一种基于花菁染料结构的非重原子光敏剂及其合成方法与应用

1.本发明涉及光动力疗法光敏剂技术领域，尤其涉及一种基于花菁染料结构的非重原子光敏剂及其合成方法与应用。

背景技术：

2.本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.目前结肠癌已成为第三大流行癌症，死亡率排名第五，在世界各国均列为威胁人体健康的主要死因。与化学疗法、手术疗法和放射疗法等其他传统临床疗法相比，光动力疗法(pdt)因其无创、光控制选择性、出的时间可控性、可忽略的耐药性和副作用小而备受关注。
4.近年来，将重原子掺入光敏剂结构改造的分子设计策略越来越普遍，而这些光敏剂普遍存在暗毒性升高和重金属消耗成本高的缺点。通过硫取代用硫原子取代传统羰基荧光团中的氧原子，被称为“无重原子光敏剂”，是一种越来越有前途的设计策略。然而，这些光敏剂的光化学特性对临床至关重要，一些光敏剂的有限激发波长范围明显不适合用于临床诊疗。因此，本发明认为需要重新考虑光敏剂的分子设计，以实现基于硫代羰基光敏剂的有效癌症。

技术实现要素：

5.针对上述的问题，本发明提供一种基于花菁染料结构的非重原子光敏剂及其合成方法与应用，通过揭示该非重原子光敏剂在光照射下的机制，其显示出了突出的光动力疗法效果，最大限度地发挥了光疗法抑制肿瘤生长的优势。为实现上述目的，本发明公开如下的技术方案：
6.在本发明的第一方面，提供一种基于花菁染料结构的非重原子光敏剂，其化学结构式如式1所示：
[0007][0008]
进一步地，所述基于花菁染料结构的非重原子光敏剂为蓝绿固体，命名为：2-(e)-2-(e)-2-巯基-3-(z)-2-(1，1，3-三甲基-1，3-二氢-2h-苯并[e]吲哚-2-亚基)乙烯基环己基-1-烯-1-乙烯基)-1，1，3-三甲基-1h-苯并[e]吲哚-3-铵，简称为cy581。
[0009]
在本发明的第二方面，提供一种基于花菁染料结构的非重原子光敏剂的合成工艺，包括如下步骤：将含有2-[2-[2-氯-3-[2-(1，3-二氢-1，1，3-三甲基-2h-苯[e]-吲哚乙基二烯]-1-环己烯]-乙烯]-1，1，3-三甲基-1h-苯[e]吲哚高氯酸盐(简称为ir-813高氯盐酸)和硫化盐的溶液进行回流，待反应完成后分离出反应产物中的目标产物，即得。
[0010]
进一步地，以n，n-二甲基甲酰胺(dmf)、二氯甲烷等有机溶剂中的任一种作为所述r-813高氯盐酸和硫化盐的共同溶剂，以使上述两种反应原料共同溶解。
[0011]
进一步地，所述硫化盐包括：硫化钠、硫化钾、硫化锌、硫化镁、硫化亚铁等中的至少一种。
[0012]
进一步地，所述ir-813高氯盐酸与硫化盐的摩尔比为1:1.2～1.4。
[0013]
进一步地，所述回流反应的时间为10～12小时。反应类型为亲核取代反应。
[0014]
进一步地，所述反应完成后，先用二氯甲烷和盐水的混合溶液对反应产物进行萃取，然后纯化萃取出来的粗目标产物，将该粗目标产物进一步纯化后即得目标产物。
[0015]
进一步地，所述该粗目标产物的纯化采用液相谱分离技术、柱谱分离技术等中的任意一种实现。
[0016]
在本发明的第三方面，公开所述基于花菁染料结构的非重原子光敏剂在医药、生物等领域中的应用；优选为用于癌症细胞及肿瘤的光动力。
[0017]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0018]
(1)本发明的基于花菁染料结构的非重原子光敏剂以经过改造的花菁染料为荧光基团，使得所述非重原子光敏剂的发射波长处于近红外区，有较小的荧光背景干扰，从而具有良好的荧光成像效果。
[0019]
(2)本发明的光敏剂是非重原子光敏剂，有效地改善了传统重原子光敏剂所带来的暗毒性升高和重金属消耗成本高等缺点。
[0020]
(3)由于分子结构中的硫取代传统的氧原子，有效地促进系统间交叉(isc)，导致本发明的基于花菁染料结构的非重原子光敏剂产生单线态氧的能力高，试验显示，在乙醇溶剂中，所述基于花菁染料结构的非重原子光敏剂的单线态氧产生效率为0.93，而商用光敏剂亚甲基蓝在乙醇中单线态氧产生效率仅为0.52。
[0021]
(4)本发明的基于花菁染料结构的非重原子光敏剂应用于肿瘤细胞中的光动力实验，有助于进一步推动光敏剂在生命体微环境中作用的探究。而且由于该非重原子光敏剂长波长在近红外部分，对生物活体危害小。该光敏剂在808nm特定光下能够产生更多的用于肿瘤单线态氧，最大限度地发挥了光疗法抑制肿瘤生长的优势。
附图说明
[0022]
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0023]
图1是本发明第一实施例合成的光敏剂cy581的质谱图。
[0024]
图2是本发明第一实施例合成的光敏剂cy581的核磁h谱。
[0025]
图3是本发明第一实施例合成的光敏剂cy581的核磁c谱。
[0026]
图4是本发明第二实施例合成的光敏剂cy581的荧光和紫外图谱。
[0027]
图5是本发明第二实施例中商用单线态氧检测探针1，3-二苯基异苯并呋喃(dpbf)化学结构式及商用光敏剂亚甲基蓝在150秒内产生单线态氧能力检测图谱。
[0028]
图6是本发明第二实施例合成的光敏剂cy581产生单线态氧能力检测的紫外吸收图谱。
[0029]
图7是本发明第二实施例合成的光敏剂cy581在不同溶剂(乙醇、乙腈、甲苯、甲醇)中产生单线态氧能力检测的紫外吸收图谱。
[0030]
图8是本发明第三实施例合成的光敏剂cy581含量在hela细胞中的细胞毒性检测的检测图。
[0031]
图9是本发明第四实施例合成的光敏剂cy581在荧光成像中的细胞器共定位图。
[0032]
图10是本发明第三实施例合成的光敏剂cy581对hct116细胞进行光动力的图谱。
[0033]
图11是本发明第五实施例合成的光敏剂cy581对hela细胞进行光动力的图谱。
[0034]
图12是本发明第五实施例合成的光敏剂cy581在光照和黑暗条件下对hct116和hela细胞的不同含量对细胞活性的影响图谱。
具体实施方式
[0035]
在接下来的描述中进一步阐述了本发明的具体细节用于充分理解本发明。本发明中的说明书所使用的术语只是为了用于说明本发明的优点和特点，不是旨在于限制本发明。
[0036]
除非另行定义，本发明中所使用的所有专业与科学术语属于本发明的技术领域的技术人员所理解的含义相同。如无特殊说明，本发明所使用的药品或试剂均按照产品说明书使用或采用所属领域的常规使用方法。现根据说明书附图和具体实施方式对该方法作进一步说明。
[0037]
第一实施例
[0038]
一种基于花菁染料结构的非重原子光敏剂的合成，参考路线1，包括以下步骤：
[0039]
(1)将0.50毫摩尔2-[2-[2-氯-3-[2-(1，3-二氢-1，1，3-三甲基-2h-苯[e]-吲哚乙基二烯]-1-环己烯]-乙烯]-1，1，3-三甲基-1h-苯[e]吲哚高氯酸盐(简称为ir-813高氯盐酸)和0.60毫摩尔九水硫化钠溶液加入到20毫升dmf中，然后在常温下回流10小时。
[0040]
(2)应用tlc分析，反应完成后将得到的反应物用二氯甲烷和盐水的混合溶液萃取三次，取有机相减压旋蒸得到粗目标产物。
[0041]
(3)通过硅胶柱谱法(二氯甲烷/甲醇＝200:1-5:1v/v)对所述粗目标产物进行纯化，完成后得到蓝绿固体(153.10毫克，产率52.70％)，记为光敏剂cy581。
[0042][0043]
对本实施例制备的光敏剂cy581进行检测，结果如图1至图3所示，分别为：图1是本
实施例制备的光敏剂cy581的质谱图；图2是本实施例制备的光敏剂cy581的核磁h谱；图3是本实施例制备的光敏剂cy581的核磁c谱。
[0044]
其中：图1的质谱解析为：高分辨质谱(在甲醇中的阳离子模式):cy581理论分子量为581.2985；实际检测分子量为579.2735。
[0045]
图2的h谱解析为：1hnmr(500mhz，cdcl3)δ8.29(s，1h)，8.15(d，j＝8.3hz，2h)，8.09(s，2h)，7.98(d，j＝4.7hz，1h)，7.69(dd，j＝20.3，10.3hz，2h)，7.54(d，j＝7.9hz，2h)，7.33(d，j＝6.7hz，2h)，7.21(d，j＝8.5hz，1h)，5.65(d，j＝12.7hz，1h)，4.59(s，1h)，4.54(s，1h)，3.45(s，2h)，2.95(s，3h)，2.67(s，2h)，2.37(s，2h)，2.36(s，1h)，2.09(s，6h)，2.04(s，6h)，1.99(s，3h).
[0046]
图3的c谱解析为：
13
cnmr(126mhz，cdcl3)δ172.06，166.32，141.17，132.92，130.28，130.00，129.93，127.33，127.25，126.14，122.32，121.80，112.63，109.54，93.89，49.04，28.41，27.23，25.96，24.97.
[0047]
上述结果可以得到本实施例合成的光敏剂cy581结构式为：
[0048][0049]
第二实施例
[0050]
一种基于花菁染料结构的非重原子光敏剂的合成，参考路线1，包括以下步骤：
[0051]
(1)将0.50毫摩尔2-[2-[2-氯-3-[2-(1，3-二氢-1，1，3-三甲基-2h-苯[e]-吲哚乙基二烯]-1-环己烯]-乙烯]-1，1，3-三甲基-1h-苯[e]吲哚高氯酸盐(简称为ir-813高氯盐酸)和0.70毫摩尔硫化钾溶液加入到20毫升二氯甲烷中，然后在常温下回流12小时。
[0052]
(2)应用tlc分析，反应完成后将得到的反应物用二氯甲烷和盐水的混合溶液萃取三次，取有机相减压旋蒸得到粗目标产物。
[0053]
(3)通过硅胶柱谱法(二氯甲烷/甲醇＝200:1-5:1v/v)对所述粗目标产物进行纯化，完成后得到蓝绿固体(153.10毫克，产率52.70％)，记为光敏剂cy581。
[0054]
经过采用与第一实施例相同的方法测试，本实施例合成的光敏剂cy581结构式为：
[0055][0056]
性能测试：对第一实施例制备的光敏剂cy581的各项性能进行测试。
[0057]
1、光敏剂cy581产生单线态氧能力检测：
[0058]
(1)光敏剂cy581和其他化合物产生的单线态氧使用1，3-二苯基异苯并呋喃(dpbf)作为信号分子进行测量。
[0059]
(2)在乙醇中将dpbf在412nm处的吸光度调整为约1.1，将目标分子(mb和cy581)的吸光度调整为约0.3。然后将比皿分别用660nm和808nm单光照射不同时间，并立即测量吸收光谱φ
δ
。φ
δ
的计算公式如下：
[0060]
φδ
sam
＝φδ
std
(m
sam
/m
std
)(f
std
/f
sam
)；
[0061]
其中“sam”和“std”分别代表“pss”和“mb”。“m”是dpbf在415nm处吸光度变化曲线的斜率，f＝1-10-o.d
，所述o.d.为溶液在808nm处的吸光度。
[0062]
(3)分别在不同溶剂(乙醇、乙腈、甲苯、甲醇)中检测所述光敏剂cy581的产生单线态氧的能力。
[0063]
(4)以紫外吸收波长为横坐标，以吸收度为纵坐标，得到关于光敏剂产生单线态氧能力检测的图谱，结果如图4至图7所示。
[0064]
其中：图4是光敏剂cy581的紫外吸收和荧光发射图。该图表明cy581的紫外吸收特征峰是730nm；在730nm的荧光激发条件下，荧光发射峰是814nm。图5是商用单线态氧检测探针1，3-二苯基异苯并呋喃(dpbf)化学结构式及商用光敏剂亚甲基蓝在150秒内产生单线态氧能力检测图谱。该图说明商用光敏剂dpbf在150s内产生单线态氧的能力较弱，该实验目的是为了作为cy581光敏剂的单线态氧能力检测的对照组。图6是新型光敏剂cy581产生单线态氧能力检测的紫外吸收图谱。该图是为了验证cy581的单线态氧产生能力，实验数据证明，在相同时间(150s)内，该光敏剂的产生单线态氧能力要优于传统的商用光敏剂dpbf。该光敏剂图7是新型光敏剂cy581在不同溶剂(乙醇、乙腈、甲苯、甲醇)中产生单线态氧能力检测的紫外吸收图谱。该图作用是验证cy581在不同有机溶剂条件下的单线态氧产生能力。该实验结果证明了cy581在不同有机溶剂中的产生单线态氧能力较强，且稳定性较好。
[0065]
2、光敏剂cy581对海拉细胞和hct116细胞的光实验：
[0066]
在细胞培养液中加入浓度分别为0m，5m，10m，15m，30m和50m的光敏剂，在37℃，5％co2的培养箱中培养24h，将25μl，5mg/ml的4-甲基噻唑基四唑mtt加入到细胞培养液中培养4h，通过mtt比皿法来评估细胞存活率，以不加光敏剂cy581的细胞组存活率为100％。采用上述方法对所述海拉细胞和hct116细胞进行相同的处理，不同浓度光敏剂cy581加入的实验组相关数据绘制相对做柱状图，结果如图8所示，可以看出该光敏剂cy581具有较低毒性。
[0067]
3、光敏剂cy581与商用细胞器探针对海拉细胞进行共定位测试：
[0068]
(1)溶液配制：光敏剂cy581浓度为1mm的二甲基亚砜(dmso)溶液(简称为测试培养液)；线粒体荧光探针(mito-tracker red cmxros)浓度为200μm的二甲基亚砜(dmso)溶液；细胞核荧光染料(hoechst 33342)浓度为1mg/ml的超纯水(h2o)溶液；溶酶体荧光探针(lyso-tracker red)浓度为50nm的培养基溶液，即lyso-tracker red工作液，备用。
[0069]
(2)细胞培养：将复苏好的海拉细胞进行培养，培养基包含10％牛胚胎血清、1％双抗、89％dmem、在37℃，5％co2的环境中培养24h，得到长势良好的细胞；将上述培养基中培育24h的海拉细胞置入六孔板中，用包含10％牛胚胎血清、1％双抗、89％dmem的培养基、在37℃，5％co2的环境中继续培养24h，每孔接种量为2
×
105～8
×
105孔/ml，备用。
[0070]
(3)将六孔板中培育24h的海拉细胞分为三组(a组、b组、c组)，其中：所述a组海拉细胞加入2μm的所述测试培养液和200nm的所述线粒体荧光探针共孵育20min。所述b组海拉细胞使用2μm的所述测试培养液和10μg/ml的所述细胞核荧光染料共孵育20min。所述c组海拉细胞使用2μm的所述测试培养液和50nm的所述溶酶体荧光探针分别孵育20min。培养20min后，弃掉培养基，用3ml的pbs(ph＝7.4)缓冲液淋洗细胞3次，最后在六孔板中加入3ml的pbs(ph＝7.4)缓冲液，进行荧光成像(探针为红通道，激发波长488nm，收集波段630-754nm；线粒体探针为绿通道，激发波长546nm，收集波段550-630nm；细胞核探针为蓝通
道，激发波长405nm，收集波段400～500nm；溶酶体探针为绿通道，激发波长546nm，收集波段550～630nm)。
[0071]
对所述a、b、c组海拉细胞进行共聚焦激光荧光成像，得到三组细胞的共聚焦图谱，通过市售线粒体、细胞核和溶酶体探针标记细胞器，考察光敏剂cy581的靶向分布特性，结果分别如图9所示，图中比例尺为10μm，光敏剂cy581的荧光信号与市售线粒体的荧光探针信号高度重合，采用imagej软件进行共定位分析，得到两者的共定位相关系数值为0.91；而cy581与细胞核和溶酶体的共定位相关系数值为0.15和0.18，表明cy581具有良好的线粒体靶向性能，能够有效地对肿瘤细胞进行光动力。
[0072]
4、对hela细胞和hct116细胞进行光动力实验：
[0073]
(1)利用活性氧指示剂dcfh-da作为单线态氧指示剂，n-乙酰半胱氨酸(nac)作为单线态氧吸收剂。将实验分为五组，其中：第一组：只加入光敏剂cy581。第二组：只用808nm激光器照射。第三组：加入光敏剂cy581并用808nm激光器照射。第四组：加入光敏剂cy581并用808nm激光器照射，同时加入nac。第五组：加入光敏剂cy581并用808nm激光器照射并加入少量冰；
[0074]
(2)对五组细胞分别进行mtt实验，统计细胞成活率。
[0075]
(3)绘制五组实验的细胞成活率图谱。结果如图10和图11所示，可以看出该光敏剂能够在特定的808nm光照射条件下产生光动力效果，单独的光敏剂和单独的光照射均不能产生光动力效果；加入冰的目的是为了排除光热的效果，实验结果显示在冰的条件下，仍然以产生单线态氧为主要的光动力，说明cy581是通过产生单线态氧对肿瘤细胞进行光动力的。
[0076]
5、对hela细胞和hct116细胞的光动力实验中光敏剂cy581用量与光照条件的探究：
[0077]
(1)针对两种癌症细胞，分别在光照和黑暗条件下培养。
[0078]
(2)将不同浓度的光敏剂加入细胞中继续培养。
[0079]
(3)对每组细胞进行mtt实验，统计细胞成活率。
[0080]
(4)绘制hela细胞和hct116细胞的光动力实验中光敏剂cy581用量与光照条件的图谱，结果如图12所示，可以看出，随着cy581的浓度升高，光动力效果明显提升。
[0081]
以上所述仅说明了本发明的几个实施方式，并不能因此而理解是对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的其他人员来说，在不脱离本发明的构思和范围的情况下，还可进行修改替换改进等，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的专利保护范围应以所描述的权利要求为准。

技术特征：

1.一种基于花菁染料结构的非重原子光敏剂，其化学结构式如式1所示：2.根据权利要求1所述的基于花菁染料结构的非重原子光敏剂，其特征在于，所述基于花菁染料结构的非重原子光敏剂为蓝绿固体。3.权利要求1或2所述的基于花菁染料结构的非重原子光敏剂的合成工艺，其特征在于，包括如下步骤：将含有2-[2-[2-氯-3-[2-(1，3-二氢-1，1，3-三甲基-2h-苯[e]-吲哚乙基二烯]-1-环己烯]-乙烯]-1，1，3-三甲基-1h-苯[e]吲哚高氯酸盐(ir-813高氯盐酸)和硫化盐的溶液进行回流反应，完成后分离出反应产物中的目标产物，即得。4.根据权利要求3所述的基于花菁染料结构的非重原子光敏剂的合成工艺，其特征在于，以以n，n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷等有机溶剂中的任一种作为所述r-813高氯盐酸和硫化盐的共同溶剂。5.根据权利要求3所述的基于花菁染料结构的非重原子光敏剂的合成工艺，其特征在于，所述硫化盐包括：硫化钠、硫化钾、硫化锌、硫化镁、硫化亚铁中的至少一种。6.根据权利要求3所述的基于花菁染料结构的非重原子光敏剂的合成工艺，其特征在于，所述ir-813高氯盐酸与硫化盐的摩尔比为1:1.2～1.4。7.根据权利要求3所述的基于花菁染料结构的非重原子光敏剂的合成工艺，其特征在于，所述回流反应的时间为10～12小时。8.根据权利要求3-7任一项所述的基于花菁染料结构的非重原子光敏剂的合成工艺，其特征在于，所述反应完成后，先用二氯甲烷和盐水的混合溶液对反应产物进行萃取，然后纯化萃取出来的粗目标产物，将该粗目标产物进一步纯化后即得目标产物。9.根据权利要求8所述的基于花菁染料结构的非重原子光敏剂的合成工艺，其特征在于，所述该粗目标产物的纯化采用液相谱分离技术、柱谱分离技术等中的任意一种实现。10.权利要求1或2所述的基于花菁染料结构的非重原子光敏剂，或者权利要求3-9任一项所述的合成工艺制备的基于花菁染料结构的非重原子光敏剂在医药、生物任一领域中的应用。

技术总结

本发明涉及光动力疗法光敏剂技术领域，具体公开一种基于花菁染料结构的非重原子光敏剂及其合成方法与应用，所述光敏剂的化学结构式如式1所示：式1。相比于传统商业化光敏剂亚甲基蓝，本发明的非重原子光敏剂产生单线态氧能力更强。本发明的非重原子光敏剂含有经过改造的花菁染料为荧光基团，该分子的发射波长处于近红外区，具有良好的荧光成像效果，能够应用于宫颈癌Hela肿瘤细胞和结肠癌HCT116细胞的光动力，进一步推动了有机小分子在生命体微环境中作用的探究。作用的探究。作用的探究。