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠
IgG及羊抗兔IgG(华美生物工程公司).
1.1.3主要设备二氧化碳孵箱(Formacientific),
O1ympus倒置显微镜，扫描电镜(日立-60).
1.2实验方法
1.2.1分离EVCT将收集的早孕绒毛组织置于DMEM 中充分洗涤3次，仔细去除蜕膜及绒毛基质，将剩
余组织剪碎至1T啪3左右，加入0,125%胰蛋白酶液于37℃水浴中消化约30min(不予摇晃).期问隔
5min吸少量消化液镜下监测，适时终止消化.收
集上清液并加10%小牛血清终止消化,100岬孔径
金属筛网过滤,300×g离心10min.调整细胞密
度为68×105/mL，种植于Matrigel包被(Matrigel: DMEM:I:2)的塑料培养板或盖玻片上.
gps信号放大器
1,2,2分离VCT在上述消化后的残余组织中再加
入0.25%胰蛋白酶液，于37~C水浴中消化10rain(轻柔摇晃消化液).将上清液吸至试管中并加10%小牛
血清，残余组织再加入0.25%胰蛋白酶继续消化.如
此反复共消化3次，弃残余组织.消化液分别经80 目,300目筛网过滤,300×g离心10min.将细
胞团重悬于3mLD—Hanks液并小心铺于不连续Perco11梯度液上(25%65%，每5%一个梯度),
1000×g离心20min.吸取1.0481.062g/mE密度
范围的细胞,D—Hanks液洗涤2次，调整细胞密度6—8×l05/mL，种植于塑料培养板或盖玻片上.
1.2.3培养条件培养液为高糖型DMEM，加入20%
胎牛血清,pH值7.0—7.2，于37℃,5%COz条件下
培养24h，除去未贴壁细胞并换入新鲜培养液.以
后每日更换培养液.
1.2.4免疫细胞化学鉴定细胞来源及纯度细胞培
养24或48h后，以4%多聚甲醛室温固定20min, PBS洗涤.0.3%TritonX一100通透细胞30min
(增加细胞膜通透性)，含10%小牛血清的PBS封闭
30min.分别加鼠抗人细胞角蛋白，鼠抗人波形蛋
白单克隆抗体及兔抗人c-erbB-2多克隆抗体,4℃
孵育过夜.对于VCT，次日加标记碱性磷酸酶的羊抗
鼠IgG或羊抗兔IgG；对于EVCT，加标记辣根过氧
化物酶的二抗.37℃孵育lh.以NBT/BCIP或DAB
显(EVCT再以苏木素复染)，并用甘油明胶或
中性树胶封片.
1.2,5扫描电镜观察培养24h的细胞用
2.5%戊
二醛和1%锇酸固定，酒精梯度脱水，临界点干燥,
真空镀膜后观察拍照.
2结果
刮膜棒2.1体外培养滋养细胞的特征
0.125%胰蛋白酶消化30rain获得的EVcT(本
研究中每克绒毛组织可获得约2—4×l05EVCT),
种植于Matrigel包被的塑料培养板上，可贴壁生
长并存活至少一周.EVCT可迁移，聚集，但彼此
并不融合.当依据BD公司推荐，将Matrigel未经
稀释直接铺于培养板上形成具一定厚度的薄层胶(thingel1ayer),EVCT还可侵袭入Matrige1
内生长.该滋养层细胞种植于于未经包被的塑
料培养板上，不易贴壁生长且绝大部分在24h内
死亡.
0.25%胰蛋白酶多步消化获得的VCT(本研究
中每克绒毛组织可获2—3×106VCT)，可贴壁生长于普通塑料或玻璃培养器皿上.VCT在种植8—12h 后迁移，聚集,24h即可见部分VCT已融合成具
多个核的合体滋养细胞(ST).24—48h期间融合
达到峰值,96h后仅剩少数单个核的滋养层细胞.
大多数sT具有丰富的胞浆，含5—10个核，但亦
观察到有的ST其胞核可多达20—30个.ST于体外培养时无增殖，分裂(图2，见图版一).
一
7l一
2.2免疫细胞化学鉴定EVCT及VCT
免疫细胞化学显示：分离到的EVCT和VCT均
表达细胞角蛋白，而不表达波形蛋白.仅极少数长
梭形细胞呈波形蛋白染阳性，考虑为混杂的成纤维细胞.分别记数细胞角蛋白和波形蛋白染阳性细胞，结果显示用此法分离到的滋养细胞纯度达90—95%，与文献报道一致引.此外,EVCT的
胞膜及胞浆呈C—erbB-2阳性染，而VCT为C—erbB一2阴性染(图2,3，见图版一).
2.3扫描电镜观察
扫描电镜显示：种植于Matrigel上的EVCT直
径约10-15m，细胞表面具微绒毛，呈放射状向
周围突出.相邻的滋养层细胞间有明显间隙.0.25% 胰蛋白酶多步消化后，种植于塑料或玻璃培养器皿上的VCT，部分细胞直径约10—15lxm，细胞表面
亦具微绒毛；绝大多数细胞呈聚集状，但细胞间尚
有间隙：部分滋养层细胞已融合成巨大的ST，扁平地贴附于培养器皿表面，直径可达100150Lun，细
胞表面具大量典型的微绒毛(图4，见图版二).
3讨论
在妊娠不同阶段的胎盘组织中存在多种不同类
型的滋养细胞，其生物学特性具有显着差异.未分化的原始细胞滋养细胞(primarycytotrophob1ast)，可
沿两条途径分化为EVCT及VCT.EVCT可增殖，并迁移，侵袭入子宫蜕膜，肌层及螺旋动脉;VCT可
融合成ST，具备内分泌功能，并参与母一胎间物
质交换3I4].EVCT,VCT,ST生物学行为不同,
其功能失调将引发不同种类的妊娠相关疾患，如EVCT侵袭能力下降与先兆子痫的发生密切相关[s{ 而在胎儿生长受限的病例中,ST微绒毛膜(microvi1lousmembrane)的№(+)/K(+)A TPase活性
明显降低，导致№(+)一偶联的转运功能削弱，胎儿生长受限[6].因此分别获得EVCT及VCT(体外培养可融合成ST)是进行相关疾病实验研究的基础.
虽然K1iman等建立的滋养细胞分离，培养方
法已较成熟，但依该方法分离得到并培养成活的主
要是VCT，而VCT在体外自发融合成ST，失去增
殖能力.为获得在体外具有增殖能力的滋养细胞,
以往一般都采用组织贴块培养法，但该法有其明显
的缺陷：不能在短时间内获得大量可供实验研究
用的细胞；原代细胞培养时间长，容易污染；容
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72-
易混杂一定数量的成纤维细胞.本实验中，我们
应用不同的胰蛋白酶消化条件，可以在同一次实验
中用较短的时间获取相当数量的EVCT及VCT，并分别培养.对于病理妊娠病例，依本研究方法从相
同样本获得VCT及EVCT，并分别进行研究，有可
能发现究竟是哪种类型的滋养细胞存在功能异常. 在胰酶消化过程中,EVCT直接与消化液接
触，因此只需温和的酶消化条件即可使其成团地从
绒毛组织上释放出来.镜下观察此期的消化液，可
见簇状聚集的EVCT，少量合体片段及红细胞.需注
意此消化过程勿摇晃消化液，以尽可能减少混杂的
合体片段.此外间隔数分钟取少量消化液镜下监测, 适时停止消化.VCT位于绒毛滋养层的内层，因此需经较高浓度胰蛋白酶多次消化才能被解离.当剩余
组织仅为纤维状的绒毛间质时，即停止消化以防止
混杂成纤维细胞.
EVCT培养于普通塑料板上不易贴壁，而且绝大
部分在24h内死亡.当EVCT种植在包被有Matrigel 的培养板上则可成活[7].MatrigelTMBasementMem-
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