microRNA（miRNA）是一种机体内源性表达的单链小分子RNA，位于基因组非编码区，本身不具有开放阅读框（open reading frame，ORF），具有高度保守性，时序性和组织特异性。miRNA广泛存在于各种真核细胞中，不编码任何蛋白质，长度仅为20～24nt。成熟的miRNA 5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基，由具有发夹状结构的约70～90nt的单链RNA前体经过Dicer酶加工后形成。成熟的miRNA形成RNA诱导的基因沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）作用于靶点mRNA，通过对mRNA剪切或抑制其翻译过程而调控基因的表达。目前人们还不明确miRNA及其靶mRNA之间的作用机制。 最近有研究指出，miRNA在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作用，同时，miRNA参与了血细胞生成、胰岛素分泌、神经系统构成和人类癌细胞生长等不同的过程，因此，非常有必要开发有效的实验工具来测定miRNA。 目前检测miRNA的方法主要有Northern印迹分析，微点阵（microarray）分析和实时定量PCR（quantitative Real-Time PCR）。下面将对这三种方法做简单的介绍及比较。 1、Northern印迹分析（Northern Analysis）
Northern印迹是基于杂交检测RNA的常用方法，它是最早用于miRNA分析的几种方法之一。这种方法简单易行，大部分实验室都可以进行操作，不需要额外的资金投入与设备更新。 不足之处：
1）Northern分析的过程涉及大量人工操作，并且每次仅有一条miRNA探针与一个RNA印迹杂交，因此，它适用于不适用于大规模的筛选实验。尽管如此，在简单探究miRNA功能机理的实验中，Northern印迹分析还是能够满足研究需要的。
2）Northern印迹分析的动态范围只能达到两个数量级，这就引发了一个严重的问题，进行实验的细胞内的miRNA分子的数量要达到比较大的范围，例如，能够检测40,000个miRNA分子每细胞的印迹条件实际上却不能准确检测10个miRNA分子每细胞。另外，由于Northern印迹以杂交为原理，它通常不能有效区分具有细微序列差异的miRNA。例如，同一个家族中的miRNA let-7c与let-7a和let-7b之间仅有一个碱基的差异，导致Northern印迹分析无法清晰区分它们。此外，Northern印迹实验的重复性较弱。
3）Northern印迹耗时，耗量。进行一次miRNA检测需要3个工作日，不仅减慢了实验进程，也增加了杂交膜上信号扩散的风险。此外，Northern印迹大概需要5到10微克的总RNA量上样量才能成功检测出miRNA，增加了检测干细胞或人类初期肿瘤细胞这些稀少的样品的难度，甚至无法顺利开展实验。
2、微点阵（Microarray）分析
微点阵分析也是基于杂交的原理来检测miRNA，它通过测定特定过程中miRNA的表达水平，来分析了解miRNA的表达调控机制以及由miRNA调控的基因的表达。微点阵采用高密度的荧光标记探针与RNA样本杂交，通过荧光扫描获得表达图谱，借助相应软件进行miRNA的表达分析。由于在设计探针时可以包含所有可用miRNA序列，因此微点阵可以作到高通量的miRNA分析。
不足之处：
1）微点阵仍然需要足够的RNA初始样本，大约为每个微点阵5微克。
2）由于微点阵以杂交为基础，因此同Northern印迹一样无法清楚的区分序列差异很小的mi
RNA。另外，微点阵也很难区分具有相同序列的前体miRNA和成熟的活性miRNA。
3、定量实时PCR（Quantitative Real-time PCR）
定量实时PCR技术通过扩增技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。起始目标核酸的拷贝数越高，就越快观察到荧光强度的显著增加。定量实时PCR中TaqMan® (Roche Molecular Systems Inc., Basel, Switzerland)特异性分析依赖于两个PCR引物和一个序列特异的TaqMan探针的联合作用。这些荧光标记的探针利用Taq DNA聚合酶的5’核酸酶的活性，极大的提高了实时PCR的检测，从而使得对PCR后期加工中探针的降解分析的评估成为可能。
尽管定量实时PCR相比Northern分析和微点阵需要较少的样本，并且显著的提高了动态范围和敏感度，但是这种技术在检测miRNA时还是遇到了挑战。由于成熟miRNA长度较短，难以设计成熟miRNA的有效的特异引物和探针，于是很多研究者对较长的前体miRNA分子进行定量实时PCR检测，利用前体miRNA的水平作为成熟的活性miRNA的替代标记。然而细胞内存在的前体miRNA的水平不能有效的指示相应的成熟miRNA水平，因
此这种方法无法达到预想中的效果。
目前已有新的定量实时PCR的方法被用来解决检测miRNA中遇到的这些问题。这种新方法利用一种茎环（stem-loop）状引物进行miRNA的反转录，然后再进行定量实时PCR。这个茎环状结构对成熟的miRNA 3′ 端具有特异性，能够将非常短的成熟miRNA分子扩展并且增加一个通用的3′ 引物位点进行实时PCR。这种茎环状结构也被认为可以形成一种空间的阻碍以防止对前体miRNA进行PCR引导。然后就可以利用实时PCR进行高特异性的定量检测miRNA的表达水平。这种实时PCR的优点是：1）可以在起始样本量很小的情况下进行（RNA总量在1到10ng之间）。2）动态范围达到了7个数量级，因此可以检测大量或者少量的miRNA。3）这种方法可以区分只有一个碱基差别的miRNA。4）和传统的定量实时PCR检测相比，在实验室中生产这些新的茎环状结构是很快并且很简单的。
三种检测方法的比较
| Northern印迹 | 微点阵 | 定量实时PCR |
初始样本量 | 5～10微克 | 大约5微克 | 1～10纳克 |
敏感度 | 低 | 中等 | 高 |
特异性 | 低 | 中等 | 高 |
动态范围 | 2 logs | 4 logs | 7 logs |
通量 | 低 | 高 | 中等、高 |
实验时间 | 几天 | 几天 | 几小时 |
区分前体与成熟miRNA的可靠性 | 是（miRNA数目少时无法区分） | 否（需要额外的区分大小的步骤） | 是 |
能否区分序列差别少的miRNA | 不能 | 不能 | 能 |
| | | |
参考文献：
［1］Yingqing S, Seongjoon K, Neill W, et al.Development of a micro-array to detect human and mouse microRNAs and characterization of expression in human organs. Nucleic Acids Res,2004,32 (22): 2486～2494
［2］Caifu C, Kelly M, Ada H.W, et al. Real-time PCR:Advancing RNA Interference and MicroRNA Studies. Nucleic Acids Research, 2004,32,(22): e188
尽管早在1993年，科学家就发现了第一个microRNA，但直到2003年以后，这种小RNA分子的大作用才不断被发现。研究显示：miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达，影响了30%的基因。miRNA在多个组织中，例如正常和肿瘤组织中差异表达。因此，通过表达谱分析寻疾病相关miRNA并进行发病机理研究，最终应用于肿瘤诊断和，已经成为目前miRNA研究的重要方向。在研究中，从深度测序、miRNA芯片到通过导入化学合成的mimics/antagomirs等实现miRNA过表达和抑制，都是研究中常用的方法。同时，在miRNA研究中，生物信息学分析扮演着越来越重要的角。
下表介绍了miRNA研究和应用中科学家关注的主要科学问题以及目前常用的研究方法。
问题 | 目的 | 研究方法 | 应用 |
有哪些miRNA表达？ | miRNA表达情况 | 深度测序&生物信息学分析 生物信息学分析预测可能的miRNA，进一步验证 | 发现新的候选miRNA |
miRNA何时表达？在哪里表达？表达差异？ | miRNA表达特征 | miRNA芯片，磁珠流式细胞miRNA表达谱 qPCR对hit miRNA进行验证，Northern Blot，原位杂交等 | 发现差异miRNA，为进一步功能研究、诊断，预后判断，疗效检测等奠定基础 |
miRNA控制哪些基因？这些基因功能？所在信号通路？ | miRNA功能分析 | 生物信息学分析 qPCR对hit mRNA进行验证，Western Blot等方法检测蛋白表达水平 转入miRNA mimics观察相应mRNA&蛋白水平变化以及相关现象（miRNA低表达情况） 转入miRNA antagomirs观察相应mRNA&蛋白水平变化以及相关现象（miRNA低表达情况） | 机理研究，功能研究 |
miRNA如何控制靶miRNA | 确定结合位点 | 生物信息学分析miRNA结合靶mRNA 3ˊUTR的可能序列 构建包含miRNA结合位点（3ˊUTR）以及位点突变的萤光素酶报告载体进行验证 | 机理研究 |
miRNA功能（与特定疾病、表型的关系） | miRNA功能分析 | 细胞水平：过表达及抑制实验（见前），观察表型及现象变化以及上下游通路变化 动物模型：过表达及抑制实验（见前），观察表型及现象变化以及上下游通路变化 临床组织样本，检测miRNA表达情况与疾病相关性 | 功能研究 |
miRNA应用于诊断 | 诊断 | 选择疾病相关的一个或一组miRNA，或结合其它基因水平变化，进行q-RCR等检测 | 诊断，预后判断，疗效检测 |
miRNA应用于 |
| 转入合成的小分子miRNA模拟物（miRNA低表达情况）或拮抗剂（miRNAG高表达情况） | |
| | | |
miRNA主要研究技术
深度测序 抽提分离小分子（例如18-30nt）RNA，通过RT-PCR扩增之后，利用solexa深度测序，并进行生物信息学分析，获得miRNA表达谱。深度测序结合生物信息学分析手段，可以对海量数据进行分析，分别统计出已知的miRNA（miRNA-known）、新的miRNA（miRNA-new）以及可能的新miRNA（miRNA-cadidate new），并对新发现的miRNA进行靶基因分析，功能预测等。通过深度测序的方法，可以发现新的miRNA，为进一步的深入研究奠定基础。
miRNA芯片 利用miRNA芯片（例如Agilent miRNA芯片），可以高通量分析miRNA表达的时空特异性、不同样本（例如癌组织和癌旁组织）中miRNA的差异表达，进而进行把基因分析，功能注释、通路分析，网络分析等，以了解miRNA在疾病发生中的作用。与深度测序不同，miRNA芯片针对已知miRNA进行研究。筛选到的差异miRNA可以利用q-pCR进行验证。
q-PCR q-PCR技术可以用来检测miRNA以及其靶mRNA和相关mRNA等的检测，主要方法有茎环法和加尾法等。前者针对特定miRNA设计引物，特异性好，然而成本较高，周期长；后者采用通用引物，时间短，通量较大。
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Mimics以及Antogomirs 通常基因功能研究常常采用过表达或干涉（抑制、敲除）等方法，miRNA研究也不例外。通过导入化学合成的小分子miRNA mimics或拮抗miRNA 的antagomir，观察靶mRNA及编码蛋白表达以及细胞、动物水平的表型变化，进行信号通路研究，是目前miRNA功能研究的常用方法。
萤光素酶报告系统 在确定了靶mRNA之后，到位于3ˊ-UTR区的miRNA结合位点是研究者下一步关心的内容。通过生物信息学分析获得候选的miRNA结合区域，将野生型和结合位点突变的3ˊ-UTR序列克隆入商品化的萤光素酶报告载体（例如pMIR-REPORT? miRNA Expression Reporter Vector系统），通过观察miRNA对发光强度的影响对结合位点加以验证。
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