一种快速检测病毒基因组大小的方法及试剂盒与流程

1.本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种快速检测病毒基因组大小的试剂盒及其检测方法。

背景技术：

2.近年来，病毒类产品已经被广泛地应用于疫苗、基因、癌症等领域。其中，重组腺相关病毒(recombination adeno-associated virus,raav)由于其安全性好、宿主细胞范围广、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被认为是用于人类基因最安全的病毒载体之一，并广泛用于眼部疾病，神经肌肉疾病和中枢神经系统疾病等领域。作为一种新型的方法，为了保证基因药物的药效和稳定性，基因药物(即raav)的质量控制极为重要，这包括判别raav是否具备生物活性和用量等。目前，raav基因药物的生产方法相比20年前有很大提高，但是其质量控制方法的改进则非常有限，这可能与基因在过去的商业化进展缓慢有关。
3.腺相关病毒(aav)是一种复制缺陷的非包膜病毒，属于细小病毒科(parvoviridae)。众所周知，aav由直径约为20-26nm的二十面体蛋白衣壳和一个线性单链dna基因组组成，基因组大小约为4.7kb，既可以是正链，也可以是负(反义)链，且正链和负链都有相同的概率被包装到aav病毒颗粒中。
4.对raav基因药物的质检通常包括滴度检测、衣壳蛋白纯度检测、基因组大小及纯度检测和生物学活性检测等。传统的检测aav基因组大小主要通过southern印迹法(southern blot)来实现，这一方法步骤复杂、成本高，而且还必须使用放射性同位素，不适合用作基因药物的质量控制方法。此外，由于这些dna为单链，容易形成各种不同的二级结构，从而导致其在常规琼脂糖凝胶上迁移速率不稳定，无法成为质量控制的有效手段，因此必须使用变性琼脂糖凝胶电泳，使得这些dna都变成无二级结构的单链后才能判断其分子量大小，从而使得实验方法变得非常繁琐，而且由于必须使用变性胶，对实验条件的要求也增加。目前，仍没有一种简单快速的方法来实现病毒基因组dna的可视化，特别是很难满足raav基因药物质控检测的需求，因此亟需提出有效的解决方案。

技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明旨在克服现有技术的不足之处而提供一种快速、高效、简便，在常规实验条件下，即可检测出细小病毒科病毒的基因组大小的快速检测试剂盒及检测方法。
6.为实现前述目的，本发明提供如下技术方案：
7.一种快速检测病毒基因组大小的方法，在样本中加入裂解液或其稀释液，以将病毒的基因组单链dna(正链或负链)从其衣壳中释放出来，并且变为比单链dna更加稳定的双链dna后进行琼脂糖凝胶电泳检测；所述的病毒选自细小病毒科病毒。
8.作为本发明的一种优选，所述方法包括向病毒样品中加入裂解液或其稀释液，使
样品中的病毒衣壳裂解，再使用琼脂糖凝胶进行电泳分析；所述的裂解液以水为溶剂，选自以下任意一种：
9.(1)去污剂；
10.(2)去污剂和nacl组成；
11.(3)由去污剂、nacl以及螯合剂组成；
12.(4)由去污剂、nacl、螯合剂以及其他添加剂组成；
13.加入裂解液后，使去污剂在系统中的终浓度为0.01～0.1％，nacl在系统中的终浓度为0～0.2m，螯合剂在系统中的终浓度为0～6mm。
14.作为本发明的进一步优选，所述的去污剂选自温和去污剂，优选十二烷基硫酸鈉(sds)、聚山梨醇酯20(吐温-20)、tritonx 100、proteinase k或其混合物；更进一步优选sds。
15.作为本发明的进一步优选，所述的螯合剂为edta。
16.作为本发明的更进一步优选，sds在系统中的终浓度为0.03～0.1％，最优选0.05％。
17.作为本发明的更进一步优选，nacl在系统中的终浓度为0.02～0.08m，优选0.05m。
18.作为本发明的更进一步优选，edta在系统中的终浓度为3～6mm，优选5mm。
19.在本发明的一些优选实施例中，所述裂解液由0.5％sds、0.5m nacl和50mm edta组成。
20.作为本发明的一种优选，所述合适的条件为70～100℃加热处理之后在冰上或室温冷却。本发明的加热温度为使蛋白裂解的适宜温度。
21.作为本发明的进一步优选，所述合适的条件为90～100℃加热10～15min之后在室温冷却10～15min；优选95℃加热10min之后在室温冷却10min。
22.本发明所述的病毒优选腺相关病毒。
23.一种病毒裂解液，选自以下任意一种：
24.(1)0.01％～1％去污剂；
25.(2)由0.01％～1％去污剂和0.01m～2m nacl组成；
26.(3)由0.01％～1％去污剂、0.01m～2m nacl以及1.5mm～100mm螯合剂组成；
27.作为本发明的一种优选，所述的去污剂选自温和去污剂，优选十二烷基硫酸鈉(sds)、聚山梨醇酯20(吐温-20)、tritonx 100、proteinase k或其混合物；更进一步优选sds。
28.作为本发明的一种优选，所述的螯合剂为edta。
29.作为本发明的进一步优选，sds浓度为0.3％～1％，最优选0.5％。
30.作为本发明的进一步优选，nacl浓度为0.2～0.8m，更进一步优选0.5m。
31.作为本发明的进一步优选，edta浓度为30～60mm，更进一步优选50mm。
32.作为本发明的最佳优选，所述裂解液由0.5％sds、0.5m nacl和50mm edta组成。
33.一种检测病毒基因组大小的试剂盒，其特征在于包含本发明所述的病毒裂解液。
34.作为本发明的一种优选，所述的裂解液由0.5％sds、0.5m nacl和50mm edta组成。
35.作为本发明的一种优选，所述的试剂盒，还包含6x dna凝胶上样缓冲染料。
36.本发明的试剂盒可以根据需要追加含有用于各成分的混合的管、微孔板、试纸条
和记载使用方法的指示资料等。检测系统可以为具有荧光读数、化学发光读数、放射读数等功能的仪器。可选的，检测系统还包括电脑和检测分析软件。
37.传统的检测aav基因组大小主要通过southern blot实现，这一方法步骤复杂，成本高，而且还必须使用用放射性同位素，不适合用作基因药物的质量控制方法。此外，由于这些dna为单链，容易形成各种不同的二级结构，从而导致其在常规琼脂糖凝胶上迁移速率不稳定，无法成为质量控制的有效手段，必须使用变性琼脂糖凝胶电泳，使得这些dna都变成单链后才能判断其分子量大小，使得实验方法变得非常繁琐，而且由于必须使用变性胶，对实验条件的要求也增加。本发明试剂盒的优点主要是：快速、高效、简便，并且能够保持单链dna的稳定；本发明采用普通的实验试剂、材料和方法，在常规实验条件下，就能检测出腺相关病毒的基因组大小，该方法是目前唯一的检测腺相关病毒基因药物基因组大小的有效手段。
38.有益效果：
39.(1)本发明提供的腺相关病毒基因组检测方法及试剂盒能够提供更为清晰的电泳成像结果，兼具条带提亮、背景值降低以及减少样品残留孔道等优势。
40.(2)本发明提供的腺相关病毒基因组检测方法及试剂盒使用的材料单纯且易于取得，同时对实验环境要求低，具有快速、简易性、有效性、实用性等优点。
附图说明
41.图1：包含图1a和图1b，显示经裂解液1、11、12、13分别处理aav2-gfp样品后进行琼脂糖凝胶电泳的结果图，并以水(h2o)作为负对照，aav2衣壳作为阴性对照。图1a为电泳结果图；图1b为图1a中实验组(aav2-gfp)的条带量化结果。
42.图2：包含图2a和图2b，显示经裂解液1、2、14分别处理aav2-gfp样品后进行琼脂糖凝胶电泳的结果图，并以aav2衣壳作为阴性对照。图2a为电泳结果图；图2b为图2a中实验组(aav2-gfp)的条带量化结果。
43.图3：包含图3a和图3b，显示经裂解液2、3、4、5分别处理aav2-gfp样品后进行琼脂糖凝胶电泳的结果图，并以aav2衣壳作为阴性对照。图3a为电泳结果图；图3b为图3a中实验组(aav2-gfp)的条带量化结果。
44.图4：包含图4a和图4b，显示经裂解液2、6、7分别处理aav2-gfp样品后进行琼脂糖凝胶电泳的结果图，并以aav2衣壳作为阴性对照。图4a为电泳结果图；图4b为图4a中实验组(aav2-gfp)的条带量化结果。
45.图5：包含图5a和图5b，显示经裂解液5处理后，分别在4℃(冰上)、25℃(室温)或37℃回温的样本经琼脂糖凝胶电泳的结果图，并以aav2衣壳作为阴性对照。图5a为电泳结果图；图5b为图5a中实验组(aav2-gfp)的条带量化结果。
46.图6：包含图6a和图6b，显示分别经过95℃加热或不加热的样本经琼脂糖凝胶电泳的结果图，并以aav2衣壳作为阴性对照。图6a为电泳结果图，其中样品条件由左到右依序为：(1)h2o处理、未加热，(2)h2o处理、95℃加热10分钟、未冷却，(3)h2o处理、95℃加热10分钟、室温冷却10分钟，(4)裂解液2处理、95℃加热10分钟、室温冷却10分钟；图6b为图6a中实验组(aav2-gfp)的条带量化结果。
47.图7：包含图7a和图7b，显示经裂解液4、8、9、10分别处理aav2-gfp样品后进行琼脂
糖凝胶电泳的结果图，并以aav2衣壳作为阴性对照。图7a为电泳结果图；图7b为图7a中实验组(aav2-gfp)的条带量化结果。
48.图8：经裂解液15、16、17分别处理aav2-gfp样品后进行琼脂糖凝胶电泳的结果图，并以aav2衣壳作为阴性对照电泳结果图。
49.图9为经2x裂解液10(泳道1)、未稀释的裂解液10(泳道2)分别处理aav2-gfp样品后进行琼脂糖凝胶电泳的结果图，并以aav2衣壳作为阴性对照电泳结果图。
50.图10为双链dna对照(泳道1)、经2x裂解液10处理aav2-gfp样品(泳道2)、未经处理的aav2-gfp样品(泳道2)、单链dna对照(泳道4)进行琼脂糖凝胶电泳的结果图，其中使用的染料为可以同时染单链dna和双链dna的染料sybr green(solarbio)。
具体实施方式
51.以下结合附图与具体实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护内容不局限于以下实施例。还应该理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求及其任何等同物为本发明的保护范围。在本发明的说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均为本领域技术人员的普遍知识和公知常识，或按照制造厂商所建议的条件。如无特别说明，实施例所用的所有材料和试剂均为市售产品。
52.本发明快速检测aav基因组大小的试剂盒包括：
53.(1)6x dna凝胶上样缓冲染料(6x dna gel loading purple dye,new england biolabs,pn b7024)；
54.(2)裂解液(lysis buffer)，组成成分见下表。
55.[0056][0057]
实施例1不同去污剂裂解病毒的效果测试
[0058]
步骤1：配制裂解液1、11、12、13。
[0059]
步骤2：室温回温样品、打开金属浴。
[0060]
步骤3：配制1％琼脂糖凝胶
[0061]
(1)准确称量0.25g琼脂糖，倒入锥形瓶中；
[0062]
(2)用专门的量筒量取约25ml tae(避免加热时蒸发使胶浓度过高)，倒入锥形瓶中，轻轻摇晃使混匀，不要过于用力防止药粉沾到杯壁上不利于后面的溶解；
[0063]
(3)混匀，放入微波炉中加热，至锥形瓶中液体开始沸腾并等待些许时间，至溶液澄清透明(可取出观察，若看到颗粒状物质继续加热)，加热时间不宜过久，防止液体蒸干(共约2分钟)。
[0064]
(4)取出放置稍许冷却，待手可以碰触的温度时，加入1μl染液gelred(若染液为goldenview则只需加0.1μl，可以凭经验判定，避免溶液过黄)，加染液时量比较少所以会粘在头上不易打下去，可以将染液打在杯壁上然后晃动锥形瓶使其溶解。
[0065]
(5)最将琼脂糖凝胶取出，根据经验，一般冷却30分钟即可；
[0066]
(6)清洗锥形瓶时若残留凝胶不易清洗可加入少量水微热后直接倒入废液缸，最后跑完的胶要用手套包裹后丢弃或统一回收。
[0067]
步骤4：处理待检测腺相关病毒
[0068]
(1)将裂解液1、11、12、13分别稀释至2x；
[0069]
(2)实验组样品配置：取5μl室温回温的aav2-gfp样品(2
×
10
10
/μl)，分别与5μl的2x裂解液1、11、12、13或水混合；
[0070]
(3)阴性对照组样品配置：取5μl室温回温的aav2衣壳(空壳)样品，分别与5μl的2x裂解液1、11、12、13或水混合，并以5μl aav2衣壳样品加5μl的2x裂解液1、11、12、13作为负对照组；
[0071]
(4)将步骤(2)和(3)的样品进行95℃金属浴处理10分钟；
[0072]
(5)室温冷却10分钟。
[0073]
步骤5：进行琼脂糖凝胶电泳
[0074]
(1)冷却后的样品中加入2μl 6x dna gel loading purple dye；
[0075]
(2)取3μl的5k marker加入第一个孔道中；
[0076]
(3)取8μl样品依次加入孔道中；
[0077]
(4)100v 200ma条件下电泳50分钟；
[0078]
(5)在凝胶成像仪下照相，aav2-gfp的基因组大小约为3.2kb(图1a)，并使用imagej计算图1a中aav2-gfp实验组的每个裂解液与负对照组的比值(图1b)。
[0079]
分别用裂解液1、11、12、13处理的样本经琼脂糖凝胶电泳所得到的结果如图1a所示，aav2-gfp实验组中，裂解液1相较负对照和裂解液11、12、13具有更明显的条带，并且除了裂解液1之外，其他处理条件的aav2-gfp都有大量样品残留在孔道中；图1b为将图1a中aav2-gfp实验组的电泳结果条带进行量化的结果，可以发现裂解液1和12相对于负对照组具有显著差异，而裂解液1的效果明显更胜裂解液12。综上，实验结果显示sds(裂解液1)有效裂解病毒衣壳的效果最为优异。
[0080]
实施例2 sds最佳浓度测试
[0081]
配制裂解液1、2、14，实验条件及方法参照实施例1。
[0082]
分别用裂解液1、2、14处理的样本经琼脂糖凝胶电泳所得到的结果如图2a所示，aav2-gfp实验组中，裂解液2和14相较裂解液1具有更明显的条带，但裂解液14的条带背景值较高，呈现条带拖曳的情形；图2b为将图2a中aav2-gfp实验组的电泳结果条带进行量化的结果，以裂解液1为基准计算比值，可以发现裂解液2和14相对于裂解液1具有显著差异，裂解液14的效果略优于裂解液2，但综合考虑电泳的成像结果，0.05％sds(裂解液2)是比较合适的浓度。
[0083]
实施例3 nacl最佳浓度测试
[0084]
配制裂解液2-7，实验条件及方法参照实施例1。
[0085]
分别用裂解液2-7处理的样本经琼脂糖凝胶电泳所得到的结果如图3a和4a所示，aav2-gfp实验组中，裂解液2处理的条带背景值相对其他实验组为高，而裂解液6和7处理的aav2-gfp有大量样品残留在孔道中；图3b和4b分别为将图3a和4a中aav2-gfp实验组的电泳结果条带进行量化的结果，以裂解液2为基准计算比值，可以发现裂解液4-7相对于裂解液2具有显著差异，其中以裂解液4的效果相对较好，综合考虑电泳的成像结果，0.05％sds添加0.05m nacl(裂解液4)能够进一步提高条带亮度，同时减少条带拖曳的情形。
[0086]
实施例4样品冷却条件测试
[0087]
步骤1：配制裂解液4。
[0088]
步骤2：室温回温样品、打开金属浴。
[0089]
步骤3：配制1％琼脂糖凝胶，方法同实施例1。
[0090]
步骤4：处理待检测样品
[0091]
(1)将裂解液4稀释至2x；
[0092]
(2)实验组样品配置：取5μl室温回温的aav2-gfp样品(2
×
10
10
/μl)，分别与5μl的2x裂解液4混合；
[0093]
(3)阴性对照组样品配置：取5μl室温回温的aav2衣壳(空壳)样品，分别与5μl的2x裂解液4混合；
[0094]
(4)将步骤(2)和(3)的样品进行95℃金属浴处理10分钟；
[0095]
(5)将步骤(4)样品进行分别冰上冷却10分钟、室温(25℃)冷却10分钟，或37℃冷却10分钟。
[0096]
步骤5：进行琼脂糖凝胶电泳
[0097]
(1)冷却后的样品中加入2μl 6x dna gel loading purple dye；
[0098]
(2)取3μl的5k marker加入第一个孔道中；
[0099]
(3)取8μl样品依次加入孔道中；
[0100]
(4)在电压100v，电流200ma条件下电泳50分钟；
[0101]
(5)在凝胶成像仪下照相。
[0102]
用裂解液4处理的样本经琼脂糖凝胶电泳所得到的结果如图5a所示，使用裂解液4处理的aav2-gfp样品，在4℃(冰上)、25℃(室温)或37℃皆可以获得清楚的条带；图5b为将图5a中aav2-gfp实验组的电泳结果条带进行量化的结果，以4℃的条件为基准计算比值，可以发现三个冷却条件并未有显著差异，由此可以证明本发明裂解液的效果并不受冷却样品环境的温度影响。
[0103]
实施例5样品裂解条件测试
[0104]
步骤1：配制裂解液2。
[0105]
步骤2：室温回温样品、打开金属浴。
[0106]
步骤3：配制1％琼脂糖凝胶，方法同实施例1。
[0107]
步骤4：处理待检测样品
[0108]
(1)将裂解液2稀释至2x；
[0109]
(2)实验组样品配置：取5μl室温回温的aav2-gfp样品(2
×
10
10
/μl)与5μl的2x裂解液2或水混合；
[0110]
(3)阴性对照组样品配置：取5μl室温回温的aav2衣壳(空壳)样品与5μl的2x裂解液2或水混合，并以5μl aav衣壳样品加5μl的2x裂解液2作为负对照组；
[0111]
(4)将步骤(2)和(3)的样品进行95℃金属浴处理10分钟或不加热；
[0112]
(5)室温(25℃)冷却10分钟或不冷却。
[0113]
步骤5：进行琼脂糖凝胶电泳
[0114]
(1)冷却后的样品中加入2μl 6x dna gel loading purple dye；
[0115]
(2)取3μl的5k marker加入第一个孔道中；
[0116]
(3)取8μl样品依次加入孔道中；
[0117]
(4)在电压100v，电流200ma条件下电泳50分钟；
[0118]
(5)在凝胶成像仪下照相。
[0119]
琼脂糖凝胶电泳所得到的结果如图6a所示，样品条件由左到右依序为：(1)h2o处理，未加热；(2)h2o处理，95℃加热10分钟，未冷却；(3)h2o处理，95℃加热10分钟，室温冷却10分钟；(4)裂解液2处理，95℃加热10分钟，室温冷却10分钟。aav2-gfp实验组中，使用裂解液2处理并经95℃加热10分钟可以获得最清晰的条带，并且没有大量样品残留在孔道中的情况；图6b为将图6a中aav2-gfp实验组的电泳结果条带进行量化的结果，以h2o+未加热的
条件为基准计算比值，可以发现加热样品能够造成显著差异，并且以裂解液2处理+95℃加热的条件效果最佳，由此可以证明95℃高温能够破坏病毒蛋白衣壳，使单链基因组dna释放出来。
[0120]
实施例6 edta最佳浓度测试
[0121]
配制裂解液4、8、9、10，实验条件及方法参照实施例1。
[0122]
分别用裂解液4、8、9、10处理的样本经琼脂糖凝胶电泳所得到的结果如图7a所示，aav2-gfp实验组中，裂解液10处理的条带最为清晰明亮；图7b为将图7a中aav2-gfp实验组的电泳结果条带进行量化的结果，以裂解液4为基准计算比值，可以发现裂解液8-10相对于裂解液4皆具有显著差异，其中以裂解液10的效果相对较好，由此可证明添加edta促进了双链dna的形成，使得条带进一步清晰提亮，而体系中添加终浓度为0.05％sds、0.05m、5mm edta(添加裂解液10)是最佳的方案。
[0123]
实施例7合理浓度范围内裂解液测试
[0124]
步骤1：配制裂解液10、15、16、17。
[0125]
步骤2：室温回温样品、打开金属浴。
[0126]
步骤3：配制1％琼脂糖凝胶
[0127]
(1)准确称量0.25g琼脂糖，倒入锥形瓶中；
[0128]
(2)用专门的量筒量取约25ml tae(避免加热时蒸发使胶浓度过高)，倒入锥形瓶中，轻轻摇晃使混匀，不要过于用力防止药粉沾到杯壁上不利于后面的溶解；
[0129]
(3)混匀，放入微波炉中加热，至锥形瓶中液体开始沸腾并等待些许时间，至溶液澄清透明(可取出观察，若看到颗粒状物质继续加热)，加热时间不宜过久，防止液体蒸干(共约2分钟)。
[0130]
(4)取出放置稍许冷却，待手可以碰触的温度时，加入1μl染液gelred(若染液为goldenview则只需加0.1μl，可以凭经验判定，避免溶液过黄)，加染液时量比较少所以会粘在头上不易打下去，可以将染液打在杯壁上然后晃动锥形瓶使其溶解。
[0131]
(5)最将琼脂糖凝胶取出，根据经验，一般冷却30分钟即可；
[0132]
(6)清洗锥形瓶时若残留凝胶不易清洗可加入少量水微热后直接倒入废液缸，最后跑完的胶要用手套包裹后丢弃或统一回收。
[0133]
步骤4：处理待检测腺相关病毒
[0134]
(1)将裂解液15、16、17分别稀释至2x；
[0135]
(2)实验组样品配置：取5μl室温回温的aav2-gfp样品(2
×
10
10
/μl)，分别与5μl的2x裂解液15、16、17混合；
[0136]
(3)阴性对照组样品配置：取5μl室温回温的aav2衣壳(空壳)样品，分别与5μl的2x裂解液15、16、17混合，并以5μl aav2衣壳样品加5μl的2x裂解液15、16、17作为负对照组；
[0137]
(4)将步骤(2)和(3)的样品进行95℃金属浴处理10分钟；
[0138]
(5)室温冷却10分钟。
[0139]
步骤5：进行琼脂糖凝胶电泳
[0140]
(1)冷却后的样品中加入2μl 6x dna gel loading purple dye；
[0141]
(2)取3μl的5k marker加入第一个孔道中；
[0142]
(3)取8μl样品依次加入孔道中；
[0143]
(4)100v 200ma条件下电泳50分钟；
[0144]
(5)在凝胶成像仪下照相，结果如图8所示，有图可见aav2-gfp实验组中，合理范围内的裂解液均可起效。
[0145]
实施例8
[0146]
步骤1：配制裂解液10。
[0147]
步骤2：室温回温样品、打开金属浴。
[0148]
步骤3：同实施例7。
[0149]
步骤4：处理待检测腺相关病毒
[0150]
(1)将裂解液10分为两份，一份不稀释(10x)，一份稀释至2x；
[0151]
(2)实验组样品配置：孔道1样品：取5μl室温回温的aav2-gfp样品(1
×
10
11
)，与5μl的2x裂解液10混合；孔道2样品：取9μl室温回温的aav2-gfp样品(1
×
10
11
)，与1μl的未经稀释的裂解液10混合；
[0152]
(3)阴性对照组样品配置：取5μl室温回温的aav2衣壳(空壳)样品，与5μl的2x裂解液10混合作为孔道1的阴性对照，并取9μl室温回温的aav2衣壳(空壳)样品，与1μl的未经稀释的裂解液10混合作为孔道2的阴性对照；
[0153]
(4)将步骤(2)和(3)的样品进行95℃金属浴处理10分钟；
[0154]
(5)室温冷却10分钟。
[0155]
步骤5：同实施例7
[0156]
结果如图9所示，由图可见根据体系中不同浓度的病毒，裂解液或其稀释液均能很好的测定其分子量大小。
[0157]
实施例9
[0158]
步骤1：配制裂解液10。
[0159]
步骤2：室温回温样品、打开金属浴。
[0160]
步骤3：配制1％琼脂糖凝胶
[0161]
(1)准确称量0.25g琼脂糖，倒入锥形瓶中；
[0162]
(2)用专门的量筒量取约25ml tae(避免加热时蒸发使胶浓度过高)，倒入锥形瓶中，轻轻摇晃使混匀，不要过于用力防止药粉沾到杯壁上不利于后面的溶解；
[0163]
(3)混匀，放入微波炉中加热，至锥形瓶中液体开始沸腾并等待些许时间，至溶液澄清透明(可取出观察，若看到颗粒状物质继续加热)，加热时间不宜过久，防止液体蒸干(共约2分钟)。
[0164]
(4)取出放置稍许冷却，待手可以碰触的温度时，加入2.5μl染液sybr green(solarbio)，此染料可同时染单链dna和双链dna，加染液时量比较少所以会粘在头上不易打下去，可以将染液打在杯壁上然后晃动锥形瓶使其溶解。
[0165]
(5)最将琼脂糖凝胶取出，根据经验，一般冷却30分钟即可；
[0166]
(6)清洗锥形瓶时若残留凝胶不易清洗可加入少量水微热后直接倒入废液缸，最后跑完的胶要用手套包裹后丢弃或统一回收。
[0167]
步骤4：处理待检测腺相关病毒
[0168]
(1)将裂解液10稀释至2x；
[0169]
(2)实验组样品配置：取5μl室温回温的aav2-gfp样品(2
×
10
10
/μl)，与5μl的2x裂
解液10混合；
[0170]
(3)阴性对照组样品配置：取5μl室温回温的aav2-gfp样品(2
×
10
10
/μl)，与5μl的ddh2o混合；
[0171]
(4)将步骤(2)和(3)的样品进行95℃金属浴处理10分钟；
[0172]
(5)室温冷却10分钟。
[0173]
(6)双链dna片段(5kb)、单链环形m13 mp18 single strand dna片段(3.5kb)为正对照
[0174]
步骤5：进行琼脂糖凝胶电泳
[0175]
(1)冷却后的样品中加入2μl 6x dna gel loading purple dye；
[0176]
(2)取3μl的5k marker加入第一个孔道中；
[0177]
(3)取8μl样品依次加入孔道中；
[0178]
(4)100v 200ma条件下电泳50分钟；
[0179]
(5)在凝胶成像仪下照相；
[0180]
结果见图10，由图可见未经裂解液10处理的aav2-gfp(2
×
10
10
/μl)，其一部分形成了双链，分子量大小为3.2kb，一部分仍然为单链分子量大小为1.6kb(泳道3)，经裂解液10处理的aav2-gfp(2
×
10
10
/μl)，分子量大小为3.2kb(泳道2)，说明经本发明裂解液处理后其可形成稳定的双链。从泳道1和2和泳道3和4的强度对照可看出，正对照双链dna和经裂解液处理的aav2-gfp样本条带更为明亮，表明双链的稳定性强于单链。，实验结果显示本发明所涉及的裂解液可以将病毒的基因组单链dna变为比单链dna更加稳定的双链dna，更易进行电泳检测。
[0181]
本发明提及的所有文献都在本技术中全文引用作为参考。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式的修改同样落于本技术权利要求书所限定的范围。

技术特征：

1.一种快速检测病毒基因组大小的方法，其特征在于，在样本中加入裂解液或其稀释液，以将病毒的基因组从其衣壳中释放出来，并且由单链(正链或负链)dna变为更加稳定的双链dna后进行琼脂糖凝胶电泳检测；所述的病毒选自细小病毒科病毒。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括向病毒样品中加入裂解液或其稀释液，使样品中的病毒衣壳裂解，再使用琼脂糖凝胶进行电泳分析；所述的裂解液以水为溶剂，选自以下任意一种：(1)去污剂；(2)去污剂和nacl组成；(3)由去污剂、nacl以及螯合剂组成；其中，加入裂解液后，使去污剂在系统中的终浓度为0～0.1％，nacl在系统中的终浓度为0～0.2m，螯合剂在系统中的终浓度为0～6mm。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的去污剂选自温和去污剂，优选十二烷基硫酸鈉(sds)、吐温～20、tritonx 100、proteinase k或其混合物；更进一步优选sds。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的螯合剂为edta。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，sds在系统中的终浓度为0.03％～0.1％，优选0.05％。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，nacl在系统中的终浓度为0.02～0.08m，优选0.05m。7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，edta在系统中的终浓度为3～6mm，优选5mm。8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，所述裂解液由0.5％sds、0.5m nacl和50mm edta组成。9.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，所述合适的条件为70～100℃加热处理之后在冰上或室温冷却。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述合适的条件为90～100℃加热10～15min之后在室温冷却10～15min；优选95℃加热10min之后在室温冷却10min。11.一种病毒裂解液，其特征在于，以水为溶剂，选自以下任意一种：(1)0.01％～1％去污剂；(2)由0.01％～1％去污剂和0.01m～1m nacl组成；(3)由0.01％～1％去污剂、0.01m～1m nacl以及1.5mm～100mm螯合剂组成。12.根据权利要求11所述的病毒裂解液，其特征在于，所述的去污剂选自温和去污剂，优选十二烷基硫酸鈉、聚山梨醇酯20(吐温～20)、tritonx 100、proteinase k或其混合物；更进一步优选sds。13.根据权利要求1所述的病毒裂解液，其特征在于，所述的螯合剂为edta。14.根据权利要求12所述的病毒裂解液，其特征在于，sds浓度为0.3％～1％，优选0.3％～0.6％，进一步优选0.5％。15.根据权利要求11所述的病毒裂解液，其特征在于，nacl浓度为0.2～0.8m，优选0.5m。16.根据权利要求11所述的病毒裂解液，其特征在于，edta浓度优选30～60mm，优选
50mm。17.根据权利要求11～16中任一项所述的病毒裂解液，其特征在于，所述裂解液由0.5％sds、0.5m nacl和50mm edta组成。18.一种检测病毒基因组大小的试剂盒，其特征在于包含权利要求11～17中任一项所述的病毒裂解液；所述的病毒选自细小病毒科病毒。

技术总结

本发明公开了一种基于琼脂糖凝胶电泳技术快速检测病毒基因组大小的方法，属于病毒检测技术领域。本发明用于检测基因组大小的试剂盒包括裂解液和上样缓冲液，其原料组分包括：5％十二烷基硫酸钠、0.5M氯化钠、50mM乙二胺四乙酸和6X DNA凝胶上样缓冲染料。采用本发明提供的检测方法省去了现有方法诸多繁琐的步骤，可以获得更为清晰的凝胶成像结果，极大地缩短了检测时间，尤其适用于快速检测细小病毒科病毒基因组的大小。本发明具有重要的应用价值，更符合基因药物开发领域病毒检测和质量控制研究工作的需要。控制研究工作的需要。控制研究工作的需要。