一种扩增犬冠状病毒S基因全序列的引物、方法和应用

一种扩增犬冠状病毒s基因全序列的引物、方法和应用
技术领域
1.本发明涉及犬冠状病毒s基因全序列扩增技术领域，更具体地说是涉及一种扩增犬冠状病毒s基因全序列的引物、方法和应用。

背景技术：

2.犬冠状病毒(canine coroanvires，ccov)是引起犬肠道疾病最主要的病原之一，可引起犬的急性胃肠炎，临床上表现为频繁呕吐、腹泻、沉郁、厌食以及高发病率和低死亡率。该病毒既能单独致病，也可与犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒等病原微生物发生混合感染，导致严重的临床症状，显著提高致死率，是当前严重威胁我国养犬业的病原之一。
3.犬冠状病毒属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属成员，是一种带囊膜的单链正股rna病毒，基因组大小为27-32kb之间，编码4个结构蛋白 (s、e、m、n)和6个非结构蛋白(orf1ab、orf3a、orf3b、orf3c、o rf7a、orf7b)。其中，s蛋白位于病毒最外层，是一种重要的结构蛋白。研究发现，s蛋白的n端与宿主细胞表面的受体结合相关，可使病毒与细胞膜靠近，并参与膜融合，在病毒侵染细胞的过程中发挥着至关重要的作用。同时，s蛋白含有的抗原表位是诱导机体产生中和抗体的主要保护性抗原。s 蛋白的c端参与病毒粒子的装配及蛋白的胞内运输，并在一定程度上决定了 ccov毒株的致病性，是ccov发挥致病作用的主要结构。此外，研究发现，编码s蛋白的s基因具有较大的可变性，尤其是s1片段。根据ccov的s基因构建系统发育树，显示所有的ccov毒株可分成2个基因型，分别为cco v-i型和ccov-ii型，其中ccov-ii型又进一步分为3个亚型，分别为ccov
‑ꢀ
iia、ccov-iib和ccov-ii variant。因此了解、掌握ccov的s基因的变异情况，有助于了解ccov的基因重组、抗原变异、病毒感染细胞机制和基因变化规律，对ccov致病机制的研究和疫苗等防控措施开发均有重要的指导意义。
4.ccov的s基因长度为4362bp左右，且变异程度大，因此，当前ccov s 基因变异情况的研究主要通过选择s基因中部分序列片段进行，长度一般为20 0-500bp左右，无法准确反应整个s基因的变异情况；或通过将ccov的s基因分成多个相互重叠的基因片段进行引物设计和扩增，拼接后获得s基因全长序列，不仅工作量大，而且还存在高变区域无法扩增获得目的片段的风险。
5.因此，如何通过一次扩增法即可实现对犬冠状病毒s基因全序列的扩增是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种扩增犬冠状病毒s基因全序列的引物序列，通过对ncbi上已知全基因组ccov毒株的s基因上、下游比对，筛选获得其上下游保守区域，设计1对引物，实现犬冠状病毒s基因的全序列扩增，操作便捷，避免了在高变区域无法扩增获得目的片段的风险。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种扩增犬冠状病毒s基因全序列的引物，其特征在于，其核苷酸序列如下:
9.上游引物ccov-s1：gttggattactaaggaarggta；seq id no.1；
10.其中，r为a或g；
11.下游引物ccov-s2：gtacagcgtctacggatg；seq id no.2。
12.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护seq idno.1～seq id no.2所示的引物制备扩增和检测犬冠状病毒s基因序列试剂盒中的应用。
13.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种扩增和检测犬冠状病毒s基因全序列的试剂盒，包括seq id no.1～seq id no.2所示的引物，其中，上游引物为1μl，浓度为10pmol/μl；下游引物为1μl，浓度是10pmol/μl。
14.作为上述技术方案优选的技术方案，所述试剂盒还包括：2
×
green taqmix 12.5μl、cdna 1μl、ddh2o9.5μl。
15.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种扩增犬冠状病毒s基因全序列的方法，其特征在于，提取病毒rna，反转录成cdna，以seq id no.1～seq id no.2所示的引物对cdna序列进行扩增，最后对扩增片段进行纯化。
16.作为上述技术方案优选的技术方案，扩增程序为：
[0017][0018]
作为上述技术方案优选的技术方案，所述纯化为采用fastpure gel dnaextractionmini kit试剂盒进行纯化。
[0019]
根据本公开的一个方面，一种犬冠状病毒s基因全序列扩增方法的应用，用于对犬冠状病毒s基因全序列序列的检测与分析。
[0020]
根据本公开的至少一个实施方式，将所述扩增方法获得的产物，测序后，进行同源性比对，对所扩增的犬冠状病毒进行分类。
[0021]
根据本公开的至少一个实施方式，所述同源性比对为将测序获得的序列与ncbi上已知的犬冠状病毒s基因进行比对。
[0022]
采用上述技术方案之后，本公开具有以下有益效果：
[0023]
1、本公开仅仅使用1对引物扩增包含s基因全序列的片段，较之前使用 2对、3对引物进行扩增和拼接，更加便捷、节约成本。
[0024]
2、本公开使用的引物设计位置位于ccov s基因上、下游保守区域，能够有效的提高扩增的成功率，降低因位于高变区引物造成的扩增失败。
[0025]
3、本公开能够更加快捷的获得s基因的全序列，有利于对所扩增的ccov进行分类，掌握病毒进化规律，同时指导临床疫苗的使用及开发。
[0026]
4、本公开上游引物距离s基因起始位点62bp，下游引物距离s基因终止位点110bp，可以有效避免因测序起始阶段不准确所导致的序列信息不准确，在测序时，确保在序列信息准确的基础上减少构建t载体的步骤。
附图说明
[0027]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0028]
图1附图为本发明犬冠状病毒s基因全序列的pcr扩增结果，其中，m： dl10000 dna marker；1-12：泳道1为实施例2中bx71，来自福建省厦门市犬粪便样品结果，泳道2为实施例3中bd15，来自福建省莆田市犬粪便样品结果，泳道3为实施例4中bq25，来自福建省泉州市犬粪便样品结果，泳道4-11：福建省其它地区来源的ccov阳性粪便样品；12：阳性对照(以之前用该引物已经扩增获得目的条带样品核酸作为模板)；
[0029]
图2附图为本发明提供的系统进化树图；
[0030]
图3附图为不同退火温度的ccov的s基因全序列pcr电泳图；其中， 1：45℃、2：48℃、3：50℃、4：52℃、5：55℃、6：58℃、7：60℃；
[0031]
图4附图为不同病毒样品的ccov的s基因全序列pcr电泳图，其中， m：dl10000 marker；1：ccov；2:fcov；3:pedv；4:tgev；5:prov；6:pdcov； 7:pcv；8:prrsv；9:sfv；10:prv；11:cpv；
具体实施方式
[0032]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0033]
实施例1
[0034]
从ncbi上下载已知的ccov毒株的全基因组序列，并分别收集各毒株s 基因上、下游1000bp的序列信息。利用megalign软件进行序列比对，确定s 基因上、下游序列中保守片段。参照ncbi中犬冠状病毒hlj-071毒株(genebank登录号为ky063616.1)基因组序列，s基因位全长从20284nt-24648nt，通过引物设计软件primer premier 5.0设计用于s结构蛋白核苷酸序列扩增引物。上游引物ccov-s1从20201nt-20222nt(22nt)，下游引物ccov-s2从2 4758nt-24775nt(18nt)，上游引物距离s基因起始位点62bp，下游引物距离 s基因终止位点引物110bp，序列覆盖整个s基因，且位于犬冠状病毒保守区域，并采用ncbi中primer blast功能进行引物评估，发现部分ccov毒株中上游引物gttggattactaaggaagggta中第18位“g”为“a”，故形成上游序列gttggattactaaggaaaggta。
[0035]
上游引物ccov-s1：gttggattactaaggaarggta；seq id no.1；
[0036]
其中，r为a或g；
[0037]
下游引物ccov-s2：gtacagcgtctacggatg；seq id no.2。
[0038]
实施例2
[0039]
一种犬冠状病毒s基因全序列扩增方法，包括以下步骤:
[0040]
步骤一、提取病毒rna：取适量猪流行性腹泻病毒阳性的粪便病料，加入9倍体积的无菌pbs，匀浆后于-20℃保存；反复冻融3次，采用trizol试剂法提取病毒rna；
[0041]
所述trizol试剂法的具体方法为：所述trizol试剂法的具体方法为：a、取1ml组织悬液，于4℃，经8000rpm离心10min，获得第一上清液；b、取300μl第一上清液于无rna酶的灭菌1.5mlep管中，加入1000μltrizol，充分混匀，25℃静置5min；c、加入200μl，充分混匀，25℃静置5min，于4℃，经12000rpm离心10min，获得第二上清液；d、取500μl第二上清液至新的1.5mlep管中，加入500μl异丙醇，充分混匀，-20℃静置20min，于4℃，经12000rpm离心10min；e、小心弃掉上清，加入1000ul75％的乙醇(depc水配置)，震荡混匀后，4℃12000r离心10min；f、小心倒掉上清液，倒置于吸水纸上，25℃自然风干；g、加入30μl无rnaseddh2o，溶解沉淀，即为病毒rna，将样品保存于-80℃。
[0042]
步骤二、cdna合成：采用ⅲ1ststrandcdnasynthesiskit(gdnadigesterplus)试剂盒对提取的病毒rna进行反转录，获得cdna；
[0043]
步骤三、pcr扩增：
[0044]
使用上游引物ccov-s1和下游引物ccov-s2对cdna进行pcr扩增，得到含有s基因全序列片段的pcr扩增产物。
[0045]
上游引物ccov-s1：gttggattactaaggaarggta；seqidno.1；
[0046]
其中，r为a或g；
[0047]
下游引物ccov-s2：gtacagcgtctacggatg；seqidno.2。
[0048]
所述pcr扩增反应体系为：
[0049][0050]
上游引物ccov-s1的浓度为10pmol/μl，下游引物ccov-s2的浓度为10pmol/μl；
[0051]
所述pcr扩增反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸5min，设置35个循环；72℃终延伸10min；
[0052]
步骤四、基因片段检测及测序：将所述pcr扩增产物经核酸凝胶电泳进行检测，电泳结果如图1中的泳道1所示，该样品中扩增出大小约为4575bp的单一条带；将目的片段采用fastpuregeldnaextractionminikit试剂盒进行纯化，再送至深圳华大基因股份有限公司进行测序，测序结果如seqidno.3所示。命名该病料样品中含有的ccov毒株为bx71。
[0053]
实施例3
[0054]
一种犬冠状病毒s基因全序列扩增方法，步骤一采用的病料为犬冠状病毒阳性的粪便，上游引物为gttggattactaaggaagggta；seqidno:3，其余步骤同实施例2，在基因片段检测及测序步骤中，电泳结果如图1中的泳道2所示，测序结果如seqidno.4所示。命名该病料样品中含有的ccov的毒株为bd15。
[0055]
实施例4
[0056]
一种犬冠状病毒s基因全序列扩增方法，步骤一采用的病料为犬冠状病毒阳性的
粪便，上游引物为gttggattactaaggaaaggta；seq id no:4，其余步骤同实施例2，在基因片段检测及测序步骤中，电泳结果如图1中的泳道3所示，测序结果如seq id no.5所示。命名该病料样品中含有的ccov 毒株为bq25。
[0057]
实施例5
[0058]
使用本方法分离得bx71、bd15、bq25三个毒株的s基因序列，与ncbi 上已知的犬冠状病毒s基因进行比对，同源性比对毒株的名称、genebank登录号、来源及年份如表1所示。
[0059]
进化树结果如图2所示bx71、bd15、bq25毒株的s基因序列均与ccov 经典毒株z19进化距离较远，bd15与英国2020年分离的ccov毒株2020/7 进化距离较近，bq25与bx71两个毒株同源性较高，与中国2016年分离的ccov毒株hlj-071、hlj-072等进化距离较近。
[0060]
表1：同源性比对毒株
[0061]
毒株名称genebank登录号来源及年份z19mz420153.1海地，2017ccov-hupn-2018mw591993.2马来西亚，2017cb/05kp981644.1意大利，2005a76jn856008.2美国，1976ccov/ntu336/f/2008gq477367.1中国，20082020/7mt906865.1英国，20202020/15mt906864.1英国，2020hlj-073ky063618.2中国，2016hlj-072ky063617.1中国，2016hlj-071ky063616.1中国，2016s378kc175341.1美国，1978k378kc175340.1美国，1978171kc175339.1德国，1971tn-449jq404410.1雅典，20121-71jq404409.1雅典，2012
[0062]
实施例6
[0063]
在上述反应体系与反应程序中，设置退火温度为45℃、48℃、50℃、52℃、 55℃、58℃和60℃时，实验结果如图3所示，均扩增出特异性条带，目的条带大小与预期大小相符，约为4575bp。当退火温度为60℃时，特异性条带最暗；退火温度为48℃、50℃、52℃时条带都较为清晰。在pcr检测中，退火温度越高特异性越强，故选择52℃为本方法的最适退火温度。
[0064]
实施例7特异性实验
[0065]
用seq id no.1～seq id no.2所示引物对prv、ccov、fcov、pedv、 tgev、prov、pdcov、sfv、pcv、prrsv、prv、cpv模板进行检测，扩增方法同实施例2，在1％琼脂糖凝胶电泳中鉴定产物，结果如图4所示，在紫外凝胶成像系统观察结果为，仅ccov的cdna阳性样品出现特异性条带，条带大小与预期大小相符，约为4575bp，其余样品均为阴性。
[0066]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0067]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。
对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：

1.一种扩增犬冠状病毒s基因全序列的引物，其特征在于，其核苷酸序列如下:上游引物ccov-s1：gttggattactaaggaarggta；seq id no.1；其中，r为a或g；下游引物ccov-s2：gtacagcgtctacggatg；seq id no.2。2.权利要求1所述的引物制备扩增和检测犬冠状病毒s基因序列试剂盒中的应用。3.一种扩增和检测犬冠状病毒s基因序列的试剂盒，其特征在于，包括seq id no.1～seq id no.2所示的引物，其中，上游引物为1μl，浓度为10pmol/μl；下游引物为1μl，浓度是10pmol/μl。4.根据权利要求3所述的一种扩增和检测犬冠状病毒s基因序列的试剂盒，其特征在于，还包括：2
×
greentaqmix 12.5μl、cdna 1μl、ddh2o 9.5μl。5.一种扩增犬冠状病毒s基因的方法，其特征在于，提取病毒rna，反转录成cdna，以seq id no.1～seq id no.2所示的引物对cdna序列进行扩增，最后对扩增片段进行纯化。6.根据权利要求5所述的一种扩增犬冠状病毒s基因的方法，其特征在于，扩增程序为：7.根据权利要求5所述的一种扩增犬冠状病毒s基因的方法，其特征在于，所述纯化为采用fastpure gel dna extraction mini kit试剂盒进行纯化。8.一种犬冠状病毒s基因全序列扩增方法的应用，其特征在于，用于对犬冠状病毒s基因全序列的检测与分析。9.如权利要求8的应用，其特征在于，将扩增方法获得的产物，测序后，进行同源性比对，对所扩增的犬冠状病毒进行分类。10.如权利要求9的应用，其特征在于，所述同源性比对为将测序获得的序列与ncbi上已知的犬冠状病毒s基因进行比对。

技术总结

本发明公开了一种扩增犬冠状病毒S基因全序列的引物、方法和应用，引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示；方法包括以下步骤:步骤一、提取病毒RNA；步骤二、cDNA合成；步骤三、PCR扩增；步骤四、基因片段检测及测序。本发明还提供了一种犬冠状病毒S基因全序列扩增方法的应用，用于对犬冠状病毒S基因全序列的检测与分析。本公开的扩增方法，无需采用常规多对引物进行拼接的方案，通过设计1对引物即实现了犬冠状病毒S基因S基因全序列的扩增，不仅操作便捷，还可以避免在高变区域无法扩增获得目的片段的风险。的片段的风险。的片段的风险。