工程化的鹿茸干细胞外泌体和制备方法、及在骨肉瘤中的应用

1.本发明涉及肿瘤技术领域，具体是工程化的鹿茸干细胞外泌体和制备方法、及在骨肉瘤中的应用。

背景技术：

2.骨肉瘤也叫成骨肉瘤，是较常见的发生在20岁以下的青少年或儿童的一种恶性骨肿瘤，在小儿骨恶性肿瘤中最多见，约为小儿肿瘤的5%。骨肉瘤是骨恶性肿瘤中最多见的一种，是从间质细胞系发展而来，肿瘤迅速生长是由于肿瘤经软骨阶段直接或间接形成肿瘤骨样组织和骨组织。下肢负重骨在外界因素（如病毒）的作用下，使细胞突变，可能与骨肉瘤形成有关。典型的骨肉瘤源于骨内，另一与此完全不同类型的是与骨皮质并列的骨肉瘤，源于骨外膜和附近的结缔组织。后者较少见，预后稍好。
3.骨肉瘤目前仍是儿童和青少年恶性肿瘤死亡率很高的疾病，但早期发现和及时已经从很大程度上提高了该病的生存率。研究发现mir-143是一种抑癌因子，但其在骨肉瘤中的表达受到了显著抑制。

技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供工程化的鹿茸干细胞外泌体和制备方法、及在骨肉瘤中的应用，提供一种携带mir-143的鹿茸干细胞外泌体，提高mir-143在骨肉瘤中的表达，有效抑制骨肉瘤。
5.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：工程化的鹿茸干细胞外泌体，所述鹿茸干细胞外泌体负载有mir-143，所述mir-143的表达水平为800-1700copy/μl。
6.本发明将所述鹿茸干细胞外泌体应用于骨肉瘤的药物组合物、药盒或药物制品中，通过所述鹿茸干细胞外泌体负载mir-143来提高其在骨肉瘤的中的表达，显著提高其对骨肉瘤的抑制效果，并对所述mir-143的表达水平进行限定，使其能够在最大水平内实现对骨肉瘤的抑制以及增强问题免疫的双重功能。
7.所述工程化的鹿茸干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：s1、培养鹿茸干细胞s11、选取鹿茸的间充质组织，洗去血污，将其切割成碎块，将所述碎块洗涤干净后置于离心管中，离心收集沉淀a；s12、将所述沉淀a进行消化处理，消化处理后加入dmem原代培养液进行洗涤，其后离心收集沉淀b；s13、将所述沉淀b均匀涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入dmem原代培养液，置于细胞培养箱中培养，其后正置培养瓶继续静置培养，其后将细胞进行胰蛋白酶消化，冻存，获得原代鹿茸干细胞；s14、将所述原代鹿茸干细胞在传代培养基上进行传代培养，得到鹿茸干细胞；
s15、取新鲜培养基，将所述鹿茸干细胞接种于所述新鲜培养基上，并向所述新鲜培养基中加入mir-143的慢病毒悬液进行培育，得到携带mir-143的鹿茸干细胞；s2、分离外泌体将培育的携带mir-143的鹿茸干细胞置于离心管中，在4℃下，经过300r/min离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、2000r/min下离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、20000r/min下离心30min；取上清液置于新的超速离心管中，在4℃、100000r/min下离心2h；收集沉淀，经过无菌pbs重悬，在经过无菌滤膜（0.22μm）过滤后，得到外泌体进行低温保存。
8.本发明提供了所述鹿茸干细胞外泌体的制备方法，获得携带mir-143的结构较为完整、杂质较少的所述鹿茸干细胞外泌体。所述鹿茸干细胞还可采用三维培养体系进行培养，所述三维培养体系包括具有分子截留量作用的中空纤维，所述中空纤维锚定在管状的密闭系统中，向所述中空纤维之间灌注营养物质，使得接种的鹿茸干细胞在所述中空纤维的壁面上长时间粘附，浓缩富集大量的所述鹿茸干细胞释放的外泌体，便于培养大量的携带mir-143的鹿茸干细胞外泌体。
9.进一步的，步骤s11中所述鹿茸选用生长周期为30-40天的鹿茸，所述碎块的体积为0.6-0.8 mm3，所述碎块的添加量为3-4g，离心操作为在1200r/min离心4min。
10.进一步的，步骤s12的所述消化处理为：向所述沉淀a中加入30ml消化液，在40℃下振荡消化，在所述碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化，并在1200r/min下离心4min，弃上清；所述dmem的加量为10ml；所述离心操作为在1200r/min下离心4min。
11.进一步的，步骤s13中所述dmem原代培养液的添加量为2-3ml，培养条件为36℃、5％co2，培养时间为4h；当细胞达到70-75％汇合时进行胰蛋白酶消化处理。
12.进一步的，步骤s14中所述鹿茸干细胞为所述原代鹿茸干细胞传代至3-5代的鹿茸干细胞。
13.进一步的，步骤s15中，所述新鲜培养基为rpmi1640培养基，培养条件为36℃、5％co2。
14.本发明的有益效果是：本发明提供了鹿茸干细胞外泌体的制备方法，获得高质量的携带mir-143的鹿茸干细胞外泌体，将其应用于骨肉瘤的药物组合物、药盒或药物制品中，通过所述鹿茸干细胞外泌体负载mir-143来显著提高mir-143在骨肉瘤的中的表达，从而显著提高对骨肉瘤的抑制效果。
具体实施方式
15.下面结合实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
16.实施例1工程化的鹿茸干细胞外泌体，所述鹿茸干细胞外泌体负载有mir-143，所述mir-143的表达水平为800-1700copy/μl；所述工程化的鹿茸干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：s1、培养鹿茸干细胞s11、选取生长周期为30天的鹿茸的间充质组织，洗去血污，将其切割成0.8 mm3的
碎块，将3g所述碎块洗涤干净后置于离心管中，在1200r/min离心4min，收集沉淀a；s12、将向所述沉淀a中加入30ml消化液，在40℃下振荡消化，在所述碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化，并在1200r/min下离心4min，弃上清；所述dmem的加量为10ml；所述离心操作为在1200r/min下离心4min，向沉淀中加入dmem原代培养液进行洗涤，其后离心收集沉淀b；s13、将所述沉淀b均匀涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入3ml dmem原代培养液，置于36℃、5％co2的细胞培养箱中培养4h，其后正置培养瓶继续静置培养，当细胞达到70％汇合时进行胰蛋白酶消化，冻存，获得原代鹿茸干细胞；s14、将所述原代鹿茸干细胞在传代培养基上进行传代培养3-5代，得到稳定的鹿茸干细胞；s15、取rpmi1640培养基，将所述鹿茸干细胞接种于rpmi1640培养基上，并向所述rpmi1640培养基中加入2μl mir-143的慢病毒悬液在36℃、5％co2进行培育15天，每三天更换新rpmi1640培养基，得到携带mir-143的鹿茸干细胞；s2、分离外泌体将培育的携带mir-143的鹿茸干细胞置于离心管中，在4℃下，经过300r/min离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、2000r/min下离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、20000r/min下离心30min；取上清液置于新的超速离心管中，在4℃、100000r/min下离心2h；收集沉淀，经过无菌pbs重悬，在经过无菌滤膜（0.22μm）过滤后，得到外泌体进行低温保存。
17.实施例2工程化的鹿茸干细胞外泌体，所述鹿茸干细胞外泌体负载有mir-143，所述mir-143的表达水平为800-1700copy/μl；所述工程化的鹿茸干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：s1、培养鹿茸干细胞s11、选取生长周期为40天的鹿茸的间充质组织，洗去血污，将其切割成0.7 mm3的碎块，将3g所述碎块洗涤干净后置于离心管中，在1200r/min离心4min，收集沉淀a；s12、将向所述沉淀a中加入30ml消化液，在40℃下振荡消化，在所述碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化，并在1200r/min下离心4min，弃上清；所述dmem的加量为10ml；所述离心操作为在1200r/min下离心4min，向沉淀中加入dmem原代培养液进行洗涤，其后离心收集沉淀b；s13、将所述沉淀b均匀涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入3ml dmem原代培养液，置于36℃、5％co2的细胞培养箱中培养4h，其后正置培养瓶继续静置培养，当细胞达到73％汇合时进行胰蛋白酶消化，冻存，获得原代鹿茸干细胞；s14、将所述原代鹿茸干细胞在传代培养基上进行传代培养3-5代，得到稳定的鹿茸干细胞；s15、取rpmi1640培养基，将所述鹿茸干细胞接种于rpmi1640培养基上，并向所述rpmi1640培养基中加入2μl mir-143的慢病毒悬液在36℃、5％co2进行培育15天，每三天更换新rpmi1640培养基，得到携带mir-143的鹿茸干细胞；s2、分离外泌体
将培育的携带mir-143的鹿茸干细胞置于离心管中，在4℃下，经过300r/min离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、2000r/min下离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、20000r/min下离心30min；取上清液置于新的超速离心管中，在4℃、100000r/min下离心2h；收集沉淀，经过无菌pbs重悬，在经过无菌滤膜（0.22μm）过滤后，得到外泌体进行低温保存。
18.实施例3工程化的鹿茸干细胞外泌体，所述鹿茸干细胞外泌体负载有mir-143，所述mir-143的表达水平为800-1700copy/μl；所述工程化的鹿茸干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：s1、培养鹿茸干细胞s11、选取生长周期为40天的鹿茸的间充质组织，洗去血污，将其切割成0.6 mm3的碎块，将3g所述碎块洗涤干净后置于离心管中，在1200r/min离心4min，收集沉淀a；s12、将向所述沉淀a中加入30ml消化液，在40℃下振荡消化，在所述碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化，并在1200r/min下离心4min，弃上清；所述dmem的加量为10ml；所述离心操作为在1200r/min下离心4min，向沉淀中加入dmem原代培养液进行洗涤，其后离心收集沉淀b；s13、将所述沉淀b均匀涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入2ml dmem原代培养液，置于36℃、5％co2的细胞培养箱中培养4h，其后正置培养瓶继续静置培养，当细胞达到75％汇合时进行胰蛋白酶消化，冻存，获得原代鹿茸干细胞；s14、将所述原代鹿茸干细胞在传代培养基上进行传代培养3-5代，得到稳定的鹿茸干细胞；s15、取rpmi1640培养基，将所述鹿茸干细胞接种于rpmi1640培养基上，并向所述rpmi1640培养基中加入2μl mir-143的慢病毒悬液在36℃、5％co2进行培育15天，每三天更换新rpmi1640培养基，得到携带mir-143的鹿茸干细胞；s2、分离外泌体将培育的携带mir-143的鹿茸干细胞置于离心管中，在4℃下，经过300r/min离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、2000r/min下离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、20000r/min下离心30min；取上清液置于新的超速离心管中，在4℃、100000r/min下离心2h；收集沉淀，经过无菌pbs重悬，在经过无菌滤膜（0.22μm）过滤后，得到外泌体进行低温保存。
19.体外实验在体外培养的骨肉瘤细胞中加入携带mir-143的鹿茸干细胞外泌体，孵育30h。其后检测骨肉瘤细胞的增殖能力以及凋亡检测；空白对照为添加与外泌体等量的生理盐水。
20.检测结果显示，与空白对照相比，携带mir-143的鹿茸干细胞外泌体能有效骨肉瘤细胞的增殖能力，相对凋亡细胞数显著升高，提高其凋亡能力，达到显著抑制骨肉瘤的作用。
21.体内实验将1
×
107个骨肉瘤细胞注射于4-6周裸鼠的后肢膝关节皮下，建立裸鼠移植瘤，七天后，每3天监测二次肿瘤情况，监测肿瘤的长、宽并计算肿瘤的体积(体积＝肿瘤长径乘以
肿瘤短径的平方的二分之一)。裸鼠接受尾静脉注射携带mir-143的外泌体，每三天注射一次，每次10ug蛋白含量的外泌体；连续四周，注射期间及注射结束后继续观察4周；空白对照为注射与外泌体等量的生理盐水。
22.观察结果显示，与空白对照相比，携带mir-143的鹿茸干细胞外泌体能明显抑制骨肉瘤的生长。
23.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

技术特征：

1.工程化的鹿茸干细胞外泌体，其特征在于：所述鹿茸干细胞外泌体负载有mir-143。2.工程化的鹿茸干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、培养鹿茸干细胞s11、选取鹿茸的间充质组织，洗去血污，将其切割成碎块，将所述碎块洗涤干净后置于离心管中，离心收集沉淀a；s12、将所述沉淀a进行消化处理，消化处理后加入dmem原代培养液进行洗涤，其后离心收集沉淀b；s13、将所述沉淀b均匀涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入dmem原代培养液，置于细胞培养箱中培养，其后正置培养瓶继续静置培养，其后将细胞进行胰蛋白酶消化，冻存，获得原代鹿茸干细胞；s14、将所述原代鹿茸干细胞在传代培养基上进行传代培养，得到鹿茸干细胞；s15、取新鲜培养基，将所述鹿茸干细胞接种于所述新鲜培养基上，并向所述新鲜培养基中加入mir-143的慢病毒悬液进行培育，得到携带mir-143的鹿茸干细胞；s2、分离外泌体将培育的携带mir-143的鹿茸干细胞置于离心管中，在4℃下，经过300r/min离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、2000r/min下离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、20000r/min下离心30min；取上清液置于新的超速离心管中，在4℃、100000r/min下离心2h；收集沉淀，经过无菌pbs重悬，在经过无菌滤膜过滤后，得到外泌体进行低温保存。3.根据权利要求2所述的工程化的鹿茸干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤s11中所述鹿茸选用生长周期为30-40天的鹿茸，所述碎块的体积为0.6-0.8 mm3，所述碎块的添加量为3-4g，离心操作为在1200r/min离心4min。4.根据权利要求2所述的工程化的鹿茸干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤s12的所述消化处理为：向所述沉淀a中加入30ml消化液，在40℃下振荡消化，在所述碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化，并在1200r/min下离心4min，弃上清；所述dmem的加量为10ml；所述离心操作为在1200r/min下离心4min。5.根据权利要求2所述的工程化的鹿茸干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤s13中所述dmem原代培养液的添加量为2-3ml，培养条件为36℃、5％co2，培养时间为4h；当细胞达到70-75％汇合时进行胰蛋白酶消化处理。6.根据权利要求2所述的工程化的鹿茸干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤s14中所述鹿茸干细胞为所述原代鹿茸干细胞传代至3-5代的鹿茸干细胞。7.根据权利要求2所述的工程化的鹿茸干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤s15中，所述新鲜培养基为rpmi1640培养基，培养条件为36℃、5％co2。8.工程化的鹿茸干细胞外泌体在骨肉瘤中的应用，其特征在于：将所述鹿茸干细胞外泌体应用于骨肉瘤的药物组合物、药盒或药物制品中，所述鹿茸干细胞外泌体携带mir-143。

技术总结

本发明公开了工程化的鹿茸干细胞外泌体和制备方法、及在骨肉瘤中的应用；所述鹿茸干细胞外泌体负载有miR-143；其制备方法包括以下步骤：选取鹿茸的间充质组织，经过预处理后培养鹿茸干细胞，向培育有鹿茸干细胞的培养基中加入miR-143的慢病毒悬液进行培育，得到携带miR-143的鹿茸干细胞；将培育的携带miR-143的鹿茸干细胞置于离心管中，经过超高速离心后，得到外泌体进行低温保存；本发明提供一种携带miR-143的鹿茸干细胞外泌体，提高miR-143在骨肉瘤中的表达，有效抑制骨肉瘤。有效抑制骨肉瘤。