第一部分儿童B系急性淋巴细胞性白...

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儿童B系急性淋巴细胞性白血病CD133-2的生物学

特性及其分子机制初步研究

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目的：探究CD133-2在儿童B系急性淋巴细胞白血病（B-ALL）作为干细胞标志物表达的意义及其作用的分子机制，从而明确CD133-2是否为儿童B-ALL的白血病干细胞（LSC）标志，也为进一步研究儿童B-ALL的分子发病机制奠定实验基础。

方法：

1、流式细胞术检测初诊和复发儿童B-ALL（共38例，包含初诊34例，复发4例）骨髓单个核细胞（BM-MNCs）CD133-2的表达（IgG1-PE为同型对照），并采集5例CD133-2阳性表达(比例≥20%) 的B-ALL患儿（初诊4例，复发1例）BM-MNCs，免疫磁珠分选法（MACS）分选纯化出CD133-2+CD19+、CD133-2+CD19-、CD133-2-CD19+、CD133-2-CD19-四组亚细胞，体外甲基纤维素半固体集落培养（包含SCF 、GM-CSF 、G-CSF 、IL-3 、IL-6 、EPO 等成分），观察各亚集落形成能力，并对培养后形成的集落细胞瑞氏-姬萨姆染做形态学鉴定。

2、6例CD133-2表达阳性的B-ALL（初诊4例，复发2例）患儿BM-MNCs中MACS 分选纯化出CD133-2+CD19+、CD133-2+CD19-、CD133-2-CD19+、CD133-2-CD19-四组亚细胞，以CD133-2+CD19-亚细胞为实验组，CD133-2-CD19+亚细胞为对照组，采用Real-time PCR法和基因芯片试剂盒，分析与TGF-β信号通路相关的84个基因分子在以上两细胞中的表达差异。

制作智能卡结果：

1、流式细胞仪检测结果显示：38例儿童B-ALL中， CD133-2的阳性表达率为60.5% （比例≥20%为表达阳性）。其中5例儿童B-ALL的BM-MNCs经MACS分选纯化后，体外甲基纤维素半固体集落培养14天，CD133-2+CD19-细胞在第5天出现红系集落，第7天后出现混合集落，第10天时集落较第5天增长10倍，增长速度明显加快，第12天时集落状态良好，第14天后集落未再增加。对生长状态良好的碗形垫片

集落细胞瑞氏-姬萨姆染，CD133-2+CD19-形成的集落中可见红系、粒系、巨噬和单核系细胞。其他亚形成集落不明显。比较各亚细胞集落形成方面差异具有显著的统计学意义（P<0.001）。

2、Real-time PCR检测结果显示：初诊儿童B-ALL中CD133-2+CD19-细胞亚与TGFβ信号通路下游DCN、IGFBP

3、THBS1、Smad6基因的上调有关，与SERPINE1基因的下调有关；复发组中CD133-2+CD19-细胞亚与TGFβ信号通路下游TGFβ1、LTBP1基因的上调有关，与IGFBP3、 SERPINE1基因的下调有关。

结论：

1、体外半固体集落培养表明儿童B-ALL中CD133-2+CD19-细胞亚具有多向分化能力，结合我们前期体外悬浮培养结果提示其具有长期增殖能力，说明此亚具备了LSC的特性，由此CD133-2+CD19-亚可能是儿童B-ALL来源的LSC免疫表型标志。

2、DCN、IGFBP

3、THBS1、Smad6、SERPINE1以及TGFβ1、LTBP1、IGFBP3、SERPINE1等TGFβ信号通路的转录分子分别参与了初诊和复发B-ALL患儿CD133-2+CD19-亚细胞生物学特性的调控，这些分子的异常表达可能与儿童B-ALL 的发病或复发有关。

关键词：儿童B系急性淋巴细胞白血病；CD133-2；白血病干细胞；TGF-β信号通路分子

微型立交桥作者：庞丽

指导教师：赵文理

废棉Biological Characteristics of CD133-2 in Childhood

B-lineage Acute Lymphoblastic Leukemia and its Primary

Molecular Mechanism

Abstract

Objective To explore the significance of expression of CD133-2 in childhood B-lineage acute lympho

blastic leukemia (B-ALL) and its primary molecular mechanism, we evaluated whether CD133-2 will be a marker of leukemia stem cells (LSC), and which mechanism in pathogenesis it is in childhood B-ALL.

Methods 1) Expressions of CD133-2 was detected by flow cytometry in newly diagnosed 38 children with B-ALL. 2) CD133-2+CD19+、CD133-2+CD19-、CD133-2-CD19+ and CD133-2-CD19- subgroup cells in 5 cases were sorted by Magnetic Activated Cell Sorting (MACS). They were cultured respectively in methylcellulose semi-solid medium (including FBS, SCF, GM-CSF, G-CSF, IL-3, IL-6 and EPO). The ability of colony forming was analysed and cells’ morphology were evaluated by Wright-Giemsa. 3) The key molecules of TGF-β signaling pathway were tested for CD133-2+CD19- cells and CD133-2-CD19+ subgroups by gene microarray kit and real-time quantitative PCR array.

Results 1) The rate of expression of CD133-2 was 60.5%. CD133-2+CD19-subgroup can differentiate into erythroid burst forming unit (BFU-E) on day 5 and other mixed colony [including erythroid colony formation unit (CFU-E), granulocyte CFU(CFU-G), macrophage CFU(CFU-M), CFU-GM ] on day 7. The colony numbers of CD133-2+CD19- subgroup were proliferated to initial tenfold, but they cannot be found expansion after day 14. After the colony cells of CD133-2+CD19- s

ubgroup were tested for morphology by Wright-Giemsa, they were found to include erythrocytes, granulocytes and macrophages. Other three subgroups didn’t form colony (P<0.001).

2) Compared to the CD133-2-CD19+, formation of CD133-2+CD19- subgroup in patients with B-ALL at diagnosis was related with upregulation of DCN, IGFBP3, THBS1,

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标签：细胞集落儿童亚群分子

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