林怡翔;徐君;顾若漪;曹银银;刘斯达;李烁琳;王慧君;黄国英
【摘 要】目的 通过改变组蛋白H3K27和S28位点整体修饰水平并检测心脏发育相关基因表达,初步探索位点修饰对基因表达的影响,阐明位点修饰在先天性心脏病(CHD)发病中的可能机制.方法 ①使用丁酸钠、姜黄素、佛波酯处理培养的C2C12细胞;Western Blot检测组蛋白H3K27乙酰化(H3K27ac)和H3S28磷酸化(H3S28ph)水平;实时荧光定量PCR检测心脏相关基因表达情况.②对培养细胞行丁酸钠和姜黄素浓度梯度处理,检测位点修饰及表达差异相关心脏基因表达.采用Pearson相关检验位点修饰与基因表达的关系.结果 ①丁酸钠处理后的C2C12细胞H3 K27 ac水平较对照组明显上调[(1.90±0.04)vs(1.09±0.01),P＜0.05],伴H3S28ph水平明显下调[(0.04±0.01)vs(0.73±0.01),P＜0.05)];姜黄素组H3 K27 ac水平(0.04±0.00)较对照组明显下调(P＜0.05),伴H3S28ph水平上调[(0.97 ±0.06)vs(0.73 ±0.01),P＜0.05)];佛波酯组H3S28ph(1.67 ±0.00)和H3 K27 ac水平(1.58±0.03)较对照组上调(P＜0.05).②丁酸钠与姜黄素浓度梯度处理后,H3K27ac、H3S28ph水平与给药浓度的指数有显著的相关性(R2分别为0.993和0.966).在检测的8个心脏相关基因中,药物处理后均产生了表达改 变,差异有统计学意义(ANOVAP＜0.05);丁酸钠梯度处理的细胞cTnT、Cx43和Six1基因表达与H3 K27ac水平呈负相关(R2分别为0.709、0.713和0.651),与H3S28 ph水平呈正相关(R2分别为0.866、0.822和0.766).姜黄素梯度处理未有显著的相关性(R2＜0.5).结论 组蛋白H3K27和H3S28位点修饰状态的变化影响心脏发育相关基因的表达,可能是CHD的潜在发病机制.
【期刊名称】《中国循证儿科杂志》
【年(卷),期】2015(010)003
【总页数】5页(P236-240)
【关键词】先天性心脏病;组蛋白;乙酰化;磷酸化;C2C12细胞
【作 者】林怡翔;徐君;顾若漪;曹银银;刘斯达;李烁琳;王慧君;黄国英
【作者单位】复旦大学附属儿科医院 上海,201102;复旦大学附属儿科医院 上海,201102;复旦大学附属儿科医院 上海,201102;复旦大学附属儿科医院 上海,201102;复旦大学附属儿科
免火再煮锅
医院 上海,201102;复旦大学附属儿科医院 上海,201102;复旦大学附属儿科医院 上海,201102;上海市出生缺陷重点实验室 上海,201102;复旦大学附属儿科医院 上海,201102;上海市出生缺陷重点实验室 上海,201102
【正文语种】中 文
先天性心脏病(CHD)是一种常见的出生缺陷［1］。遗传与环境因素被认为对CHD的发病机制有较大影响［2］。遗传学研究已证实染体异常和多个基因突变与CHD存在关联，但其低发生率和高变异不足以完全解释CHD的发病。环境因素对个体表型的影响及其相关机制尚未阐明［3，4］。组蛋白修饰与基因表达调控密切相关，广泛参与了转录的启动终止、基因表达沉默和染体重构等过程，是表观遗传学的重要部分。本课题组前期研究证实法洛四联症患儿心肌组织中组蛋白整体乙酰化水平存在异常，其中组蛋白H3第27位赖氨酸残基(K27)的乙酰化修饰(H3K27ac)在 CHD患儿中明显降低［5］。有研究表明，H3K27三甲基化修饰异常能够影响基因的表观沉默，从而破坏正常基因时空表达，导致胎鼠心脏畸形［6］。近年来，研究者逐渐认识到单个位点的修饰无法解释组蛋白对基因表达影响;位点间的相互作用以及各位点修饰状态的组合，是构成组蛋白调控基因表达的主要基础［7，
8］。组蛋白H3K27与其相邻的第28位点丝氨酸残基(S28)已被证实具有相互作用;S28的磷酸化(S28ph)状态可影响K27位点的修饰状态，从而影响基因的表达调控［8，9］。本研究以C2C12细胞为研究对象，用广谱的组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂丁酸钠、组蛋白乙酰转移酶(HATs)抑制剂姜黄素及蛋白激酶C(PKC)的强激活物佛波酯［14］干预细胞，通过Western Blot检测C2C12细胞组蛋白H3K27的乙酰化和H3S28的磷酸化水平，用RT-PCR检测干预后细胞心脏发育相关基因的表达变化，从而探讨H3K27和H3S28位点修饰在CHD发病中的可能机制。
1 方法
1.1 材料 C2C12细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库;高糖DMEM细胞培养基购自美国HyClone公司;胎牛血清及青霉素链霉素双抗购自美国Invitrogen公司;丁酸钠、姜黄素购自Sigma公司;H3K28ac及H3S28ph抗体购自Cell SignalTechnology公司;β肌动蛋白(内参)抗体购自Abcam公司;蛋白酶抑制剂(PIC)及磷酸酶抑制剂(PI)购自美国Roche公司;蛋白定量试剂盒及Western显影试剂盒购自LifeTechnology公司;30%聚丙烯酰胺凝胶和硝酸纤维薄膜购自美国伯乐公司;RIPA(强)裂解液及Western Blot其他试剂购自上海威奥生物科技
有限公司;Trizol试剂购自美国Invitrogen公司;反转录试剂盒和SYBR Green Real-time PCR Master Mix购自日本Takara公司;Real-time PCR仪(ABI-7900)为美国ABI公司产品。透水石1.2 细胞培养 C2C12细胞复苏后接种于10cm2培养皿，加入含10%FBS及1%双抗的高糖DMEM培养基，置37℃5%CO2培养箱培养。胰酶消化处理后传代;传代细胞长满后接种于12孔培养板，待细胞贴壁生长后进行干预。
1.3 分组和细胞处理 设丁酸钠组、姜黄素组、佛波酯组和对照组。丁酸钠以超纯水溶解，姜黄素、佛波酯溶于DMSO溶剂，并调整DMSO浓度为1/1000。药物处理接种于12孔板的细胞:丁酸钠浓度为50mmol·mL-1，姜黄素浓度为25μmol·mL-1，佛波酯浓度为50nmol·mL-1，均做3复孔;对照组和丁酸钠组加入含0.1%DMSO的培养基。加药后的细胞置于培养箱内培养24h后收集细胞并用PBS洗涤沉淀，行H3K27ac、H3S28ph和心脏发育相关基因表达检测。
1.4 Western Blot检测组蛋白H3K27ac与H3S28ph水平在RIPA(强)裂解液中加入0.1%蛋白酶抑制剂及2%磷酸酶抑制剂。取洗涤后细胞沉淀，加入100μL裂解液，充分吹打混匀，置冰裂解。裂解后离心分离沉淀，取上清液用试剂盒定量。定量后蛋白加入5×Loading上样
CO2封存缓冲液并配制为终浓度1mg·mL-1。制作浓缩胶与分离胶，加入蛋白样品并加入一个泳道的蛋白分子量Marker;在电泳槽中以130V电压电泳约70min。切取分离胶转至转膜槽，以0.35mA电流转膜90min，将蛋白及Marker转至硝酸纤维膜。以立春红染料染硝酸纤维膜，并根据Marker剪取目标分子量的膜上条带(组蛋白H325kD，β-肌动蛋白45kD)。洗涤后加入5%脱脂奶粉封闭非特异性抗原1h。加一抗置4℃冰箱孵育过夜。次日洗涤后加入二抗室温孵育1h，洗净二抗。用显影试剂盒显影，并用Las3000成像系统曝光拍照。用bandleader软件进行灰度扫描并计算目的条带与内参的灰度比值。
1.5 细胞总RNA抽提及反转录 采用Trizol法抽提总RNA。在洗涤后的细胞中加入1mLTrizol试剂，吹打混匀后置冰裂解完全。加入氯仿混匀离心，分离水相。加入预冷异丙醇沉淀RNA并离心，并用75%乙醇洗涤沉淀。沉淀干燥后加入DEPC水溶解沉淀。用紫外分光光度法测定RNA浓度;1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量(有3条带为质量良好)。抽提后的总RNA用TAKARA逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA。
1.6 引物合成及实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测基因表达 采用IDTdna公司提供的在线Realtime引物设计软件，对参与心脏发育过程的代表基因设计引物(表1)，扩增片段均跨外
显子，片段长度为100～200 bp。8个候选基因包括心脏发育相关转录因子家族(TBX2，GATA4，Sxi1)、信号通路基因(Bmp2，TGFβ2)以及心脏特异性基因(Nkx2.5，cTnT，Cx43)。PCR反应体系10μL:RT-PCR 引物1μL、cDNA 2μL(含1μg cDNA)，超纯水2μL，SYBR Green Real-time PCR Master Mix 5μL。反应条件:95℃预变性120s;PCR循环:95℃5s，60℃30s，扩增40个循环。反应完成后，采用SDS 2.3软件输出结果。
1.7 丁酸钠和姜黄素浓度梯度处理细胞 对2种及以上药物处理基因表达与对照组相比有统计学差异的基因，进一步行药物浓度梯度处理。在培养细胞中加入不同浓度的丁酸钠(0、1、10和100mmol·mL-1)及姜黄素(0、0.1、1和10μmol·mL-1)，并调整DMSO浓度为1/1 000。每个浓度均做3复孔，加药后处理1.3项下，行H3K27ac、S28ph水平和心脏发育相关基因表达检测。
1.8 统计学方法 用GraphPad Prism5软件分析实验结果。计量资料以±s表示。RT-PCR结果及Western灰度扫描结果采用单因素方差分析，组间差异用Bonferroni法比较。药物浓度与H3K27ac、S28ph水平和心脏发育相关基因表达相关分析采用Pearson相关检验，(P＜0.05)为差异有统计学意义。
电线固定座
表1 实时荧光定量PCR引物序列Tab 1The sequences of primers in realtime PCRPrimer Sequence(5'-3')Length/bp Internal references β-actin-F 5'-CACACCCGCCACCAGTTCG-3' 174 β-actin-R 5'-GTCCTTCTGACCCATTCCCACC-3'Tested genes NKX2.5-F 5'-CCGCCAACAGCAACTTCGTG-3' 233 NKX2.5-R 5'-GAGGGTGGGTGTGAAATCTGAGG-3'Troponin-F 5'-CAGAGGAGGCCAACGTAGAAG-3' 138Troponin-R 5'-CTCCATCGGGGATCTTGGGT-3'GATA4-F 5'-GAAGAGATGCGCCCCATCAA-3' 176 GATA4-R 5'-TGCGATGTCTGAGTGACAGG-3'Cx43-F 5'-CAGCGCAGAGCAAAATCGAA-3' 156 Cx43-R 5'-CTGGAAGGTCGCTGATCCAC-3'Six1-F 5'-CCAGGTCAGCAACTGGTTTA-3' 101 Six1-R 5'-GCTTGTTGGAGGAGGAGTTATT-3'Tgfb2-F 5'-TAATTGCTGCCTTCGCCCTC-3' 152Tgfb2-R 5'-GGCTGAGGACTTTGGTGTGT-3'Tbx2-F 5'-GCAGTGGCAGTAGCGGAG-3' 175Tbx2-R 5'-TAGGGAAAGAGGCCTCCGAA-3'
2 结果
2.1 药物细胞生长情况 加药后用倒置相差显微镜观察处理细胞。细胞状况良好，大多贴壁
毛发收集器生长，细胞形态成多角形，细胞核清晰可见。丁酸钠100mmol·mL-1处理后细胞有部分死亡漂起，贴壁细胞较其他组略少，细胞形态尚可，无大面积死亡现象。
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