李大鹏;吴燕;黄永辉;蒋璐;孙继芾;岳佳伟
【摘 要】目的 建立一种体外分离、培养人髓核细胞(NPCs)的新方法,并探讨其意义.方法 采用0.2% Ⅱ型胶原酶消化法分离人正常NPCs,单层贴壁法进行传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态.取第1、2、3代NPCs,采用CCK-8法检测细胞增殖能力(以吸光度值表示),连续检测12天.取第2代NPCs,采用免疫组化法检测Ⅱ型胶原(Col-2)、细胞角蛋白18(KRT-18)、KRT-19、低氧诱导因子1α(HIF-1α)、葡萄糖转运子1(GLUT-1)、Sox-9、聚集蛋白聚糖(ACAN)、CD24阳性表达率.结果 分离的NPCs呈多角形或短梭形,类似于软骨细胞;第4代以后,NPCs细胞突起延长,呈长梭形,生长缓慢,出现老化现象.NPCs生长曲线呈S形:1~2天细胞生长缓慢;3~7天细胞生长迅速,进入对数生长期;8天后进入平台期,细胞增殖缓慢.连续培养12天,第1、2、3代NPCs相同时间点吸光度值比较差异均无统计学意义(P均>0.05).第2代NPCs中Col-2、KRT-18、KRT-19、HIF-1α、GLUT-1、Sox-9、ACAN、CD24阳性表达率均≥85.6%(85.6%~91.2%).结论 单纯0.2% Ⅱ型胶原酶消化法及单层贴壁法可分离、培养人NPCs,并经免疫组化染鉴定证实;传代3代以内的NPCs细胞形态及增殖能力均无明显改变,可作为椎间盘退变相关研究的种子细胞. %Objective To establish a new method for isolation and culture of human nucleus pulposus cells (NPCs) in vitro and to explore its significance.Methods Human normal NPCs were isolated by type Ⅱ collagenase digestion, then were cultured and expanded in monolayer.Cell morphology was observed by inverted microscope;the proliferation ability (expressed as absorbance value) of passage 1, passage 2 and passage 3 NPCs were detected by CCK-8 assay for consecutive 12 days;the positive expression rates of type Ⅱ collagen (Col-2), cytokeratin 18 (KRT-18), KRT-19, hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α), glucose transporter 1 (GLUT-1), Sox-9, aggrecan (ACAN), and CD24 in passage 2 NPCs were detected by immunohistochemistry.Results The isolate human NPCs were polygonal or short spindle, similar to chondrocytes.However, the nucleus pulposus cells after passage 4 grew slowly, the protrusion of cells extended, and the cells were long spindle shape, all of these indicated the cells were aging.The growth curve of NPCs was S-shaped, cells grew slowly in 1-2 days, then grew into the logarithmic growth phase in 3-7 days, and after 8 days the cells proliferated slowly and entered the plateau.After consecutive 12-day culture, the difference of absorbance values at 450 nm among passa
ge 1, passage 2 and passage 3 NPCs was not statistically significant at the same time point (all P>0.05).Immunohistochemical staining showed: the positive rates of Col-2, KRT-18, KRT-19, GLUT-1, HIF-1α, Sox-9, ACAN, and CD24 in passage 2 NPCs were no less than 85.6% (85.6%-91.2%).Conclusions Human NPCs can be effectively isolated by 0.2% type Ⅱ collagenase digestion method, and can be cultured by monolayer adherence method.The cells we cultured were identified as nucleus pulposus cells by immunohistochemistry.There are no significant changes in the morphological and proliferation abilities of NPCs within 3 generations, and could be used as seed cells for study of intervertebral disc degeneration.
【期刊名称】《山东医药》
【年(卷),期】2017(057)032
【总页数】5页(P1-4,前插1)
【关键词】时子环髓核细胞;Ⅱ型胶原酶消化法;单层贴壁法;细胞培养;椎间盘退变
【作 者】李大鹏;吴燕;黄永辉;蒋璐;孙继芾;岳佳伟
【作者单位】江苏大学附属医院,江苏镇江 212001;江苏大学;江苏大学附属医院,江苏镇江 212001;江苏大学;江苏大学附属医院,江苏镇江 212001;江苏大学附属医院,江苏镇江 212001
【正文语种】中 文
【中图分类】R681.5
Abstract: Objective To establish a new method for isolation and culture of human nucleus pulposus cells (NPCs) in vitro and to explore its significance. Methods Human normal NPCs were isolated by type Ⅱ collagenase digestion, then were cultured and expanded in monolayer. Cell morphology was observed by inverted microscope; the proliferation ability (expressed as absorbance value) of passage 1, passage 2 and passage 3 NPCs were detected by CCK-8 assay for consecutive 12 days; the positive expression rates of type Ⅱ collagen (Col-2), cytokeratin 18 (KRT-18), KRT-19, hypoxia-inducible factor-1α(HI
F-1α), glucose transporter 1 (GLUT-1), Sox-9, aggrecan (ACAN), and CD24 in passage 2 NPCs were detected by immunohistochemistry. Results The isolate human NPCs were polygonal or short spindle, similar to chondrocytes. However, the nucleus pulposus cells after passage 4 grew slowly, the protrusion of cells extended, and the cells were long spindle shape, all of these indicated the cells were aging. The growth curve of NPCs was S-shaped, cells grew slowly in 1-2 days, then grew into the logarithmic growth phase in 3-7 days, and after 8 days the cells proliferated slowly and entered the plateau. After consecutive 12-day culture, the difference of absorbance values at 450 nm among passage 1, passage 2 and passage 3 NPCs was not statistically significant at the same time point (all P>0.05). Immunohistochemical staining showed: the positive rates of Col-2, KRT-18, KRT-19, GLUT-1, HIF-1α, Sox-9, ACAN, and CD24 in passage 2 NPCs were no less than 85.6% (85.6%-91.2%). Conclusions Human NPCs can be effectively isolated by 0.2% type Ⅱ collagenase digestion method, and can be cultured by monolayer adherence method. The cells we cultured were identified as nucleus pulposus cells by immunohistochemistry. There are no significant changes in the morphological and prolifer
ation abilities of NPCs within 3 generations, and could be used as seed cells for study of intervertebral disc degeneration.
Key words: nucleus pulposus cells; type Ⅱ collagenase digestion; monolayer adherence; cell culture; intervertebral disc degeneration
下腰痛的主要原因之一为椎间盘退变[1,2]。椎间盘在结构上由纤维环、软骨终板及髓核三部分组成[3,4]。目前研究认为，椎间盘退变始于髓核，髓核细胞(NPCs)的过早老化与凋亡使其数量减少、功能降低，使得聚集蛋白聚糖(ACAN)、Ⅱ型胶原(Col-2)等功能性细胞外基质的合成与分泌减少[5]，进而引起髓核水分含量降低并失去其凝胶状态，最终导致椎间盘生物学功能减退与丧失。椎间盘退变的生物学方法包括基因、细胞因子、干细胞移植、组织工程等[6,7]，可恢复NPCs的数量及功能，延缓甚至逆转椎间盘退变。2016年7～10月，本研究建立一种体外分离、培养人NPCs的新方法，并对其生物学特性进行鉴定，以期为椎间盘退变病因、机制及的相关基础研究提供稳定的细胞来源。
1.1 材料 主要试剂：髓核细胞培养基(NPCM，美国Sciencell公司)，Col-2(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Sciencell公司)，青霉素-链霉素(美国Sciencell公司)，CCK-8试剂盒(上
海翊圣生物科技有限公司)，Col-2、细胞角蛋白18(KRT-18)抗体、KRT-19抗体、低氧诱导因子1α(HIF-1α)抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，鼠抗人葡萄糖转运子1(GLUT-1)抗体、鼠抗人Sox-9抗体、鼠抗人CD24抗体、鼠抗人ACAN抗体(美国Santa Cruz公司)，SABC-POD(小鼠/兔IgG)免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。主要仪器：细胞培养超净台(苏州净化设备有限公司)，二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)，显微镜(德国Zeiss公司)。
1.2 人NPCs的分离及传代培养 选择1例因L2椎体爆裂骨折行L1/2髓核切除术及椎间融合术的患者(男性，20岁)，术中根据Gries评分标准[8]未见椎间盘退变。将切取的髓核组织置于超净台上，PBS反复冲洗至组织无血污，去除纤维环组织，并将髓核组织剪碎至1 mm3大小的组织块。加入不含胎牛血清的NPCM，1 500 r/min离心5 min，弃上清。加入0.2% Ⅱ型胶原酶10 mL，37 ℃恒温震荡消化4 h，1 500 r/min离心5 min，弃上清。加入含2%胎牛血清的NPCM 5 mL重悬细胞，以1×105个/mL接种至培养瓶中。37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下静置培养3天，加入NPCM 5 mL；培养7天时第1次换液，待细胞融合至90%时进行传代培养。本研究通过江苏大学附属医院医学伦理委员会审核，并与患者签订知情同意书。
ngd-071
1.3 NPCs生长情况观察 ①贴壁情况及细胞形态：观察细胞传代培养后的贴壁情况，200倍倒置显微镜下观察细胞形态。②细胞增殖能力：采用CCK-8法。取第1、2、3代生长状态良好的NPCs，消化收集细胞，以1×104～2×104个/mL接种至96孔板，每孔100 μL。每天固定时间加入CCK-8溶液，每孔10 μL，孵育4 h后采用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值，以吸光度值表示细胞增殖能力。实验重复3次，连续检测12天。
1.4 NPCs鉴定 采用免疫组化法。取第2代NPCs，加入胰蛋白酶消化，以1×105个/mL接种于24孔板， 每孔250 μL，细胞贴壁并融合至70%左右，给予4%多聚甲醛固定30 min。30% H2O2+纯甲醇(1∶50混合)室温浸泡30 min，蒸馏水冲洗2次；加入5% BSA封闭液，室温条件下孵育20 min，甩去多余液体；滴加抗Col-2一抗，4 ℃过夜，PBS冲洗2 min×3次；滴加生物素化山羊抗小鼠(或兔)IgG，20～37 ℃条件下孵育20 min，PBS冲洗2 min×3次；滴加SABC试剂，37 ℃条件下孵育20 min，PBS冲洗5 min×4次；DAB显，蒸馏水洗涤。200倍显微镜下观察染情况及阳性表达位置，以细胞质或者细胞核染出现棕黄视为阳性表达。每孔随机选取3个视野，阳性表达率=阳性细胞数/总细胞数×100%，取平均值。参照上述方法分别检测并计算细胞KRT-18、KRT-19、GLUT-1、HIF-1α、Sox-9、ACAN、CD24阳性表达率。
1.5 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用重复测量数据的方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 NPCs生长情况 原代NPCs贴壁缓慢，培养4～5天开始有细胞贴壁，14天左右基本铺满瓶底；细胞形态呈多角形或短梭形，类似于软骨细胞。传代后细胞贴壁较快，12 h内即可贴壁生长，细胞生长迅速，仍呈短梭形；第4代以后，NPCs细胞突起延长，呈长梭形，生长缓慢，出现老化现象。继电器底座
2.2 NPCs增殖能力 NPCs生长曲线呈S形：1～2天细胞生长缓慢；3～7天细胞生长迅速，进入对数生长期；8天后细胞增殖缓慢，进入平台期。连续培养12天，第1、2、3代NPCs相同时间点吸光度值比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。
2.3 NPCs免疫组化鉴定结果 NPCs中Col-2、KRT-18、KRT-19、GLUT-1、HIF-1α、Sox-9、ACAN、CD24阳性表达率分别为87.7%、88.1%、89.1%、85.6%、91.2%、90.1%、89.8%、87.0%。Col-2、KRT-18、KRT-19、GLUT-1、ACAN、CD24主要表达于NPCs的细胞质，HIF-1α主要表达于NPCs的细胞核，Sox-9在NPCs的细胞质和细胞核均有表达。见插页Ⅰ图1。
目前NPCs分离培养应用最多的为酶消化法，酶消化法又可分为酶序贯消化法和单纯Ⅱ型胶原酶消化法。前者先采用胰蛋白酶消化20～30 min，再予Ⅱ型胶原酶消化数小时，能分离出较多的细胞，但酶的联合应用可加重细胞损伤，并增加污染概率。而单纯Ⅱ型胶原酶消化法相对简单实用，对细胞影响小，但各研究采用酶的浓度(0.025%～2%)及酶作用的时间不尽相同[9～11]。本研究选用Ⅱ型胶原酶的浓度为0.2%，消化时间为4 h，结果显示获取的NPCs贴壁较快，生长状态良好。绝缘子串
NPCs的培养方法可分为三维培养法和单层贴壁培养法[12,13]。三维培养法利用藻酸盐等材料构建三维空间，NPCs在三维空间内通过材料的孔隙通道获取外界营养，该方法有利于NPCs维持软骨样细胞表型[14]，但细胞增殖缓慢、不易观察细胞形态等缺点限制了该方法的研究应用范围。单层贴壁法培养的细胞增殖速度快，可在短期内获得足量NPCs。本研究第1、2、3代的NPCs生长曲线呈S形， 3～7天细胞生长迅速迅速，进入对数生长期，此时细胞活力最佳，实验时应尽量选择此时对数生长期的细胞；而培养8天后NPCs生长曲线进入平台期，细胞停止增殖，此时需进行消化传代，否则细胞会发生形态改变，甚至死亡。但随着传代数的增加，细胞易出现去分化现象[15]。本研究结果表明，第4代后的NPCs细胞突起延长，呈长梭形，生长缓慢，出现老化现象，提示以NPCs为研究对象的相
侧安全气囊
关研究应尽量选取第3代以内的细胞。
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