实验名称：番茄愈伤组织培养
院系：生命科学学院
专业：生物工程
班级：---生物工程-班
姓名： ------
学号：---------
指导老师：------
同组人员： 林0海、黄0冬、黄0城
番茄愈伤组织培养
摘要：
番茄(tomato) 为茄科,一年生或多年生草本植物。是我们的大众食品，营养丰富。近年来最求无毒无公害蔬果成为一种健康的风向标。而番茄的在市场上的需求量越来越大，所以我们设计利用组织培养的基础知识，对番茄进行外植体的组织培养，以达到掌握外植体灭菌的基本方法以及无菌操作技术。本实验采用先对番茄种子进行培育，再利用培养的幼苗选取外植体进行愈伤组织培养，以诱发愈伤组织的生长为最终目的。 关键词：
愈伤组织；种子；外植体。
实验原理：
植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞， 脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。
愈伤组织是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞胞分裂快，结构疏松，颜浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。
蓝牙天线在植物组织培养中，无菌培养是关键，所以我们为了减少被污染的几率，我们组选择了先用番茄种子培养生成完整的幼苗，然后再以幼苗为外植体，在无菌操作的条件下接种外植体进行第二次培养。
材料的准备：
1、前期器材准备：
烧杯（100ml 3个，用于放初步处理后的外植体；1L 1个，用作废液缸；250ml 3个，包好牛皮纸后灭菌，分别装酒精、和无菌水）、电子天平、称量纸（若干）、钥匙（若干）、玻璃棒（一根）、量筒（100ml和10ml各1个），胶头滴管（1个）、陶瓷烧杯（1L 1个）、电炉（配有石棉网）、酸性ph试纸、锥形瓶（250ml 4个，用于配置专属培养基；
500ml 2个，装无菌水；100ml 40个，用于接种）、皮筋（或棉绳，若干）、牛皮纸（40+2+2，按锥形瓶口和烧杯口大小裁好）、记号笔（或标签纸）、培养皿（10套）、铁质饭盒内装操作工具（手术刀柄2个、手术剪1个、长形镊子2个，小型镊子2个）、吸水纸（若干）、脱脂棉、滤纸（若干）、高压灭菌锅、超净工作台、保鲜膜、酒精灯、打火机、手术刀片（2片）、人工气候箱
2、前期药品配置：
75% 酒精、1mol/L HCl、1mol/L NaOH、大量元素母液、微量元素母液、有机物母液、铁盐母液、无菌水、0.1%HgCl2、乙醇、蔗糖、琼脂、6-BA、NAA
3、实验材料：番茄茎叶
实验步骤：
1、各种实验器材的准备及清洗
2、各种母液的配置：
表1、培养基的各种元素成分
过氧化氢浓度测定类型 成分 培养基中 配置母液 母液体积 配1L培养基 扩大倍数
工作液 称取量g ml 吸取量/ml
浓度mg/L
大量元素 NH4NO3 1650 16500
KNO3 1900 19000
CaCl2·2H2O 440 4400 1000 100 100
MgSO4·7H2O 370 3700
KH2PO4 170 1700
微量元素KI 0.83 83
H3BO3 6.2 620
MnSO4·4H2O 22.3 2230
ZnSO4·7H2O 8.6 860 1000 10 100
Na2MoO4·2H2O 0.25 25
CuSO4·5H2O 0.025 2.5
CoCl2·6H2O 0.025 2.5
铁盐 FeSO4·7H2O 27.8 2780 1000 10 100
Na2-EDTA 37.3 3730
有机物质 肌醇 100 5000
烟酸 0.5 25
盐酸吡哆素 0.5 25 500 10 50
盐酸硫胺素 0.4 20
甘氨酸 2.0 100
3、MS培养基的配置：
取容量为1L的搪瓷杯，先加入600ml的蒸馏水，放在电炉上进行加热，后依次加入100ml大量元素母液、10ml微量元素母液、5ml铁盐母液、10ml有机物母液、30g蔗糖和9g琼脂粉。
注意：
1）要在前种物质全部溶解后才能加入后种物质。
2）加热过程中要不停地搅拌。
当半成品的溶液沸腾时立即从电炉上取下搪瓷杯，放在实验桌上，用玻璃棒沾取少量的液体滴在酸性ph试纸上，用0.1mol/L的NaOH或0.1mol/L的HCl调整液体的pH至5.6—5.8，最后在搪瓷杯中用蒸馏水定容至1L。
4、培养基的分装：
将1L的MS培养基分装到4个250ml的锥形瓶中，分别配成6个组的专属培养基，并各自倒入10个25ml的小锥形瓶中，用2层牛皮纸包好并用皮筋扎好，最后用记号笔做好记号
表2、不同浓度的植物生长调节物质
培养基编号 | 6-BA(mg/L) | NAA(mg/L) | IBA(mg/L) |
1 | 1.00 | 0.20 | 0.00 |
2 | 1.00 | 0.00 | 0.10 |
3 | 2.00 | 0.20 | 0.00 |
4 | 2.00 | 0.00 | 0.30 |
5 | 3.00 | 0.50 | 0.00 |
6 | 3.00 | 0.00 | 0.50 |
| | | |
5、灭菌：
1）培养基及器具灭菌：
培养基、无菌水需要在高压灭菌锅中灭菌。灭菌作用取决于温度，常用的灭菌
温度为121℃，时间为30min，灭菌结束后待温度下降到50℃以下，才能取出
已灭菌的培养基。可用同样方法对器具同时进行灭菌，包括：培养皿、解剖刀、
剪子、滤纸、镊子等。
2）工作环境灭菌：
接种前1ｈ打开超净工作台和棚面的紫外灯照射40min。杀菌结束后，先关掉
棚面的紫外灯，再打开风机，最后关掉超净工作台上的紫外灯。在接种后休息
时，要先打开台面的紫外灯，再关风机，最后打开棚面紫外灯。不能将风机与
台面上的紫外灯同时关闭或先关闭风机再开紫外灯。
6、 材料预处理：
（1）、种子处理：自来水冲洗种子20min；0.1%的浸泡5~10min，依照种皮硬度而定，所以番茄种子我们只消毒5min；然后用无菌水冲洗4次；进行胚培养。
7、接种：
1）将所需物品放入超净工作台：
三种实验材料、灭菌好的培养基、无菌水、培养皿、吸水纸、操作工具、空烧
杯、75%酒精、0.1%溶液、废液缸、刀片、酒精灯、打火机
2）进入接种室前，需要洗净手和手腕。进入超净工作台内需用75%酒精纱布擦拭手、
手腕，再擦培养基瓶和超净工作台。
3）剪、镊消毒：
接种前剪、镊应插入75%酒精瓶中，取出后置于酒精灯外焰上彻底灼烧，灼烧
时应将剪口、镊口张开，烧至剪、镊上火焰熄灭为止，冷却后方可进行接种。
接种后仍需灼烧并插回75%酒精的磨口瓶待用。注意每次取出时剪口并拢，不
可接触磨口瓶和其它器皿，并保持尖端向下。
4）种子接种：将处理好的种子无菌操作放进准备好的果酱瓶培养基中，一般放2~3颗。
5）外植体的接种：无菌工作台上，挑选培养好的植物种子（一般是长出两片子叶即可），小心用剪刀剪去外植体，移植到新的培养基中（表2中的各类培养基）。
左手拿三角瓶，解开封口膜，将三角瓶几乎水平拿着，靠近酒精灯焰，将瓶口外部在酒精灯火焰上燎数秒钟，使瓶口的水气散发掉。用右手拇指、食指、中指拿消毒过的镊子夹一块外植体（种子）送入瓶内轻轻的插入培养基上，镊子灼烧后放回磨口瓶，再把封口膜在酒精灯火焰上燎数秒，灼燎时应旋转，避免烧坏，盖好封口膜，扎紧皮筋，便完成了第一瓶的操作，接着再做第二瓶，如此直到外植体全部接完。
6）后期工作：
将接种好的锥形瓶放到培养室内，用保鲜膜包好后用皮筋扎好，再用记号笔注明接
种的日期，最好按一定的顺序排好。将超净台整理干净，废物废液倒到相应地方，
各类实验器具清洗干净后摆放到指定地方。
7）注意事项：
① 操作人员的头、胳膊等不得进入台内
② 操作人员不得随意谈话、说笑，以免造成污染
③ 用酒精对双手消毒时，务必待酒精彻底挥发后再靠近酒精灯火焰，以免火焰伤
④ 台外人员走动要轻、动作要小
8、培养：
培养室的温度应控制在25~28℃，每日光照时间为10~12h，光照强度为1600~2000lx。
此外还要定期观察是否出现污染。
9、结果的观察及记录：
在接种后的一周、两周和三周，分别观察各锥形瓶内愈伤组织的形成情况和污染情况，
做好记录工作。在三次记录工作完成之后对结果进行分析，计算出诱导率和污染率，并
做相应的实验结果分析。
诱导率（%）=形成愈伤组织数/总接种数×100
污染率（%）=污染数/总接种数×100
纳米烟嘴图6、2012/4/26接种一周 图7、2012/5/3接种2周 图8、2012/5/10接种3周
本次外植体的接种是在2012/4/19进行的，图6中可以看到，被剪切过的外植体的伤口处已经形成了愈伤组织。
图7、接种两周后的图像，有一些培养基开始出现了污染的现象。但是有一部分没有被污染的培养基中的外植体，已经开始脱分化形成完全的愈伤组织了。
图8、在接种3周后，我们在一些培养基中可以看到，所形成的愈伤组织中，仔细观察可以看到有细小的绿的类似叶子的生长物，表面已经成功诱导出了叶子。
（3）、种子培养的萌发率与污染率
表3、种子培养的萌发率与污染率的统计
消毒方法 | 无心磨床调机方法萌发率% | 污染率 |
第5天 | 第10天 | 第12天 | 第15天 |
信号器0.1% | 18.3 | 88.6 | 100 | 100 | 智能定位 0 |
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