复旦学报（医学版）
2021May，48（3）292
Fudan Univ J Med Sci
塑料拖把头
邵帅陈彦霖地里热巴提·地力木拉提贾锋△
（上海交通大学医学院附属仁济医院神经外科上海200127）
【摘要】目的探究麝香保心丸（Shexiang Baoxin Pill，SBP）在小鼠缺血性脑卒中的保护作用及机制。方法通过大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）构建脑缺血性卒中模型，将96只C57BL/6小鼠随机分成4组：假手术（Sham）组、模型（ischemia/reperfusion，I/R）组、低剂量麝香保心丸（LSBP，22.5mg/kg）组和高剂量麝香保心丸组（HSBP，45mg/kg），每组24只。灌胃4周后制备小鼠MCAO模型。记录各组小鼠的大脑梗死体积及脑组织含水量，利用免疫荧光技术分析激活的小胶质细胞数量，采用qRT-PCR检测炎症因子的表达，通过Western blot法分析NF-κB信号通路相关蛋白质的表达情况。结果与I/R组相比，LSBP组和HSBP组大脑梗死体积减少，脑组织含水量降低，激活的小胶质细胞数量减少，同时促进小胶质细胞由M1型向M2型极化，并抑制NF-κB信号通路的激活。结论SBP可以 减轻由缺血性脑卒中引起的小鼠脑组织损伤，其机制可能与改变小胶质细胞M1/M2的极化状态和抑制NF-κB信号通路的激活有关。
【关键词】麝香保心丸（SBP）；缺血性脑卒中；小胶质细胞；M1/M2极化；炎症因子；NF-κB信号通路；小鼠
电压互感器接线
无感电阻【中图分类号】R743.3，R332【文献标志码】Ａdoi：10.3969/j.issn.1672-8467.2021.03.002 Protective effect of Shexiang Baoxin pill on ischemic stroke in
mice and its mechanism
SHAO Shuai，CHEN Yan-lin，DILIMULATI Dilirebati，JIA Feng△
（Department of Neurosurgery，Renji Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai200127，China）
国家自然科学基金（81471855）
△Corresponding author E⁃mail：*****************。
网络首发时间：2021-05-1809∶23∶33网络首发地址：https：///kcms/detail/31.1885.R.20210517.1538.002.html
邵帅，等.麝香保心丸对小鼠缺血性脑卒中的保护作用及机制
inflammatory factor；NF-κB signaling pathway；mice
*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(81471855).
脑卒中包括出血性脑卒中和缺血性脑卒中，其发病率高、致残率高、死亡率高且复发率高［1］，已成为危害居民健康的常见难治性疾病。在我国，脑卒中引起的死亡率和致残率由1990年的第三位上升到2017年的首位［2］。缺血性脑卒中在我国脑卒中患者中占69.6%~70.8%［3-4］。缺血性脑卒中是大脑血管闭塞引起的脑组织缺血、缺氧和坏死，最终导致神经功能障碍［5］。近年来，机械取栓术缺血性脑卒中已取得巨大进步，但由于取栓时间窗的局限性，仅可对少数患者进行有效救治［6］，目前药物仅限于重组组织纤溶酶原激活剂［7］，因此研发新的有效手段势在必行。
麝香保心丸（Shexiang Baoxin pill，SBP）的组成（质量百分比）为麝香6%、人参提取物27%、牛黄4%、肉桂24%、苏合香酯8%、蟾酥4%及冰片19%，具有芳香温通、益气通心的功效，是一种多靶点、多作用途径的药物［8］。作为一种传统中药复方制剂，SBP可有效缓解心绞痛、改善血流动力学，已广泛用于心血管疾病［9］。目前关于SBP 急性缺血性脑卒中的临床研究较少，在动物实验方面尚未见报道。本实验通过建立小鼠大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，观察SBP对小鼠缺血性脑卒中产生的影响，并探索其中的分子作用机制，
以期为SBP缺血性脑卒中的临床应用提供理论和实验依据。
材料和方法
主要实验试剂及仪器本研究中96只健康雄性C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可号：SCXK（沪）2017-0011，体质量22~25g。饲养条件：12h的明暗循环，平均室温约24℃，相对湿度约50%，自由进食和饮水。动物实验符合上海交通大学医学院动物伦理相关规范。
SBP（上海和黄药业有限公司），线栓（广州佳灵生物技术有限公司），氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazole chloride，TTC）、钠（美国Sigma公司），GAPDH抗体（美国Cell Signaling Techonology公司），Iba-1抗体、NF-κb p-p65抗体（美国Abcam公
司），免疫荧光（immunofluorescence，IF）二抗、BCA 蛋白质检测试剂盒、Western blot二抗（美国Thermo 公司），DAPI染试剂盒、细胞核蛋白质与细胞质蛋白质抽提试剂盒、山羊血清、RIPA蛋白裂解液（上海碧云天生物技术有限公司），逆转录试剂盒、Syber Green（日本TaKara公司），qRT-PCR引物［铂尚生物技术（上海）有限公司］。
体式显微镜、石蜡切片机、激光共聚焦显微镜（德国Leica Microsystems公司），组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司），酶标仪、NanoDrop TM分光光度计（美国ThermoFisher公司），化学发光凝胶成像系统（美国Aplegen公司）。
实验分组与给药将C57BL/6小鼠随机分为假手术（Sham）组，模型（ischemia/reperfusion，I/R）组、低剂量（22.5mg/kg）麝香保心丸（low-dose SBP，LSBP）组、高剂量（45mg/kg）麝香保心丸（high-dose SBP，HSBP）组，每组24只，用药剂量参考文献报道［10］。用生理盐水配置成混悬液，灌胃给药，每日1次，连续给药4周，分别给予假手术与MCAO手术。
MCAO模型的建立参考文献［11］建立MCAO 模型。小鼠称重，50mg/kg钠腹腔麻醉，行左侧MCAO手术。动物四肢及头部固定于木板上，沿颈正中线切开皮肤，钝性分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。在体式显微镜下，首先在颈总动脉近心端打一活结，再在颈内动脉远心端打一活结，接着结扎颈外动脉远心端，在近心端打一松结，并在两个结之间做斜切口，快速插入线栓，使之头端稍微超过颈外动脉松结的位置，此时将颈内动脉处活结松开，并调整线栓的进线方向，使线栓头部沿颈内动脉进入，缓慢推动，直至有少许阻力感，停止推动线栓，并在颈内动脉处打活结固定线栓。1h 后缓慢退出线栓，将颈外动脉近心端结扎，松开颈总动脉活结，实施血流再灌注。逐层缝合皮肤，将动物放回笼中，待其自然苏醒，正常饮食。手术期间，用加热垫使肛温维持在（37.0±0.5）℃。术后动物出现步态不稳或前肢瘫痪则用于实验，单纯手术而未进线栓的动物作为假手术组。
TTC染造模24h后，用异氟烷麻醉小鼠，采
293
复旦学报（医学版）2021年5月，48（3）
取心脏灌流法，用生理盐水将小鼠血液排出，随后处
死小鼠（每组6只），取脑组织。将脑组织和大脑切片
槽，置于-20℃冰箱15min后，行冠状位切片，厚度为
2mm/片，切好的脑片放入2%染液中，避光置于
37℃恒温箱15min，取出脑片，摄像。用Image J软
件计算梗死面积并定量。
脑组织含水量按上述方法处理小鼠，取完整
的左侧脑组织，用电子天平称取湿重，放入恒温电
热干燥箱（105℃）烘烤72h，称取干重。按Elliott公
式计算脑组织含水量：含水量（%）=（湿重-干重）×
100%/湿重。
免疫荧光染按上述方法处理小鼠，再缓慢三板模
灌注4%多聚甲醛，取小鼠脑组织，去除嗅球及小
脑，4%多聚甲醛浸泡过夜。二甲苯和梯度酒精行
透明和脱水处理，再行石蜡包埋，制作厚度5μm的
冠状切片，55℃烘箱过夜。第二天，用二甲苯和梯
度酒精行脱蜡，柠檬酸和柠檬酸钠行抗原修复，5%
山羊血清溶液37℃恒温箱封闭1h，孵育Iba-1（1∶100，英国Abcam公司）抗体稀释液4℃过夜，次日PBS清洗3次，每次5min，最后DAPI室温孵育5min，封片。用激光共聚焦显微镜观察梗死侧Iba-1的表达情况。
qRT-PCR按上述方法处理小鼠，取左侧脑组织，放入1.5mL无酶离心管中，加入1mL TRIZOL 和预冷的磁珠，用组织研磨仪将组织打碎。加入200μL氯仿，手动剧烈摇晃1min，4℃下12000×g 离心15min，
将上清吸至另一离心管，加入等体积异丙醇，手动剧烈摇晃1min，4℃下12000×g离心10min，白RNA沉淀在管底，去上清，加入1mL 用DEPC水配置的75%乙醇溶液，4℃下7500×g 离心5min，去上清，室温晾干20min。加入适量DEPC水，吹打数次，溶解RNA。用Nanodrop测定样本浓度，再利用逆转录试剂盒（日本Takara公司）按说明书将RNA反转为cDNA，最后将cDNA稀释至50μL，用于qRT-PCR检测。按Syber Green试剂盒说明书配制实时荧光定量反应体系，加入荧光定量专用384孔板中进行反应，根据循环数检测基因表达水平。qRT-PCR引物由铂尚生物技术（上海）有限公司提供（表1）。
Western blot按上述方法处理小鼠，取左侧脑组织，放入1.5mL无酶离心管中，加入磁珠和含有PMSF的RIPA溶液，用组织研磨仪将组织打碎。按照细胞核蛋白质与细胞质蛋白质抽提试剂盒说明书，抽提细胞核蛋白质。依据BCA蛋白质检测试剂盒说明书，测定样品的蛋白质浓度，制作标准曲线，计算蛋白质浓度，加入相应的SDS蛋白质Loading缓冲液，混匀后放入100℃金属浴恒温器加热10min，置于冰上。采用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，再将蛋白质转移至PVDF膜上，使用5%脱脂奶粉室温封闭1h后，将PVDF膜加入TBST中，摇床晃动1min，加入相应一抗，4℃孵育过夜，次日用TBST洗膜3次，再加入相应的二抗，室温孵育1h，最后用TBST洗膜3遍，每遍5min。将PVDF膜放入超灵敏多功能成像仪中，加入显影液，反应后曝光得到不同目的条带，采用Image J软件分析蛋白质灰度值。
统计学方法采用SPSS19.0统计软件分析数据，定量数据以x±s表示，各组间数据差异比较采用One-w
ay ANOVA法分析，采用GraphPad Prism 5.0软件制作柱状图，P＜0.05为差异有统计学意义。
铜铝连接管
结果
MCAO模型建立4组小鼠连续灌胃4周后，建立MCAO模型，并在24h后取材（图1）。
SBP对小鼠脑梗死体积的影响每组取6只小鼠，正常状态下小鼠无脑梗死。造模后，与Sham组表1qRT-PCR的基因引物序列
Tab1Prime sequences in
qRT-PCR
294
邵帅，等.麝香保心丸对小鼠缺血性脑卒中的保护作用及机制相比，经TTC 染，I/R 组梗死体积明显大于Sham 组（P <0.001）。经SBP 灌胃预处理4周后，LSBP 组和HSBP 组梗死体积均明显小于I/R 组，差异有统计学意义（LSBP vs.I/R ，P =0.002；HSBP vs.I/R ，P <0.001），且SBP 对梗死体积减小具有剂量正相关性，HSBP 组梗死面积小于LSBP 组梗死体积，差异有统计学意义（P =0.005）。因此，SBP 可以减少缺血性脑卒中引起的梗死体积（图2A~C ）。
SBP 对小鼠脑组织含水量的影响
每组取6只
小鼠，与Sham 组相比，I/R 组脑组织含水量明显高于Sham 组（P <0.001），提示I/R 组脑组织水肿程度大于模型组。经SBP 灌胃预处理4周后，与I/R 组相比，LSBP 组和HSBP 组脑组织含水量均明显少于I/R 组，差异有统计学意义（LSBP vs.I/R ，P =0.007；HSBP vs.I/R ，P <0.001），且SBP 对脑水肿的改善与剂量正相关，HSBP 组脑水肿程度轻于LSBP 组，差异有统计学意义（P =0.036）。因此，SBP 可以缓解缺血性脑卒中引起的脑水肿（图2D ）。
SBP 对激活小胶质细胞数量的影响
每组取6
只小鼠，经IF 检测，与Sham 组相比，I/R 组Iba -1+细胞数量明显增加（P <0.001），Iba -1可作为激活小胶质细胞的标记物［12］，这提示I/R 组激活的小胶质细胞数量增加。在缺血性脑卒中的急性期，大量激活的小胶质细胞提示炎症反应加重。经SBP 灌胃预处理4周后，与I/R 组相比，LSBP 组和HSBP 组Iba -
1+细胞数量明显下降，差异有统计学意义（LSBP vs.I/R ，P =0.007；HSBP vs.I/R ，P <0.001），且SBP 对小胶质细胞激活的抑制作用具有剂量正相关性，HSBP 组Iba -1+细胞数量少于LSBP 组，差异有统计学意义（P =0.041）。因此，SBP 可以减少缺血性脑卒中后激活小胶质细胞的数量（图3）。
SBP 对炎症因子表达的影响
每组取6只小
鼠，经qRT -PCR 检测，与Sham 组相比，I/R 组M 1型和M 2型小胶质细胞标志性炎症因子（M 1型：
TNF -α、I L -1β、MCP -1、CXCL 1；M 2型：Arg -1、Ym -1、Mgl 1、Fizz 1）表达均明显增加，差异有统计学意义（A rg -1：P =0.0017；其他P 均<0.001），提示炎症反应加重。经SBP 灌胃预处理4周后，与I/R 组相比，LSBP 组和HSBP 组M 1型小胶质细胞标志性炎症因子表达水平明显下降，差异有统计学意义（IL -1β：LSBP vs.I/R ，P =0.0047；MCP -1：LSBP vs.I/R ，P =0.009；CXCL 1：LSBP vs.I/R ，P =0.044；其他P 均<0.001）。且SBP 对M 1型炎症因子表达的抑制作用具有剂量正相关性，HSBP 组M 1型炎症因子表达水平低于LSBP 组，差异有统计学意义（TNF -α：P <0.001；IL -1β：P =0.031；MCP -1：P =0.007；CXCL1：P =0.028）。与I/R 组相比，LSBP 组和HSBP 组M 2型炎症因子表达水平均有所增加，部分差异有统计学意义（Arg -1：LSBP vs.I/R ，P
=
A ：Groups of experiment ；
B ：MCAO model （left side ）.CCA ：Common carotid artery ；ICA ：Inter carotid artery ；ECA ：External carotid artery ；BA ：Basilar artery ；PPA ：Pterygopalatine artery ；MCA ：Middle cerebral artery.
图1
小鼠实验分组以及MCAO 模型建立
Fig 1
Experimental grouping and establishment of MCAO model
295
复旦学报（医学版）2021年5月，48（3）
0.067，HSBP vs.I/R ，P =0.0083；Ym 1：LSBP vs.I/R ，P =0.036，HSBP vs.I/R ，P <0.001；Mgl 1：LSBP vs.I/R ，P =0.014，HSBP vs.I/R ，P =0.004；Fizz 1：LSBP vs.I/R ，P =0.193，HSBP vs.I/R ，P =0.047）。因此，SBP 可以促进小胶质细胞由M 1型向M 2型极化（图4）。
SBP 对NF-κB 信号通路相关蛋白质水平的影响
每组取6只小鼠，经Western blot 检测，与Sham 组相比，在细胞核内I/R 组p -p 65/p 65水平明显增高
（P <0.001）。经SBP 灌胃预处理4周后，LSBP 组和HSBP 组p -p 65/p 65的水平都有所减少，差异有统计学意义（LSBP vs.I/R ，P =0.007；HSBP vs.I/R ，P <0.001），且SBP 对p -p 65/p 65的抑制作用具有剂量正相关性，HSBP 组p -p 65/p 65水平低于LSBP 组，差异有统计学意义（P =0.008）。因此，SBP 可以抑制细胞核内NF -κB 通路的激活，从而减轻缺血性脑卒中带来的炎症反应（图5）
。
A ：The representative photograph of TTC staining for each group ；
B ：Quantification of ischemic infarct volume ；
C ：Quantification of ischemic
infarct size ；D ：Quantification of brain water content.（1）P <0.05；（2）P <0.01；（3）金刚石悬浮抛光液
P <0.001（each group ，n =6）.
图2
SBP 减少小鼠缺血性脑卒中引起的梗死体积和脑水肿程度
Fig 2
SBP reduced the infarct size and infarct volume and cerebral edema caused by ischemic stroke in
mice
A ：Representative immunofluorescence staining of Iba -1in ipsilateral brain sections 24h after sham operation or MCAO in all groups （400×）；
B ：Quantitative analyses of Iba -1+cells/total cells.（1）P <0.05；（2）P <0.01；（3）P <0.001（each group ，n =6）.
图3
SBP 减少小鼠缺血性脑卒中后激活小胶质细胞的数量
Fig 3
SBP reduced the number of activated microglia caused by ischemic stroke in mice
296
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议