第33卷 第6期西北农林科技大学学报(自然科学版)V o l.33N o.6 2005年6月Jour.of N o rthw est Sci2T ech U niv.of A gri.and Fo r.(N at.Sci.Ed.)June2005新生大鼠心肌细胞的分离和培养Ξ折叠水杯
刘 霞1,2，王常勇3
(1西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100;
2延安大学生命科学学院，陕西延安716000;
3军事医学科学院组织工程研究中心，北京100850) [摘 要] 为获得高纯度和高存活率的心肌细胞，探索心肌细胞大量培养的条件，并为进一步研究心肌细胞的细胞生物学特性奠定基础，同时为生理学和药理学研究提供细胞来源，试验采用胰蛋白酶顺序消化法及差速贴壁法，从1～2d龄新生大鼠的心肌组织中分离心肌细胞，观测心肌细胞的形态、结构、搏动状态和反映心肌细胞代谢状况的生化参数。结果表明，分离所得的心肌细胞纯度高，培养第3天就开始自发搏动，后连接成片，进而同步收缩；心肌细胞的亚显微结构包括肌丝、Z线、线粒体和大量糖原颗粒，葡萄糖比消耗率为7.44nmo l (个・d)，乳酸比产率为3.83nmo l (个・d)，乳酸转化率为51%，细胞代谢非常旺盛，说明试验培养条件有利于心肌细胞的气体交换和营养物质的摄取，从而有利于心肌细胞的生长。
[关键词] 心肌细胞；细胞分离；细胞培养；大鼠
[中图分类号] Q813.1+1;R318.11 [文献标识码] A[文章编号] 167129387(2005)0620035205
哺乳动物心脏由多种类型的细胞组成，近75%的细胞是非心肌细胞，如成纤维细胞和血红细胞等，心肌细胞占其余心脏细胞的25%，因此心肌细胞体外培养时极易被成纤维细胞污染，并可能影响到心肌细胞的分化[1]。此外，新生大鼠心肌细胞体外培养时只能利用原代培养物，而心肌细胞的分离易受处理条件及培养技术水平的影响[2]，且心肌细胞培养物的伸缩性和细胞间的接触有关，所以形成一个融合成片的单层心肌培养物极其困难。
基于此，本试验对新生大鼠的心肌细胞进行了分离和培养，以期探索心肌细胞的培养条件，并为心肌细胞细胞生物学特性的进一步研究奠定基础，同时为生理学和药理学研究提供细胞来源。
1 材料与方法
乳鸽养殖
1.1 材 料
1.1.1 试验动物 1～2d龄新生大鼠由军事医学科学院实验动物中心提供。
1.1.2 生化试剂 H2DM E M培养基和胰蛋白酶来自美国的Gibco公司；胎牛血清(FB S)产自天津川
页生化制品有限公司;H EPES,Hoech st33258和小牛胸腺DNA,L2谷氨酰胺(L2Glu)为美国Sigm a 产品；鼠抗人Α2横纹肌肌动蛋白单克隆抗体、牛血清白蛋白及免疫组化试剂盒，由北京中山生物技术有限公司提供；葡萄糖浓度和乳酸浓度测定试剂盒由北京中生生物工程高技术公司提供。
1.1.3 培养液 H2DM E M中补加200mL L FB S,100U mL青霉素,100U mL链霉素,10 mm o l L H EPES和2mm o l L L2谷氨酰胺。
1.2 方 法
1.2.1 新生大鼠心肌细胞的分离、纯化及原代培养 采用1g L胰蛋白酶顺序消化及差速贴壁法[3]，在无菌条件下分离纯化心肌细胞。取1～2d龄新生大鼠，在无菌条件下切取其心室肌组织，无钙H ank sπ液充分洗净残血，用眼科剪将其剪成大小约为1mm3的组织块，加入1g L胰蛋白酶于37℃孵箱中孵育或反复吹打消化3～4m in，吸取上清消化液，弃去；然后在剩余组织块中加入1g L胰蛋白酶，于37℃孵箱中孵育或反复吹打消化3～4m in，吸取上清消化液，用含FB S的H2DM E M培养液终止消化，沉淀组织块再加入消化液继续消化。如此重复3～5次，直至组织块完全消化。
将各次所得消化液在1000r m in下离心4
Ξ[收稿日期] 2004209209
透镜体[基金项目] 国家863高技术研究与发展计划航天领域项目(2002AA744064)。
[作者简介] 刘 霞(1970-)，女，陕西绥德人，讲师，在读博士，主要从事基础兽医学研究。E2m ail:
m in，弃上清，用含200mL L FB S的H2DM E M重悬细胞，移入培养板并置于37℃，饱和湿度和体积分数5%CO2的孵箱内,75m in后吸出尚未贴壁的细胞悬液，移入培养板或培养板内的盖玻片(细胞爬片)上静置培养,1d后换液去除未贴壁细胞，此后隔日换液，并在倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长情况，每天对细胞的自发收缩进行计数并照相(每孔任选6个视野，每个视野约0.3mm×0.4 mm)。
1.2.2 H E染 于细胞的对数生长期，即在培养5～7d后取出盖玻片,PB S冲洗后用体积分数95%乙醇固定15m in，常规H E染，封片后光镜下观察并照相。
1.2.3 抗Α2横纹肌肌动蛋白单克隆抗体免疫组织化学染 采用SP法。细胞爬片用PB S缓冲液(pH7.4～7.6)清洗后，在体积分数95%乙醇中固定15m in，用含0.1%(体积分数)triton x2100的0.3%(体积分数)H2O22甲醇室温作用10m in，以消除内源性过氧化物酶，经PB S冲洗浸泡后，再用体积分数10%的山羊血清室温下孵育15m in，加入鼠抗人Α2横纹肌肌动蛋白单克隆抗体(1∶50)，湿盒中4℃过夜，然后加入生物素标记二抗,37℃孵育15m in,PB S充分洗涤后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素,37℃孵育15m in，再滴加DAB显，显微镜下观察结果并拍照。
同时，以大鼠心肌组织石蜡切片为阳性对照，用PB S代替一抗作为空白对照。
1.2.4 心肌细胞的台盼蓝排斥试验 培养7d后，用胰蛋白酶消化并计数，制备单个心肌细胞悬液，并作适当稀释(106 mL)，取9滴细胞悬液移入小试管中，加1滴4g L台盼蓝溶液，混匀，在3m in内，用血球计数板分别计数活细胞和死细胞。
1.2.5 心肌细胞代谢率测定 培养3,5,7d后，分别取少许培养液以测定其中葡萄糖含量及乳酸含量。
(1)葡萄糖浓度和葡萄糖比消耗率。培养液中葡萄糖浓度测定采用GOD2PA P法。样品中葡萄糖浓度C按下式计算
C=(A样品 A标准)×C标准(m g L)
式中,A标准及A样品分别表示葡萄糖标准液及样品在波长505nm处的吸光度;C标准表示葡萄糖标准液的浓度。用未培养前培养液中的葡萄糖含量减去培养后培养上清液中的葡萄糖含量，即为细胞的消耗量C glu。心肌细胞的葡萄糖比消耗率Q glu=C glu (180×细胞密度)。
(2)乳酸浓度和乳酸比产率。培养液中乳酸浓度测定采用LA CTA T E2PA P法。样品中乳酸浓度C lac 为
C lac=(A样品 A标准)×30(m g L)
式中,A标准及A样品分别表示乳酸标准液及样品在波长546nm处的吸光度。心肌细胞的乳酸比产率Q lac =C lac (90×细胞密度)。
(3)乳酸转化率。乳酸转化率Y lac为
Y lac C glu=C lac C glu
式中,C lac为乳酸的产生量;C glu为葡萄糖的消耗量。
1.2.6 透射电镜观察 将样品在体积分数3%的戊二醛中前固定2h，体积分数1%的锇酸中后固定，于乙醇中梯度脱水，然后浸透,Epon812包埋，切片，用醋酸铀染液避光染10m in，柠檬酸铅染10m in，在80kV下观察并照相。
2 结果与分析
2.1 心肌细胞的分离
以1～2d龄新生大鼠的心室肌组织为心肌细胞的来源，采用胰酶顺序消化和差速贴壁法分离心肌细胞。经胰酶消化后,1只乳鼠的心室肌组织可获得的细胞总数约为1.7×106，经差速贴壁去除大部分成纤维细胞后，可获得的细胞数约为1.2×106。600x22助燃剂
2.2 心肌细胞的贴壁生长情况
刚分离出来的心肌细胞呈球形，接种后4h有细胞开始贴壁,12h后细胞形态变为梭形或不规则扁平状,24h后即可看到单个细胞的自发收缩，继而细胞逐渐铺展伸出伪足，形成不规则的星形。到第3～4天，细胞相互接触交织成网，形成细胞单层或细胞簇，搏动呈现同步化,5d后细胞簇面积逐渐增大(图1)，搏动频率13～47次 m in不等，收缩率随培养时间的延长而增加。第6～8天时，收缩率达到最高，可至65次 m in，随后下降，此收缩可持续20余天，最长可达40余天，镜下观察可见自主搏动细胞在80%以上，用台盼蓝排斥法检测的细胞成活率约为90%。
细胞H E染(图2)显示心肌细胞形态正常。
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西北农林科技大学学报(自然科学版)第33卷
图1 单层培养的心肌细胞(×
200)
A .心肌细胞间相互连接;
B .成簇的心肌细胞;
C .连接成片的心肌细胞
F ig .1 L ayered cardi om yocytes (×200)
A .Connecting betw een cardi om yocytes ;
B .
C lustered cardi om yocytes ;C .Connecting flaky cardi om yocytes
图2 H E 染结果
A.成年大鼠心肌组织(×100);
B.心肌细胞爬片(×200
)
F ig .2 H &E staining
A .Cardiac m uscle tissue of adult rat (×100);
B .Cultured cardiac m uscle cells of neonatal rat (×200)
2.3 心肌细胞的免疫组化染
以鼠抗Α2横纹肌肌动蛋白单克隆抗体为一抗，标记心肌细胞进行免疫组化鉴定。结果可见细胞浆
呈棕，表明细胞对Α2横纹肌肌动蛋白的表达呈阳
性，心肌细胞的比例在85%左右(图3)。
图3 Α2横纹肌肌动蛋白染(×100)
A .成年大鼠心肌组织;
B .心肌细胞爬片;
C .免疫组化空白对照
F ig .3 Exp ressi on of sarcom eric Α
2actin (×100)A .A dult rat cardiac tissue ;B .Cultured cardiac m uscle cells ;C .B lank contro l
2.4 心肌细胞代谢率的测定
静止培养时，心肌细胞Q glu 的均值为7.44
nm o l
(个・d )，培养期内呈现出中间高、两头低的变化趋势,Q glu 的变化基本与心肌细胞的搏动状况一
致,Q lac 的均值为3.83nm o l (个・d ),Y lac glu 的均值
为51%。
2.5 透射电镜观察
透射电镜观察结果显示，心肌细胞中的亚显微
结构清晰，包括肌丝(M fl )、Z 线(Z )、大量糖原颗粒(Gly )及线粒体(M ito )(图4)。
7
3第6期刘 霞等：新生大鼠心肌细胞的分离和培养
终端准入系统图4 透射电镜显示的心肌细胞超微结构(×22000)
F ig.4 T rans m issi on electron m icrograph of an cardiac m yocyte(×22000)
3 讨 论
心脏疾病是目前对人类危害最大、死亡人数最多的疾病之一，一直是医学界研究的热点和难点。心肌细胞是心脏的基本组成单位，是进行生理学和药理学研究的主要细胞来源，同时也是心肌组织工程种子细胞的主要来源之一。分离、培养并获得高纯度心肌细胞，既是心肌细胞体外成功培养的重要内容之一，也是在体外复制出工程化心肌组织的前提之一。
本研究应用胰蛋白酶顺序消化及差速贴壁相结合的方法分离纯化心肌细胞，取得了较好的效果。胰蛋
白酶的质量浓度及作用时间直接影响心肌细胞的活性。仅用质量浓度为1g L的胰酶反复多次顺序消化(每次5m in)乳鼠心肌组织，目的是减少胰酶对心肌细胞的损伤，从而获得存活率较高的心肌细胞。有研究[4]表明，初分离获得的心肌细胞在生理浓度的钙离子溶液中易丧失收缩活性，为了保持心肌细胞的收缩功能，在分离的过程中应采用4℃的无钙离子H ank sπ缓冲液浸泡和冲洗心肌组织。心肌细胞钙离子耐受性的建立，也是心肌细胞能否在体外培养中保持其收缩功能的影响因素之一。若分离的心肌细胞不能及时复钙，随着时间的延长，细胞的兴奋性及收缩性将会下降。在消化的上清液中加入含20%FB S的DM E M培养液，既可终止胰酶的消化作用，又能使心肌细胞及时复钙，从而获得存活率较高的钙耐受心肌细胞。
心脏由心肌细胞和非心肌细胞组成，其中成纤维细胞约占非心肌细胞的70%左右[5]。因此，为了避免体外培养时由于非心肌细胞的快速生长及其分泌的某些活性物质对心肌细胞形态结构和生理功能造成的不利影响[6～8]，本试验根据成纤维细胞贴壁速度明显快于心肌细胞的特点，采用差速贴壁法去除细胞悬液中的成纤维细胞，从而获得了较高纯度的心肌细胞。在倒置相差显微镜下观察，可见自主搏动的心肌细胞达到细胞总数的80%以上，与文献[9]报道的结果基本一致。
心肌细胞的鉴定可采用免疫组织化学方法，即可通过肌动蛋白抗体或肌球蛋白抗体与心肌细胞反应，将心肌细胞中的心肌细胞和其他细胞区分开。本研究所用抗体为抗Α2横纹肌肌动蛋白单克隆抗体，免疫组化显示,Α2肌动蛋白染呈强阳性。
新生大鼠心肌细胞在体外适宜条件下可以维持其代谢活性。形态学观察结果表明，心肌细胞可以连接成片，自主搏动长达40余天，说明其代谢非常旺盛；电镜观察结果表明，心肌细胞具有肌丝、Z线及大量糖原颗粒和线粒体，说明其具有心肌细胞的正常结构；细胞代谢率测定结果表明，培养液中乳酸和葡萄糖的物质的量之比小于1，表明属需氧代谢[10]，且细胞代谢旺盛，说明本试验的培养条件有利于心肌细胞的气体交换和营养物质的摄取。
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Iso lating and cu ltu ring of neonatal rat cardiac m yocytes
麦克力电气L IU X i a1,2,W ANG Chang-yong3
(1College of A ni m al S cience and T echonology,N orthw est A&F U niversity,Y ang ling,S haanx i712100,Ch ina;
2College of L if e S ciences,Y anπan U niversity,Y anπan,S haanx i716000,Ch ina;
3T issue E ng ineering R esearch Center,A cade my of M ilitary M ed ical S ciences,B eij ing100850,Ch ina)
Abstract:T h is study investigated conditi on s of iso lating and cu ltu ring of cardiac m yocytes so as to ob2 tain lo ts of p u red cardiac m u scle cells and supp ly a cardiac m yocytes m odel fo r physi o logical and phar m aco2 logical studies in v itro.1-22day2o ld neonatal rat cardiac m u scle cells w ere iso lated w ith enzym e by sequen2 tial digesti on and p re2p lating m ethods,and the acqu ired cells w ere cu ltu red in H2DM E M con tain ing20% fetal bovine serum.T he cell typ e w as iden tified by H2E and an ti2sarcom ericΑ2actin stain s.Cardiac m yocytes beating and m etabo lic indexes,including sp ecific con sum p ti on rate of gluco se,specific p roducti on rate of lactate,lactate tran sfo r m rate w ere p ri m arily confir m ed.T he iso lated cardiac m yocytes adhered to the bo t2 tom of the flask s24hou rs after p lating and began to con tract spon taneou sly and by day3-4fo r m
ed syn2 ch ronou sly con tracting netw o rk s.T he m o lar rati o s of gluco se con sum ed and lactate p roduced w ere7.44 nm o l (cell・day)and3.83nm o l (cell・day)respectively.T he m o lar rati o of gluco se con sum ed to lactate p roduced w as0.51mm o l mm o l.T hese dem on strated that m etabo lic activity of cells w as very h igh and the conditi on s of cu ltu ring w ere good fo r cardiac m yocytes cu ltu red.
Key words:cardiac m yocyte;cell iso lati on;cu ltu re;rat
93
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