雌激素联合机械张力调控人牙周膜成纤维细胞成骨分化及机制研究

•6•口腔医学2021年1月第41卷第1期

雌激素联合机械张力调控人牙周膜成纤维细胞

成骨分化及机制研究

赵玺I，李向宇「，丁锐I，赵浩然「，米丛波2，吴晓琴，

［摘要］目的探究雌激素联合机械张力对人牙周膜成纤维细胞成骨分化的影响及机制。方法分离hPDLF细胞并鉴定，将hPDLF细胞分为对照组、17B-雌二醇组、机械张力组、17B-雌二醇联合机械张力组；按细胞给药和加力方案处理后，检测细胞增殖能力，茜素红染检测hPDLF细胞成骨分化,qRT-PCR检测成骨基因mRNA的表达,Western blot检测成骨蛋白、雌激素受体表达及Akt信号通路的激活。结果鉴定所提取到的hPDLF细胞符合其特征；17(3-雌二醇组和机械张力组细胞增殖能力、茜素红染0D值均显著高于对照组；雌激素受体ER-B、成骨基因RUNX2、0CN、0SX、()PN表达,Akt磷酸化水平均显著高于对照组；雌激素联合机械张力细胞增殖能力、茜素红染()1)值显著高于17»雌二醇和机械张力组单独作用组，雌激素受体ER-P、成骨基因RUNX2、0CN、0SX、()PN表达，Akt磷酸化水平均显著高于17R-雌二醇和机械张力组单独作用组。结论

雌激素联合机械张力能够促进hPDLF细胞成骨分化，并且促进雌激素受体和成骨基因的表达，以及Akt信号通路的激活。［关键词］雌激素联合机械张力；成骨分化；机制

［中图分类号］R349.5 ［文献标识码］A［文章编号］10()3-9872(2021)01-0006-06下水井盖

［doi］10.ki.kqyx.2021.01.002

Estrogen combined with mechanical tension to regulate osteogenic differentiation of human periodontal ligament fibroblasts and its mechanism

ZHAO Xi,LI Xiangyu,DING Rui,ZHAO Haoran,Ml Congbo,WU Xiaoqin.(Department of Orthodontics,Stomatological Hospital of Urumqi,Urumqi830000,China)

Abstract:Objective To investigate the effect and mechanism of estrogen combined with mechanical tension on human periodontal ligament fibroblasts.Methods hPDLF cells were sorted and identified by magnetic beads.The hPDLF cells were divided into the control group,17|3-estradiol group,mechanical tension group and17p-estradiol combined with mechanical tension group.Cell proliferation was measured；alizarin red staining was used to detect osteogenic differentiation of hPDLF cells.qRT-PCR was used to detect osteogenic gene mRNA expression,and Westem blot was used to detect osteogenic protein,estrogen receptor expression,and activation of Akt signaling pathway.Results It was identified that the extracted hPDLF cells conformt*(l to its characteristics.The cell proliferation ability and OD-value of alizarin red staining in the17p-estradiol and mechanical tensi

on groups were significantly higher than those in the control group.The estrogen receptor ER-p and osteogenic genes RUNX2,OCN,OSX,OPN expression,Akt phosphorylation level were significantly higher than those of control group.Estrogen combined with mechanical tension cell proliferation ability,alizarin red staining OD value was significantly higher than the17p-estradiol and mechanical tension group.The expression of estrogen receptor ER-p, osteogenic genes RUNX2,OCN,OSX,OPN,Akt phosphoiylation level were significantly higher than those of173~estradiol and mechanical tension group.Conclusion Estrogen combined with mechanical tension can promote osteogenic differentiation of hPDLF cells,and promote the expression of estrogen receptors and osteogenic genes,as well as the activation of Akt signaling pathway.

Key words:estrogen combined with mechanical tension；osteogenic differentiation；mechanism

Stomatology,2021,41(1)：6-11

人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,hPDLF)是一个异质性细胞，参与牙周组织的改建和再生,hPDLF细胞在特定的

基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金(2017D01A18)

作者单位：1乌鲁木齐市口腔医院正畸科，新疆乌鲁木齐(830000)；2新疆医科大学第一附属医院口腔正畸科，新疆乌鲁木齐(830054)；3新疆医科大学基础医学院病理生理学科，新疆乌鲁木齐(830011)

通信作者：米丛波E-mail：刺激下，能够促进其向成骨细胞分化，参与组织的修复和牙槽骨的改建：'-4：0亦有研究表明⑸，雌激素与其受体结合后能够促进牙周膜成纤维细胞在骨重建过程中核因子k B受体活化子配体及骨保护素的表达，进而影响牙槽骨的重建。正畸时机械力作用于牙齿通过牙周膜传递至牙槽骨，继而牙槽骨发生生物改建，包含了成骨细胞和破骨细胞的分化成熟°F，所以，本文即探究联合使用雌激素和机械

赵玺，等.雌激素联合机械张力调控人牙周膜成纤维细胞成骨分化及机制研究•7•

能否影响hPDLF细胞的成骨分化及机制。

1材料与方法

1.1材料

a-MEM培养基（美国Gibco公司）；17（3-雌二醇（美国Sigma公司）；cDNA合成试剂盒、qPCR检测试剂盒（南京福麦斯生物技术有限公司）；酶标仪（美国BioTek公司）；实时定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；茜素红染液（沈阳万类生物技术有限公司）；骨钙素（osteocalcin,OC

N）、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、0雌激素受体（Estrogen Receptor-P,ER-p）、蛋白激酶B（protein kinases, Akt）、p-蛋白激酶B（p-protein kinases,p-Akt）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）—抗，山羊抗兔二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）,FX-5000T应力加载系统（购自美国FlexCell公司）。

1.2人牙周膜成纤维细胞的分离与鉴定

收集健康正畸患者的健康前磨牙6颗，患者年龄18-25岁，征得患者的知情同意。取得患者前磨牙样本后迅速转移至无菌的超净工作台中，用无菌的PBS溶液冲洗3次，然后用无菌手术刀片刮取根中1/3区域的牙周膜组织，将组织转移至a-MEM培养基中，使用无菌眼科剪将组织剪成1mm」，研磨均匀，将牙周膜组织碎块均匀放置在6孔板中，加入含10%胎牛血清的a-MEM培养基，于37°C,5%CO2培养箱中培养，隔天更换培养基，细胞生长至汇合率达80%时，使用0.25%的胰蛋白酶消化，传代。提取细胞蛋白,Western blot检测牙周膜成纤维细胞标志蛋白波形丝蛋白（Vimentin）和细胞角蛋白（CK）的表达。

1.3细胞给药及细胞加力

将分离的hPDLFs接种于6孔板中，分别加入170-雌二醇使其终浓度为0、lxlO-e、1x10"、lx 10_\1x10-7,1x10"6,1x10_5mol/L，共孵育24h后，使用MTT法检测雌激素对牙周膜成纤维细胞增殖能力的影响，

以确定最佳给药浓度，

根据参考文献[7]，设置细胞加力条件为：将细胞消化后，以1x10*个/L分别接种于加力用细胞培养板中1/3部分，每板接种1mL细胞悬液（即lx IO：个/板），置于37七恒温孵箱中培养。使用FX-5000T应力加载系统分别刺激细胞12h，振幅10%、频率0.5Hz，每个循环中松弛和拉伸时间各1s，按照上述处理方式，设置细胞分组为对照组、17p-雌二醇组、机械张力组、17卩-雌二醇组联合机械张力组。1.4MTT法检测细胞增殖

取处理后的hPDLF细胞以4x心个/孔接种于96孔板，每孔200（1L，每组5个复孔，培养24h后每孔加MTT溶液20|±L，继续培养4h，去除孔内的MTT溶液，每孔加DMSO200|jl L，酶标仪490nm处测定各孔的光密度值（0D值）,0D值越大，细胞增殖能力越强。

1-5茜素红染检测hPDLF细胞成骨分化

配制成骨诱导液（10mmol/L0-甘油磷酸钠,50 mg/L维生素C,10nmol/L地塞米松，10%胎牛血清,a-MEM培养基），分别设置为对照组（成骨诱导液）、诱导17B-雌二醇组（成骨诱导液，lxl0「7mol/L 170-雌二醇）、诱导机械张力组（成骨诱导液，机械张力）、诱导170-雌二醇+机械张力组（成骨诱导液，lxWVol/L17（3-雌二醇、机械张力），培养细胞21 d，去除培养基后使用4%多聚甲醛溶液固定20 min，加入茜素红染液,37七孵育15min，弃茜素红染液加入200jjl L10%氯化十六烷基卩比睫溶解1h，

收集染液，分光光度计590nm处检测光密度值（0D）。

1.6qRT-PCR检测成骨基因mRNA的表达

取各组处理后的hPDLF细胞，消化细胞至离心管中，加入Trizol裂解5min，取上述细胞裂解液加入200jjl L氯仿，静置5min后，于12000x g,4弋离心15min，转移上层水相，加入500jxL异丙醇，12000x g,4七离心10min，去上清，1mL75%乙醇清洗RNA沉淀后，20p,L RNA-free水重悬RNA沉淀,55T水浴10min，即为总RNA，使用核酸定量仪检测总RNA含量。根据cDNA Synthesis试剂盒指示配置反应体系，将提取的hPDLF细胞RNA逆转为cDNA，然后利用核酸定量仪对cDNA进行定量。然后根据qPCR试剂盒指示配置反应体系，进行qPCR反应，采用GAPDH作为内参，反应后采用法计算基因表达水平。引物序列见表1。

1.7Western blot

取各组hPDLF细胞1x106个于离心管中，每管中加入500“L的RIPA蛋白裂解液和5“L的苯（phenvlmethylsulfonyl fluoride,PMSF）蛋白酶抑制剂，于冰上充分裂解30min，裂解液12000 r/min,4°C离心10min，取上清，即为细胞总蛋白。BCA蛋白定量后，各组蛋白加入上样缓冲液后，沸水浴加热变性，然后进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，用5%的脱脂牛奶对偏氟乙烯（polyvinglidene fluoride,PVDF）膜封闭2h，然后以1：1000比例稀释后的成骨相关蛋白OCN、OPN—抗,ER-0、Akt

、p-

• 8 •口腔医学2021年1月第41卷第1期

表 1 RUNX2、OCN 、OSX 、OPN 、GAPDH 弓I 物序歹U

Tab.l RUNX2, OCN, OSX, OPN, GAPDH

primer sequences

名称

引物序列(5=3，)

RLNX25,-CGCArrCCTCATCCCA （；TAT-3,5/-AGG （；GTAAGACTGGTCATAGGA-3,

OCN 5,-GAAGTTTC （；CAGACCTGACAT-3,5,-GTATGCACCATTCAACTCCTCG-3,

OSX 5,-GCCAGAAGCT （；TGAAACCTC-3,

5'-GCTGCAAGCTCTCCATAACC-3'

OPN

5,-CCAAAGGCTrCTTCTT （；CTG-3,5,-CCACCAAATGTGAAGACGTG-3,GAPDH

5,-GGTGGTCTCCTCTGACTr （：AACA-3,

Akt .GAPDH 一抗4七孵育过夜，TBST 洗膜后二抗室温孵育1.5 h，再用TBST 洗膜后按照ECL 试剂盒

说明书配置发光液.并将PVDF 膜浸入发光液中反

获取信息的方法应半分钟，曝光并拍照，用Image J 软件对曝光结果

进行定量分析。

1.8统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，所有数据多组间差异进行单因素方差分析，行双侧检测，P<

0.05为差异具有统计学意义。2结果

2.1 hPDLF 细胞鉴定结果

为鉴定提取到的hPDLF 细胞，首先在显微镜下

拍照观察细胞形态，如图1A 所示，所分离的hPDLF 细胞形态呈长梭形，细胞核呈圆形状态，细胞长满瓶

底后呈旋涡状，符合hPDLF 细胞的形态特征；

Western blot 鉴定hPDLF 细胞标志蛋白结果(图

1B)显示，所分离的hPDLF 细胞表达Vimentin 和 CK，证明本文从牙组织中提取到了 hPDLF 细胞，可

用于后续研究。

F R F R F R F hPDLF 细胞鉴定结果

Results of hPDLF cell identification

A ： hPDLF 细胞形态结构；

B : Western blot 检测Vimentin 和CK 表达

图1

Fig.l

2.2 17B-雌二醇对hPDLF 细胞增殖能力的影响为了验证170-雌二醇对hPDLF 细胞增殖能力

的影响，分别用 lxl0-9、lxl()7、1x10"mol/L 17^- 雌二醇处理hPDLF 细胞，并设置0 mol/L 组作为空

白对照,MTT 检测结果(图2)显示,1x10 10 JxlO _\ lxlO'\lxlO'7 JxlO -6 Jxl0_5mol/L 17R-雌二醇处

理hPDLF 细胞后，各组hPDLF 细胞的OD 值均显著高于对照组,1 x 10" JxlO -6 Jx 10“mol/L 170-雌二

醇组细胞0D 值最大，细胞增殖能力最强，且给药浓

度超过1x10" mol/L 时，OD 值无显著增加，所以选

择1x10" mol/L 作为给药浓度，进行后续实验。2.3雌激素联合机械张力促进hPDLF 细胞的增殖能力

为了探究雌激素联合机械张力对hPDLF 细胞

增殖能力的影响，将hPDLF 细胞分别经过1x10-7 mol/L 的17B-雌二醇、机械张力以及二者联合处理

后，MTT 检测增殖能力结果(图3)显示，17(3-雌二醇、机械张力处理hPDLF 细胞后，细胞的增殖能力

均显著高于空白对照组(P<0.05)，而雌激素联合机

械张力组细胞增殖能力高于17p-雌二醇和机械张*** *** ♦♦♦

C30mol/L 17P-雌.醇C31 xlO-,0mol/L 17»雌：醇E3I x|0-9mol/L 17»雌：醇■ 1 x|0'8moI/L 17»雌：醇

■ 1 xIO ’mol/L 17卩-雌：醇■ 1 xl0Anol/L 17»雌二醇■ 1 xlZmol/L 17»雌二醇

组别

与 0 mol/L 170-雌二醇组相比，* :P<0.05, ** :P<0.01, * * * ：P<

（）.001

图2 MTT 法检测17(3-雌二醇对hPDLF 细胞增殖

能力的影响

Fig.2 MTT method was used to detect the effect of

17 p-estradiol on the proliferation of hPDLF cells

力单独诱导组(P<0.001)，说明雌激素联合机械张力能够显著促进hPDLF 细胞的增殖能力。

2.4 雌激素联合机械张力促进hPDLF 细胞成骨基因的表达

为了探究雌激素联合机械张力对hPDLF 细胞

成骨分化的影响，本文将hPDLF 细胞经过雌激素和

机械张力的刺激后，检测成骨相关基因的表达,

qPCR

赵玺，等.雌激素联合机械张力调控人牙周膜成纤维细胞成骨分化及机制研究

• 9・

(UIU

寸Q

■对照组C3 17 B 一雌二醇组

=■机械张力组

!=□ 17 & 一雌二醇+机械张力组

显者促进hPDLF 细胞的成骨分化

(

06SQO

.5.0.5.0

2.2.L L ■对照组

aaa ###

***

CD 17 雌二醇组

=机械张力组

匚3 17 B 雌二醇+机械张力组

组别结晶器铜管

与对照组相比，* :P<0.05, *** :PvO.OOl ；与170-雌二醇组相比，#

##：P<0.001；与机械张力组相比,aaa ：P<0.001

图3 MTT 法检测雌激素联合机械张力对hPDLF 细胞

增殖能力的影响

Fig.3 MTT method was used to detect the effect

of estrogen combined with mechanical tension on the proliferation ability of hPDLF cells

结果（图4）显示，17卩-雌二醇和机械张力单独作用

组hPDLF 细胞成骨相关基因RUNX2、OCN 、OSX 、

OPN 表达显著高于对照组（P<0.05），而170-雌二

醇联合机械张力组细胞中RUNX2、OCN 、OSX 、OPN

表达显著高于17|3-雌二醇和机械张力单独作用（P< 0.01），说明雌激素联合机械张力促进hPDLF 细胞的成骨分化。

|对照组

4尸雌二醇+机械张力组…

鬻

aaa «岀棗英«

U117B 雌二醇组

■机械张力组

###

*** T

3-2-as # *» **

iii a #*ill *

♦1

**||

滚轮片**

II a #*■nil

#♦

RUNX2

1OCN

OSX OPN

成骨基因

与对照组相比，* :P<0.05, ** :P<0.01, *** :P<0.001；与 17B-雌二醇组相比,##：P<0.01 ,###：P<0.001 ；与机械张力组相比，aa ：P<

0.01, aaa ：P<0.001

图4 qPCR 检测雌激素联合机械张力促进hPDLF

细胞对成骨基因的表达的影响

Fig.4 qPCR detection of the effect of estrogen combined with mechanical tension to promote hPDLF

cells on the expression of osteogenic genes

2.5 雌激素联合机械张力促进hPDLF 细胞成骨分化

茜素红染检测雌激素和机械张力对hPDLF

细胞成骨分化的影响，结果（图5）显示，17/雌二醇和机械张力单独作用组hPDLF 细胞茜素红0D 值

显著高于对照组（P<0.01）；17，雌二醇联合机械张

力组茜素红0D 值显著高于17（3-雌二醇和械张力单

独作用组（P<0.001 ）；说明雌激素联合机械张力可

0.5

彳

o.o-LJ^^—I I I

组别

与对照组相比,** :P<0.01, *** :PvO.OOl ；与17B ■雌二醇组相比,

###: P<0.001 ；与机械张力组相比，aaa : PvO.OO 1

图5茜素红染检测雌激素和机械张力对hPDLF

细胞成骨分化的影响

Fig.5 Alizarin red staining was used to detect the

effect of estrogen and mechanical tension on osteogenic differentiation of hPDLF cells

2.6雌激素联合机械张力促进成骨相关蛋白OCN 、

OPN 表达及ER-p 表达

Western blot 检测结果（图6）显示，经过17卩-雌

二醇和机械张力作用后，成骨相关蛋白OCN.OPN 表达显著增加（P<0.01），雌激素受体ER-P 表达显著增加（P<0.05） ,17（5-雌二醇和机械张力联合作用

后，hPDLF 细胞中OCN 、OPN 表达显著增加（P<

0.001） ,ER-P 表达亦显著增加（P<0.001），说明雌

激素联合机械张力能够促进hPDLF 细胞成骨分化,

及上调雌激素受体ER-p 的表达。

2.7 雌激素联合机械张力促进Akt 信号通路的激活

Western blot 检测结果（图7 ）显示，相比于对照

组，17，雌二醇组、机械张力组hPDLF 细胞p-Akt 磷

酸化水平显著增加（P<0.01）；而17（3-雌二醇组+机械张力组hPDLF 细胞p-Akt 磷酸化水平均显著高

于170-雌二醇组和机械张力组（P<0.001），说明雌激素联合机械张力能够显著促进Akt 信号通路的

激活。3讨论

hPDLF 细胞是牙周膜中的主要细胞，在牙周疾病、正畸等中,hPDLF 的成骨分化功能发挥关

键作用：刃。已有研究表明，雌激素可影响hPDLF 细胞的增殖活性，促进其成骨分化以及骨重建；回。同

时,hPDLF 细胞是一种对应力敏感的细胞，受到机械应力后，将力学信号转变为生化或生理信号，细胞骨架蛋白是最直接的外力感受器，调节受体的信号

转导［10-'4 o 在正畸中，机械张力发挥主要的治疗作用，研究表明，在机械张力作用下，hPDLF

细胞

・10 •

口腔医学2021年1月第41卷第1期

■对照组

=机械张力组

a 17

b -雌二醇组

树脂抛光轮

= 17 雌二醇+机械张力组

###

******

♦ ♦♦

aaa aaa ### ***

***

***:*

白

—

OP 蛋Q H

R E .0.5.0.5.0Z 1.1.@

瞩放聚友«

与对照组相比,* :PV0.05, ** :P<0.01, *** :PcO.OOl ；与 170-雌二醇组相比,###：P<0.001；与机械张力组相比,aaa ：P<0.001）

图6 Western hlot 检测雌激素联合机械张力对OCN 、OPN 、ER-[B 表达的影响

Fig.6 Western blot was used to detect the effect of estrogen combined with mechanical tension

on the expression of OCN, OPN , ER-p

.0.5

2.1

aaa "对照组

博E=J 机械张力组

信号通路

的<；夜®

与对照组相比,** :PvO.Ol, *** :PvO.OOl ；与17（3-雌二醇组相比，###：P<0.001；与机械张力组相比,aaa ：P<0.001）

图7 Western blot 检测雌激素联合机械张力对Akt 信号通路的影响

Fig.7 Western blot was used to detect the effect of estrogen combined with mechanical tensi

on the Akt signaling pathway

具有最佳的增长活力本研究就主要探究了在雌激素和机械张力的联合作用下,hPDLF 成骨分化

的变化及机制。

本研究发现，雌激素联合机械张力诱导后，

hPDLF 细胞的增殖能力显著高于雌激素单独作用和机械张力单独作用组细胞的增殖能力，并且茜素

红染结果显示，雌激素联合机械张力诱导后

hPDLF 细胞的成骨分化水平亦显著增加，说明雌激

素联合机械张力能够促进hPDLF 细胞的成骨分化，提示雌激素联合机械张力或许可以用于口腔疾病的，以提咼效果。

接下来，本文即探究了其发挥促成骨分化的作用的机制.RUNX2、OCN 、OPN 、OSX 是 hPDLF 细胞

成骨分化的标志蛋白，可作为评价hPDLF 细胞成骨分化的标志物，本研究发现.雌激素联合机械张力诱导hPDLF 细胞后RUNX2、OCN 、OPN 、OSX 表达显著增加，说明雌激素联合机械张力可促进成骨分化相

关基因的表达而发挥促分化的作用，并且雌激素联

合机械张力诱导后雌激素受体ER-p 表达亦增加,

说明二者联合使用可通过上调ER-p 表达而促进雌激素发挥功能。

PI3K/Akt 信号通路的激活是通过Akt 的磷酸

化实现，活化的Akt 通过磷酸化作用激活或抑制其

下游一系列底物，从而调节细胞的增殖、分化、凋亡

以及迁移等[l6-'8]o 并且已经有研究表明，rhBMP9

作用于hPDLF 后可通影响PI3K/AKT 信号通路而调控成骨分化US ，所以本文亦研究了雌激素联合机械张力对hPDLF 细胞PI3K/Akt 信号通路的影

rat组合

响，结果显示，激素联合机械张力能够显著激活

PI3K/Akt 信号通路。

综上所述，雌激素联合机械张力能够促进

hPDLF 细胞的成骨分化，上调成骨相关基因的表

达，上调雌激素受体ER-P 表达，以及激活PI3K/Akt 信号通路，

但其精细机制及临床应用还需进一步

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