Vol.37，No.1，2022
中国造纸学报Transactions of China Pulp and Paper
王燕燕
赵梦醒
刘廷志
（天津科技大学天津市制浆造纸重点实验室，天津，300457）
摘
要：以塔尔油为化感物质，研究了塔尔油对蛋白核小球藻的抑藻效果，并对其机理进行了初步探究。研究结果表明，150和 100mg/L 的塔尔油可有效控制蛋白核小球藻的生长繁殖，抑藻率超过80%，最高可达88%。在塔尔油的作用下，蛋白核小球藻的过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活力均出现升高现象，高于对照组4倍以上，藻细
胞的叶绿素A 含量直线下降。塔尔油的作用可使藻细胞外观出现凹陷，甚至破裂。与对照组相比，加入塔尔油的实验组Zeta 电位绝对值最高下降56%，藻细胞发生絮聚趋势增大。塔尔油可使藻液颗粒粒径分布范围变大，小于正常细胞的碎片含量增加，大于正常细胞粒径分布的藻细胞絮聚团增加，使藻液颗粒平均粒径比对照组增大了25%。加入塔尔油的实验组中，死亡细胞的比例显著增大，从对照组的9.7%分别增至62.8%（100mg/L 实验组）和75.7%（150mg/L 实验组）。 关键词：塔尔油；化感抑藻；蛋白核小球藻；抗氧化酶；粒径中图分类号：TS79
文献标识码：A
DOI ：10.11981/j.issn.1000⁃6842.2022.01.65
淡水水域藻类大量繁殖导致河流湖水等颜变化的现象被称为“水华”，海水的这种现象被称为“赤
潮”
［1］
。水体富营养化可引起浮游植物迅速增殖，使水中溶解氧量下降，水生生物大量死亡。目前，控制
“水华”的方式虽然有很多，如物理法、化学法和生物法等，但将其大规模应用时均存在操作难度较大、成本较高、破坏水体生态系统且不能从根本上解决水体富营养化的问题。化感作用和化感抑藻的研究为“水华”藻的治理提供了一个新思路，已逐渐被人们广泛认识和接受［2］。近年来，化感作用被广泛应用于藻类控制研究中，并取得较好的效果，但化感物质来源和提取过程中产生的大量剩余物问题越来越被广泛关注。低成本、高效、安全、环境友好的化感物质来源成为人们研究的重点［3］。
化感物质的种类很多，可将其分成五大类：芳香族、脂肪族、类萜、含氧杂环和含氮化合物，这些物质大都对藻类具有化感作用［4］。不同种类和来源的化感物质对藻类的抑制作用不同，多数研究者认为，化感物质主要使叶绿素A 含量减少，影响细胞的光合产物，并通过改变抗氧化酶活性，损害细胞膜内的超微结构，使藻细胞受到破坏，最终影响藻类的生长。此外，有些化感物质还会损坏藻类细胞结构，导致细胞解体［5］。来源于陆生大型植物的化感物质因其抑藻效
果显著、来源广泛、生物安全性好等特点成为近年来的研究热点。塔尔油作为一种松木硫酸盐法制浆过程中产生的副产物，其产量大且来源稳定。塔尔油中含有脂肪酸、萜类及甾类等化学物质［6-7］，这些物质与植物的化感物质具有相似性，因此通过研究塔尔油对藻类的抑藻控藻效果，不仅能够开辟一种全新的陆生植物化感物质来源，还可提高制浆造纸副产物的经济价值，符合生物质精炼的概念，具有深远的经济及环境效益。1实强电井
验1.1
实验材料
蛋白核小球藻（FACHB -29）：采用SE 培养基培养，光照强度为（4000±100）lx ，温度为（25±1）℃，光暗比为12h ∶12h 恒温光照培育，每天定时摇瓶2~
3次，至对数生长期将其接种后用于抑藻研究。塔尔
油购自美国劳特公司。1.2实验方法1.2.1
蛋白核小球藻的抑藻效果研究
将蛋白核小球藻用SE 培养液培育到对数生长期，作为藻种应用，接种10%。将塔尔油用二甲基亚砜（DMSO ）溶解并适当稀释，将不同浓度梯度的塔尔油溶液添加到接种好的蛋白核小球藻的培养基中，每个
研究论文
收稿日期：2020⁃11⁃18
作者简介：王燕燕，女；1995年生；硕士；主要研究方向：清洁生产技术；E -mail ：183**** 。
65
样品中加入的塔尔油体积相同，为300µL （150mL 培养液），并控制塔尔油浓度分别为100和150mg/L ，对照组中只加入300µL DMSO ，然后进行培养并定期取样检测。
采用血球计数板测定藻细胞密度，通过与对照组对比计算抑藻率。藻液吸光度和除藻后吸光度分别通过测定508、285nm 处吸光度进行计算，采用0.45
µm 的膜过滤去除藻细胞。1.2.2
塔尔油对蛋白核小球藻的抑藻机理研究
叶绿素A 含量的测定：超声波辅助热乙醇提取叶绿素A 并进行测定
［8］
。烷基叔丁基醚
藻蛋白、过氧化氢酶（CAT ）、超氧化物歧化酶（SOD ）活力测定参照文献［9］进行。
藻液Zeta 电位和粒径采用Zeta 电位仪（FPA ，德国AFG ）、激光粒度仪（LS13320，美国Beckman
Coulter ）进行测定。
采用SYBR green Ⅰ（SYBR ）和碘化丙啶（PI ）
双染上流式细胞仪（CyFlow Cube6，德国Partec ）检测藻细胞的存活率［10］
。
2
结果与讨论
2.1塔尔油对蛋白核小球藻抑制效果研究2.1.1
塔尔油对蛋白核小球藻藻细胞密度的影响
在接种好的蛋白核小球藻液中加入浓度分别为
100及150mg/L 的塔尔油（实验组），以研究塔尔油对蛋白核小球藻细胞（以下简称藻细胞）生长的影响，
结果如图1所示。
从图1可以看出，对照组藻细胞密度随培养时间的延长逐渐升高，呈现为正常的S 型曲线。而2个实验组中，藻细胞生长曲线与对照组完全不同，100、
150mg/L 实验组藻细胞密度在培养前期基本没有较大变化，藻细胞增殖不显著，第5天之后，实验组藻细胞密度呈缓慢上升趋势，但始终比对照组的藻细胞密度低很多。实验组藻细胞密度远低于对照组，说明塔尔油对藻细胞的生长确实起到了抑制作用。在第5~6天，对照组藻细胞密度出现平台期，而后开始快速增大，按照正常生长规律，第6天后的藻细胞密度快速增大应该与进入衰退期藻细胞的死亡和碎解有关，分解产生的碎片干扰了血球计数。李丽娟［11］在研究杨木APMP 制浆废水中化感物质对蛋白核小球藻的抑制作用时也发现，添加化感物质对前期藻细胞生长的抑制作用非常明显，然而后期也出现增长趋势。Nakai 等［12］在研究植物浸提液对铜绿微囊藻的抑制作用时也发现，在浸
提液投加8天后其抑藻作用减弱，这与本研究得到的结果类似，推测应该是与藻细胞密度计数手段有关。
从图1还可以看出，在藻细胞培养前2天，塔尔油有一定抑藻作用，但并不是很明显，这是因为正常藻细胞生长在接种后也有一个平台缓冲期，接入的藻种需要一段时间适应，繁殖相对较慢，因此加入和不加入抑藻物质差异并不显著。到第3天后，藻细胞进入快速增殖阶段，塔尔油对藻细胞的抑制作用开始表现出来，抑藻率达到80%左右，后期随着时间的延长，塔尔油对藻细胞的抑制作用始终维持在较高的水平，塔尔油浓度为100mg/L 时的抑藻率最高达到
88%。吴湘等［13］在研究黄花水龙化感物质对铜绿微囊藻的作用效果时发现，当添加75~150mg/L 化感物质时，其抑藻率达80%以上，即认为黄花水龙化感物质具有较好的抑藻效果，本研究的化感物质浓度及抑藻效果与前人研究结果基本相当。
2.1.2塔尔油对蛋白核小球藻液吸光度的影响
藻液吸光度是藻类生长的一个主要参数指标，藻液吸光度主要与藻细胞密度有关，可用以确定藻类生长速度。在培养后期，藻液吸光度除与藻细胞密度有关外，还与培养液中溶解的叶绿素等素含量相关。除藻细胞外，藻液吸光度主要由溶解性度物质贡
献，与藻细胞生长健康状态直接相关，健康细胞很少向培养液中释放有物质。图2所示为塔尔油对蛋白核小球藻液（以下简称藻液）过膜除藻前后吸光度的影响。
从图2（a ）可以看出，除第4天略有波动外，对照组的藻液吸光度整体呈持续升高趋势，这是由于健康细胞藻液吸光度与藻细胞密度相关，藻细胞密度不断增大表现为藻液吸光度不断提高，众多研究证明藻液
时间/d
藻细胞密度/106 m L −1
图1塔尔油对藻细胞密度的影响
Fig.1
Effect of tall oil on algae cell density
吸光度值与藻细胞密度值具有较好的相关性，可用以衡量藻类的生物量［14-16］。图2
（a ）中，塔尔油浓度为100和150mg/L 实验组藻液的吸光度值从第1天开始
即出现剧烈升高趋势，随后吸光度值提高速度逐渐放缓。仅靠藻细胞的生长繁殖，不可能使藻液吸光度急剧升高，同时对照组也显示正常生长的藻细胞不可能使藻液吸光度出现此种趋势。
图2（b ）中，过膜除藻后对照组吸光度前期一直很低，这是因为在正常生长状态下，藻细胞比较健康，很少向培养液中释放有物质，而第6天之后，过膜除藻后藻液吸光度却迅速升高，这主要是因为随着培养时间延长，大部分藻细胞进入衰退期，藻细胞死亡比例增加，细胞内有物质被释放出来，使得吸光度升高。而图2（b ）中，过膜除藻后实验组的藻液吸光度从加入塔尔油后即急剧升高，24h 内达到最高值，然后降低，后又呈缓慢波动升高趋势。这可能是因为塔尔油的加入影响了藻细胞的健康状态，导致藻细胞结构遭到破坏或藻细胞死亡，藻细胞内的有物质大量溶出，从而使藻液吸光度升高。刘光涛等［17］采用高剂量壬酸对铜绿微囊藻和混合培养藻类进行处理，随后分别对2种藻液的光密度值进行测定；结果显示，其藻液光密度值在早期也出现了急剧升高现象，研究者认为是壬酸致使藻类死亡，其残余物干扰了测定结果。
从塔尔油对藻细胞密度和藻液吸光度的影响可以看出，塔尔油的确具有显著的抑藻效果。2.2塔尔油对蛋白核小球藻的抑藻机理研究2.2.1塔尔油对蛋白核小球藻叶绿素A 含量的影响
藻细胞中的叶绿素A 含量通常可以反映藻细胞的生长和光合作用状态［18］。图3显示了加入塔尔油后蛋白核小球藻叶绿素A 含量的变化趋势。
由图3可知，对照组和实验组叶绿素A 含量在培养期前2天均出现下降现象。对照组叶绿素A 含量的下降可能是由于藻细胞接种后有一个适应平台期，适应期内的藻细胞繁殖相对缓慢，叶绿素A 分解速度大于增长速度，因此总体呈下降趋势。从第3天开始，对照组藻细胞度过适应平台期，进入快速增殖的对数生长阶段，藻细胞生长旺盛，叶绿素A 含量快速上升；第5天以后，叶绿素A 含量又开始剧烈下降。这是因为藻细胞经过5天培养，进入衰退期，藻细胞活力下降，因此叶绿素A 含量下降，但总体仍远高于实验组。在整个培养过程中，实验组叶绿素A 含量始终保持较低水平。有研究认为，有些化感物质可以破坏藻细胞的叶绿素A ，影响藻细胞的光合作用和同化产物的产生，从而达到抑制藻细胞生长的目的［19］。朱传雪等［20］在研究荷花种植水对巢湖蓝藻的抑制作用时发现，荷花种植水可使蓝藻细胞内的叶绿素A 含量下降，研究者认为荷花代谢化感物质可破坏蓝藻细胞
时间/d
时间/d
龙芯一体机
旧衣服加工设备过膜除藻前吸光度
过膜除藻后吸光度
图2塔尔油对藻液吸光度的影响
Fig.2Effect of tall oil on the absorbance 叶绿素A 含量/µg ·L −1
时间/d
图3塔尔油对蛋白核小球藻叶绿素A 含量的影响Fig.3
Effect of tall oil on the chlorophyll A content of
Chlorella pyrenoidosa
并使其丧失光合作用。Ni 等［21］在研究缓释情况下亚油酸对铜绿微囊藻的化感效应时发现，亚油酸缓释微球实验组的叶绿素A 含量下降明显，与本实验结果相似。2.2.2
塔尔油对蛋白核小球藻抗氧化酶的影响图4显示了培养第3天塔尔油对蛋白核小球藻的藻蛋白含量及SOD 和CAT 酶活力的影响。
当外界条件改变时，藻细胞体内的SOD 和CAT 酶活力会短时间提高以消除生长环境出现的超氧根离子，从而维持细胞的正常生长［22］。由图4可知，加入塔尔油后藻细胞的SOD 和CAT 酶活力均呈应激性提高。与对照组相比，100和150mg/L 实验组CAT 酶活力从0.99U/mg 分别增至5.35和3.60U/mg ，为对照组的5.4和3.6倍。同样，藻细胞SOD 酶活力受塔尔油的影响出现激增，从对照组的1.21U/mg 分别增至2.50和4.01U/mg ，为对照组的2.1和3.3倍。这可能与蛋白核小球藻受塔尔油“胁迫”时产生的应激反应有关。Li 等［23］在三叶草水提物对铜绿微囊藻的化感作用研究中发现，当刚加入三叶草水提物时，铜绿微囊藻的SOD 和CAT 酶活力应激性提高，这与本实验中塔尔油作用于藻细胞的结果相似；Shao 等［24］在研究邻苯三酚对铜绿微囊藻的化感作用时也发现，在邻苯三酚“胁迫”下，铜绿微囊藻的SOD 和CAT 酶活力均出现了氧化应激性提高；Hong 等［25］研究发现，芦木碱对铜绿微囊藻的SOD 和CAT 酶活力也有影响，并注意到在早期细胞暴露时，芦木碱可以诱导提高CAT 酶活力，但后期则会降低铜绿微囊藻的SOD 酶
活力。
塔尔油的加入会对蛋白核小球藻产生一定“胁迫”作用，蛋白核小球藻的抗氧化系统在短时间通过
提高SOD 酶活力来降低这种氧化性损伤。在受到环境“胁迫”时，细胞可能还会合成逆境蛋白用以对抗环境［26］。从图4可以看出，实验组藻蛋白含量也出现了上升，应该是藻细胞合成了逆境蛋白以应对外界环境的变化所致。2.2.3
塔尔油对藻液颗粒粒径的影响
从藻细胞密度曲线（见图1）可以发现，培养第
5天测定的抑藻率最高。取抑藻率最高时的藻液，并
对其进行颗粒粒径测定，结果如图5所示。
从图5可以看出，与对照组相比，实验组藻液颗粒粒径出现了最大粒径和平均粒径变大、最小粒径变小的现象。对照组藻液颗粒的平均粒径约为94.1µm ，且颗粒粒径分布在1~400µm 之间，而加入塔尔油的100、150mg/L 实验组藻液颗粒平均粒径分别增大
到126.4和124.2µm 。颗粒粒径分布变得更加分散，
最小粒径从对照组的1µm 下降到实验组的0.4µm ，
100mg/L 实验组颗粒在400~800µm 也有分布，而
150mg/L 实验组颗粒最大粒径甚至达到1000µm 。从图5还可以看出，对照组颗粒粒径在1~8和100~
400µm 之间有2个明显的分布峰，加入了塔尔油的实验组颗粒粒径在1~8µm 之间的分布峰基本消失，
100mg/L 实验组颗粒粒径更均匀地分布在2~60µm 之间，150mg/L 实验组颗粒粒径在20~60µm 之间出现
了新的分布峰。综合以上分析可知，塔尔油在一定范围内可使蛋白核小球藻液颗粒粒径分布变得更加分散，表现为峰宽变大，粒径范围变大。这是由于塔尔油一方面可使蛋白核小球藻细胞分解破碎，从而使藻液颗粒粒径变小，另一方面可使藻细胞更加趋向于絮聚，使得藻液颗粒粒径增大。杨茹君［27］在研究重金属对海洋浮游植物生长过程中的粒度效应时发现，添加Pb （Ⅱ）可改变赤潮异弯藻的粒径，出现最大粒径增大、最小粒径减小的现象，这与本实验结果相似。2.2.4
塔尔油对藻液Zeta 电位的影响
Zeta 电位是表征分散体系稳定性的重要指标，已
有许多研究表明，藻液的Zeta 电位对藻细胞的聚集或分散有影响［28-29］。
图6为加入塔尔油后培养期不同阶段蛋白核小球藻液Zeta 电位的变化情况。从图6可以看出，蛋白核小球藻液Zeta 电位均为负值且在-13~-36mV 之间波动；实验组藻液Zeta 电位绝对值明显低于对照组，这可能是由于加入塔尔油后，蛋白核小球藻细胞受到了破坏，从而释放大量的胞内有机物，藻细胞更容易粘附，从而增大其絮聚趋势，这也解释了在藻细胞计数
对照组
视频无线传输0.51.01.52.02.5
3.0藻蛋白含量CAT 酶SOD 酶
100 mg/L 实验组150 mg/L 实验组
1
23456
7藻蛋白含量/g ·L −1
酶活力/U ·m g −1
图4塔尔油对蛋白核小球藻抗氧化酶的影响
Fig.4Effect of tall oil on the antioxidant enzyme
of Chlorella pyrenoidosa
时显微镜下细胞成团的现象。培养过程中也可以明显看出，实验组中存在絮体在瓶底沉淀的现象。郑利娟等［30］在探究碱度对混凝去除铜绿微囊藻及其分泌有机物的影响时发现，随着碱度的增大，藻液Zeta 电位绝对值逐渐减小，体系的稳定性逐渐减弱，有助于絮体形成，与本实验现象相似。2.2.5
塔尔油对蛋白核小球藻杀灭效果研究为研究塔尔油对藻细胞的杀灭作用，取培养第5天藻细胞（抑藻率最高），经染后用流式细胞仪对其生存状态进行分析，结果如图7所示。
无热胆饮水机
依据死亡、活细胞所处的区域，设定合适的
0.40.61
246810
2040608010020040060010002000
粒径/µm
体积比/%
(a) 对照组平均粒径：94.1 µm
0.40.6
1
2
4
6810
20406080100200
4006001000
2000
粒径/µm
4.54.03.5
3.02.52.01.51.00.50(b) 100 mg/L 实验组
体积比/%
平均粒径：126.4 µm
6.0
5.55.04.54.03.53.02.52.01.51.00.50
0.40.612
46810
20406080100
20040060010002000
(c) 150 mg/L 实验组粒径/µm
体积比/%
平均粒径：124.2 µm
图5塔尔油对藻液颗粒粒径影响
Fig.5
Effect of tall oil on the particle size of algae liquid
−−−−−−−Z e t a 电位/m V
时间/d
图6塔尔油对藻液Zeta 电位的影响
Fig.6Effect of tall oil on the Zeta potential of algae liquid
豫公网安备41160202000603
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