彭远远;王捷;夏冰;杨传红;冼江在线升级
【摘 要】旨在探究整合素αvβ3的单克隆抗体LM609在BSP不同表达水平的乳腺癌细胞中对AKT(蛋白激酶B)信号通路的影响.利用免疫细胞化学法检测BSP不同表达水平的乳腺癌细胞中整合素αvβ3的表达量.BSP基因沉默乳腺癌MDA-MB-231BO细胞,Western blotting在蛋白水平检测磷酸化AKT的表达,MTT试验和细胞划痕试验分别检测细胞增殖、迁移能力的变化.结果显示,与231BO-Scrambled细胞相比,231BO-BSP27细胞中BSP蛋白水平明显降低,抑制率达到(59.43±1.71)％；LM609分别处理两株细胞后,与对照组231BO-Scrambled细胞相比,BSP基因沉默组21BO-BSP27细胞中AKT磷酸化水平下调明显,为(33.78±1.51)％(P＜0.01)；231BO-BSP27细胞和对照组231BO-Scrambled中细胞的增殖和迁移能力均有不同程度的下降(P＜0.05).LM609能够抑制胞内整合素αvβ3功能的表达,进而对AKT信号通路进行调控,并影响细胞增殖和迁移的发生. 【期刊名称】《生物技术通报》
【年(卷),期】2012(000)003
【总页数】5页(P191-195)
【关键词】整合素αvβ3;LM609;乳腺癌细胞;AKT信号通路
【作 者】彭远远;王捷;夏冰;杨传红;冼江
【作者单位】广州军区广州总医院医学实验科,广州510010;华南理工大学生物科学与工程学院,广州510006;广州军区广州总医院医学实验科,广州510010;广州军区广州总医院医学实验科,广州510010;广州军区广州总医院医学实验科,广州510010;广州军区广州总医院医学实验科,广州510010
热镀锌线槽【正文语种】中 文
骨唾液酸蛋白（BSP）是1994年由Bellahcence首次在发生骨转移的人乳腺癌细胞中发现并阐明[1]。BSP是SIBLINGs （small integrin-binding ligand N-linked glycoproteins）家族中重要成员，在肿瘤黏附、增殖[2]、侵袭[3]、基质降解、免疫反应[4]、血管生成和转移中发挥重要生物学作用，是乳腺癌骨转移可能的药物靶点。整合素αvβ3通过识别配体分子BSP中的RGD序列与其结合，从而介导相关信号通路，参与肿瘤的血管生成、侵袭转移
等生理和病理过程。最新研究证明，整合素αvβ3能对AKT丝氨酸473位点磷酸化导致AKT激活，进而增强下游因子VEGF、NF-KB等相关因子的表达，具有抗凋亡作用并能促进肿瘤血管生成[5]。本试验室已经证明，沉默BSP能够抑制PI3K-AKT信号转导通路，并抑制下游分子caspase-3、VEGF和cyclinD1的活性[6]。但BSP是否通过受体整合素αvβ3作用调控AKT信号通路，进而影响细胞的增殖和迁移的发生，尚不清楚。本研究旨在探讨αvβ3是否介导了BSP对AKT信号通路的活化，为揭示 BSP调控信号通路进而促进肿瘤转移的机制提供试验依据。
BSP基因沉默乳腺癌细胞株MDA-MB-231BOBSP27、导入无关质粒 pSilencer-scrambled的对照乳腺癌细胞株 MDA-MB-231BO-Scrambled，分别简称为231BO-BSP27和231BO-Scrambled，由广州军区广州总医院医学实验科保存[7]，两株细胞同属于乳腺癌亲骨转移细胞系MDA-MB-231BO。尼康YSK-088荧光显微镜，整合素αvβ3鼠抗单克隆抗体LM609，购于Millipore公司。免疫组化Elivision plus试剂盒（鼠/兔），AEC显液，AEC水溶性封片剂，均购于福州迈新生物公司。兔抗人p-AKT抗体，HRP-山羊抗兔IgG二抗均购自CST公司。兔抗GAPDH多克隆IgG抗体购自北京康维世纪。
1.2.1 细胞培养 乳腺癌细胞株231BO-Scrambled和231BO-BSP27用含10%胎牛血清的 DMEM培养液在37℃、5% CO2饱和湿度细胞培养箱内培养，常规更换培养液、消化传代。
蝶型弹簧1.2.2 免疫细胞化学检测乳腺癌细胞231BO中整合素αvβ3的表达量 将乳腺癌细胞231BO-Scrambled和231BO-BSP27放在加有已灭菌的盖玻片的6孔板中培养24 h，显微镜下观察至细胞已经铺满盖玻片。将盖玻片取出，用4%多聚甲醛固定30 min；将玻片浸在3% H2O2中10 min，用免疫组化油性笔在玻片上圈出1-1.5 cm大小的圆圈，滴加200 μL整合素αvβ3鼠抗单克隆抗体工作液（1:400稀释），将玻片放在湿盒中置于37℃孵箱中孵育2 h，滴加免疫组化试剂盒A试剂室温孵育20 min，滴加B试剂室温孵育30 min，滴加AEC显液，镜下控制染1-3 min，苏木素复染1-2 min，湿片状态下用水溶性封片剂封片，60℃孵箱2 h烤干；中性树胶加盖玻片二次封片保存。每组细胞分别设置空白对照。高倍镜下随机选择5个视野，计算阳性细胞数目，整合素avβ3表达阳性为胞膜和胞浆着棕黄。
1.2.3 Western blotting检测细胞中AKT及其磷酸化水平的表达 分别取乳腺癌细胞231BO-Scrambled和231BO-BSP27用细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量。取 120
μg等量总蛋白样品变性后进行 SDS-PAGE凝胶电泳，然后转移至 PVDF膜；含 5%脱脂奶粉的 TBST室温摇动封闭 1 h；加入 TBST稀释的兔抗人 AKT单克隆抗体（ 1:2 000稀释） 和兔抗人 GAPDH多克隆抗体（ 1:3 000稀释），4℃摇床过夜；加TBST稀释的 HRP标记的二抗（1:2 000稀释），37℃孵箱孵育 60 min；加入 ECL超敏发光液，X线胶片曝光成像。Quantity One软件进行分析，计算条带灰度值，以 GAPDH作为内参，计算p-AKT蛋白的相对表达量。
二维液相谱
1.2.4 MTT法检测细胞增殖能力的变化 选取对数生长期细胞（3.5×104/mL），每孔200 μL接种入96孔细胞培养板，置37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养。培养12 h后，弃上清，每孔分别加入200 μL含LM609（1:100稀释）的无血清培养基。37℃、5% CO2饱和湿度培养箱内培养24 h后，每孔加5 mg/mL MTT 20 μL，于37℃、5% CO2培养箱继续孵育4 h，吸除原有培养液，每孔加DMSO 150 μL，振荡溶解，选择检测波长570 nm，在酶标仪上测定光密度值（OD值）。
1.2.5 划痕试验检测细胞迁移能力的变化 将处于对数生长期的细胞以5×105个/孔的密度接种231BOScrambled和231BO-BSP27细胞于六孔板中。每株细胞分别培养6孔，LM609处雪芙蓉冰车
理组和阴性处理组，同时设复孔对照。LM609添加浓度为3.3×10-4 mg/mL。将六孔板于37℃、5% CO2饱培养箱内培养。待细胞在37℃、5% CO2饱和湿度细胞培养箱内培养至80%-90%汇合态时，用200 μL无菌头在孔内单层细胞上沿直径垂直划1个创伤口，构建培养细胞伤口模型。划痕后，小心吸出孔内包含划落细胞的原培养液，PBS冲洗，每孔重新加入2 mL无血清培养基。分别在0和24 h时间段用倒置显微镜观察伤口愈合情况并及时拍照。
1.2.6 统计学处理 数据以均数±标准差表示，采用 SPSS13.0统计软件包进行分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 t检验，P<0.05 或P<0.01表示差异有统计学意义。
分别由两名病理医师在未知病理资料的情况下独立观察切片（选择5个具有代表性的高倍视野，计数1 000个细胞），观察免疫组织化学的染情况。与231BO-Scrambled细胞相比，231BO-BSP27细胞中整合素αvβ3阳性表达明显降低，抑制率达到（59.43±1.71） %，且具有显著统计学意义（P<0.01）（图1）。
与231BO-Scrambled细胞相比，231BO-BSP27中p-AKT相对表达水平减少（33.30 ±2.61）%（P＜0.01）；而 LM609作用后，231BO-Scrambled和231BO-BSP27细胞中 p-
AKT相对表达水平分别降低（17.86 ±2.27）%和（33.78 ±1.51）%（P<0.01），LM609能明显抑制整合素αvβ3对 AKT磷酸化水平的激活作用，p-AKT相对表达水平分别下降（31.49±3.81）%和（26.98 ±1.05）%（P<0.01）（图2）。由此可见，αvβ3对乳腺癌 MDA-MB-231BO细胞 p-AKT的活性具有明显的调控作用，而这种作用依赖于BSP表达方式的高低。
MTT试验检测 231BO-Scrambled和231BO-BSP27细胞在LM609作用后细胞增殖能力的变化。结果（图3）显示，两株乳腺癌细胞经过LM609作用24 h后，连续8 d测其在570 nm处的OD值，发现与未用LM609处理相比较，增殖能力均有降低（P<0.05）。同时发现与231BO-Scrambled细胞相比，231BO-BSP27细胞的增殖能力有明显降低（P<0.01），表明LM609能部分的抑制整合素αvβ3的功能进而抑制细胞增殖能力，同时BSP低表达的细胞中αvβ3表达水平也降低，其细胞增殖能力受到抑制。提示BSP通过与整合素αvβ3共同作用调控AKT信号通路进而影响细胞增殖。
图3显示，0和24 h时231BO-BSP27细胞与231BO-Scrambled细胞划痕愈合速度在未加无差异。对细胞培养瓶内加入整合素αvβ3的阻断剂LM609之后，231BO-Scrambled和231B
O-BSP27细胞划痕愈合速度均在不同程度上减慢。提示抑制整合素αvβ3的表达可以降低乳腺癌细胞的迁移能力。
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，转移是导致患者死亡的主要原因。骨转移是乳腺癌最常见的远处转移部位之一。BSP是高度磷酸化和糖基化分泌型蛋白，由317个氨基酸组成。研究证明，BSP通过C端的Arg-Gly-Asp（RGD）序列不仅介导细胞外基质与细胞间的黏附[8]，而且该序列能够与整合素结合，促进人乳腺癌细胞的增殖和转移[9]。
人与嘼 交 互整合素最早由Hynes于1987年提出属于黏附分子的一大类[10]，作为膜受体家族介导细胞与细胞外基质及细胞与细胞间的相互黏附。αvβ3由αv亚基和β3亚基组成是整合素家族的重要成员，分子量为150 kD。整合素可识别细胞外基质蛋白精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（ RGD） 结构。同时促使黏附斑（ focal adhesion plaque，FAP）形成[11]，还存在多种重要的信号转导分子，如ILK、AKT、Src和PI-3K等[12]。其中αvβ3活化AKT/PI3K信号通路能够激活与乳腺癌细胞生长、迁移、侵袭相关的因子AP-1、MMPs和uPA的表达，从而调节细胞增殖、存活及分化，在增强肿瘤细胞增殖、侵袭、转移等方面发挥着重要作用[13]。本试验采用含有RGD结构的αvβ3阻断性单克隆抗体LM609处理细胞，含有RGD序列
的抗体结构可阻断整合素αvβ3与ECM的连接，使整合素αvβ3有效表达量降低，阻断整合素介导的相关信号通路的传递。试验中使用细胞黏附因子的特异性抗体，能够帮助实现对肿瘤的导向诊断和，是近年来肿瘤研究的热点。
1995年，AKT/蛋白激酶B（PKB）即丝/羟丁氨酸蛋白激酶作为磷脂酰肌醇激酶3（PI3K）的一个靶分子被发现。AKT可直接磷酸化mTOR （mammalian target rapamycin）的Ser2448位点，激活mTOR，其下游信号通路控制着细胞增殖、迁移和转化所需的特殊mRNA的翻译。AKT的表达能促进上皮-间叶转化（EMT），与乳腺癌肿瘤的浸润和转移相联系[14]。AKT参与肿瘤发生机制中的许多过程，激活的下游信号通路研究的比较多的包括PI-3K/AKT和Wnt[15]。本实验室前期研究已经初步证实BSP通过调控胞内PI3K-AKT信号转导通路及下游相关因子caspase-3、VEGF等影响乳腺癌细胞增殖[15]。但对于BSP对PI3K-AKT信号通路的作用是否完全依赖于整合素受体，特别是BSP最适配基αvβ3的作用，未进行进一步的研究。
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