张展;刘昕;高峻峻;王萍;朱琳琳;史许锋;常爱民
【摘 要】目的 探讨苯丙酮尿症(PKU)患者苯丙氨酸羟化酶(pah)基因大片段缺失的情况.方法 选择2015年1月至2016年1月在郑州大学第三附属医院科研中心进行基因检测的83例苯丙酮尿症患儿为研究对象,通过Sanger测序技术和多重连接探针扩增技术(MLPA),对患儿pah基因13个外显子及其两侧的内含子剪接区的碱基序列进行分析,在测序结果的基础上,将结果与同人类基因组数据库hg19、pah突变数据库pahbase和人类基因突变数据库HGMD中的数据进行比对分析,确定患儿pah基因的大片段缺失情况.结果 在83例患儿中共检测到162个突变等位基因,其中点突变57种,大片段缺失突变6种,6种大片段缺失突变发生于pah基因的第1、4、5、6、7外显子.结论 MLPA筛查是必要的且能发现大片段缺失的有效方法,同时联合Sanger测序技术可以提高苯丙酮尿症的诊断率. 【期刊名称】《重庆医学》
【年(卷),期】2018(047)034
【总页数】5页(P4374-4378)
【关键词】苯丙酮尿症;苯丙氨酸羟化酶;大片段缺失;多重连接探针扩增技术
【作 者】张展;刘昕;高峻峻;王萍;朱琳琳;史许锋;常爱民
【作者单位】郑州大学第三附属医院检验科,河南郑州450052;郑州大学第三附属医院检验科,河南郑州450052;郑州大学第三附属医院检验科,河南郑州450052;郑州大学第三附属医院检验科,河南郑州450052;新乡医学院检验学院,河南新乡453000;河南省人民医院妇产科,河南郑州450052;郑州大学第三附属医院检验科,河南郑州450052
【正文语种】中 文
【中图分类】R394.3
苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)是新生儿最常见的氨基酸代谢障碍性疾病，是因苯丙氨酸羟化酶基因(phenylalanine hydroxylase gene,pah,612349)突变导致苯丙氨酸羟化酶(pah)活性下降或缺乏，导致血中苯丙氨酸(Phe)浓度增高并在神经系统和血中蓄积[1]，造
成严重的神经损害，影响患儿发育，甚至危及生命。据统计，我国苯丙酮尿症发病率约为1∶12 189[2]，而1985-2000年中国主要城市新生儿筛查的PKU发病率为1∶11 307[3]，而近3年河南省PKU的发病率为1∶6 356，高于全国平均水平[4]。本课题组使用MLPA技术联合Sanger测序,对河南省人中PKU患者进行pah基因研究，可为PKU患者的诊断以及家系的深入研究提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2015年1月至2016年1月在郑州大学第三附属医院科研中心进行基因诊断的高苯丙氨酸血症的患儿，通过Phe负荷试验、BH4负荷试验、尿液蝶呤谱分析确诊分型并排除其他代谢性疾病的83例PKU患儿及其父母为研究对象。83例患儿的男女性别比例为41∶42，年龄30 d至10岁。所有受试者检测均获得患儿监护人的知情同意，并且符合医院人体试验伦理委员会所制定的伦理学标准，得到该委员会批准。
1.2 方法
1.2.1 外周血DNA提取 EDTA抗凝全血采用QIAamp® DNA Blood Mini Kit (批号：51106，德国Qiagen公司)按照该试剂盒的DNA提取操作说明书进行外周血样本的基因组DNA提取，所得样本基因组DNA经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后保存于-80 ℃超低温冷藏箱中备用。
1.2.2 PCR扩增、基因测序和序列分析比对 在ABI 9700 PCR(美国Applied Biosystems公司)仪上进行聚合酶链式反应，采用20 μL的PCR总反应体系，其中2*Master Mix(TIANGEN)10 μL，上下游引物(表1)各0.4 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s(30次循环)，72 ℃ 10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物片段的大小，确定有目的片段并且同引物设计的目的片段大小一致后在ABI 3730测序仪上进行测序，测序结果的峰图以及序列比对分别采用Chromas Pro 2.1.3和Vector NTI Explorer进行。
1.2.3 多重连接探针扩增(MLPA)法检测pah基因大片段缺失 使用SALSA MLPA probemix P055-D1 pah kit(MRC-Holland公司，荷兰)对测序无法进行基因分型的PKU患者外周血基因组DNA标本进行pah基因大片段缺失检测，该试剂盒含有38个探针，其中pah基因所在区
域(chromosome 12q23.2)探针22个，上下游探针各1个，参考序列探针14个。MLPA反应参照试剂盒说明书进行，反应产物在ABI3500基因测序仪上进行毛细管电泳，电泳结果采用MLPA专用数据软件Coffalyser进行分析，拷贝数的判定根据同内参照序列电泳峰面积的比值确定：正常2拷贝比值范围为0.7～1.3；3拷贝(杂合重复突变)比值范围为1.4～1.7；单拷贝(杂合缺失突变)比值范围为0.3～0.6；纯合缺失突变的比值范围为0～0.2。
表1 PCR扩增和测序引物基因引物序列(5'-3')片段长度(bp)EXON 1F:AGG TGA CCT GGA GCA TCCR:GGA TCT CTT TCT CTG GAG GC294EXON 2F:GAA AGA GTT CAT GCT TGC TTT GTC CR:GCT CAA ATT CAA ATC TGC CTG TTC C329
续表1 PCR扩增和测序引物基因引物序列(5'-3')片段长度(bp)EXON 3F:GTT AGG TTT TCC TGT TCT GGR:CTT ATG TTG CAA AAT TCC TC358EXON 4F:GTT CTG CCA ATC TGT ACT CAG GR:GTA GAG AAG GTA AGA GGA AGG G258EXON 5F:GGG AAG GAG ACA TGC ACT GTC ATG GR:AAC TGG ATG AGG GCA AGG GAG AAG C307EXON 6F:CAC AGG TTC TGG TCC CCG ACR:CAC AGG TTC TGG TCC CCG AC402EXON 7F:ACT ACC TAA AGG TCT CCT AGT GCR:CAA ACC TCA TTC TTG CAG CAG G367E
XON 8F:TGA GTC TGG CTT GGC TTA AAC CR:GGT GGG ATC ATA GAA CTG TAC C294EXON 9F:TAT GTG GGC TGT TCT GAA GGR:AGT TTC AAA GAC CTG AGG GC285EXON 10F:GTA TCC CTT CAT CCA GTC AAG GR:CCC AGG TTG CAT ATC AAA ACG G378EXON 11F:AAG GAA TCG GGG TGA GAT GAG AGA AGG GGCR:GGTACAAAGTTGCTGTAGACATTGGAGTCC398EXON 12F:ATG CCA CTG AGA ACT CTC TTR:AGT CTT CGA TTA CTG AGA AA245EXON 13F:GAC ACT TGA AGA GTT TTT GCR:TTT TCG GAC TTT TTC TGA TG195
2 结 果
2.1 河南省PKU患儿pah基因点突变检测结果
在对确诊的83例PKU患儿中，对其pah基因13个外显子及其双侧剪接区进行测序分析：在166条染体中共检测到62种，162个基因突变，突变检出率为97.61%。83例患儿中有4例只检测出1条染体上等位基因的突变，6例患儿检测到6个大片段缺失型杂合突变，3例患儿为纯合型突变，其余70例患儿均为杂合型突变。
163个突变位点分布于pah基因第2至第12外显子及第2、3、4、12内含子区域(表2)，发生突变频率最高的区域是第6、7、11外显子区域，占总体突变的64.1%；在所有点突变中，发生频率最高突变类型的为替换突变，其突变频率为74.4%，其余突变类型依次为剪接区突变、沉默突变、缺失突变和无义突变，突变频率分别为13.5%、5.8%、3.8%和2.6%；突变频率最高的位点为c.728G>A(p.R243Q)，突变频率为15.38%、其次为c.611A>G(p.Y204C)、c.721C>T(p.R241C)、c.1197A>T(p.V399V) 和c.158 G>A(p.R53H)，其突变频率依次为9.62%、7.05%、7.05%和5.13%，其余位点的突变频率均在0.64%～4.49%。
表2 河南省83例PKU患儿pah基因突变情况突变区域氨基酸改变碱基改变突变类型等位基因突变数突变频率(%)E2p.G46Rc.136G>C替换10.64E2p.R53Hc.158G>A替换85.13I2IVS2+19T>Cc.168+19T>C剪接10.64I2IVS2+5G>Cc.168+5G>C剪接10.64E3p.S70delc.206-208delCTT缺失10.64E3p.S70delc.208-210del缺失21.28E3p.R71Hc.212G>A替换10.64E3p.D84Gc.251A>G替换10.64E3p.I95delc.284-286delTCA缺失10.64E3p.H107Rc.320A>G替换10.64E3p.R111Xc.331C>T无义21.28I3IVS3-22C>Tc.352-22C>T剪接10.64E4p.P147Lc.440C>T替换10.64I4IVS4+3G>C
c.441+3G>C剪接10.64I4IVS4+43C>Ac.441+43C>A剪接10.64I4IVS4-1G>Ac.442-1G>A剪接31.92E5p.Y166Xc.498C>G替换21.28E5p.H70Rc.509A>G替换10.64E6p.R176Xc.526C>T无义21.28E6p.T193Pc.579A>C替换10.64E6p.Y204Cc.611A>G替换159.62E6p.Y206Cc.617A>G替换31.92E6p.H220Pc.659A>C替换10.64E6p.C203Yc.608G>A替换10.64E6p.Q232Xc.694C>T替换21.28E7p.R241Cc.721C>T替换117.05E7p.R241Profsc.722delG缺失21.28E7p.R241Hc.722G>A替换31.92E7p.L242Fc.724C>T替换10.64E7p.R243Qc.728G>A替换2415.38E7p.V245Vc.735G>A沉默10.64E7p.G247Rc.739G>C替换31.92E7p.G247Vc.740G>T替换53.21E7p.L255Sc.764T>C替换10.64E7p.I324Nc.782G>A替换21.28E7p.F263Sc.788T>C替换10.64E7p.C265Yc.794G>A替换10.64E7p.M276Kc.827T>A替换10.64E7p.E280Kc.838G>A替换10.64E8p.S303Pc.907T>C替换10.64E9p.S310Cc.929C>G替换10.64E9p.P314Tc.940C>A替换10.64E9p.A322Dc.965C>A替换10.64E9p.I324Nc.971T>A替换10.64E10p.Y325Xc.975C>G沉默10.64E10p.G344Sc.1030G>A替换10.64
续表2 河南省83例PKU患儿pah基因突变情况突变区域氨基酸改变碱基改变突变类型等位基因突变数突变频率(%)E10p.S349Ac.1045T>G替换10.64I10IVS10-11G>Ac.1066-11G>A剪接10.64E11p.Y356Xc.1068C>A沉默74.49E11p.V399Vc.1197A>T剪接117.05E12p.A403Vc.1208G>T替换10.64E12p.R413Pc.1238G>C替换63.85E12p.T418Pc.1252A>C替换10.64E12p.Q419Rc.1256A>G替换21.28E12p.A434Dc.1301C>A替换63.85I12IVS12+6T>Ac.1315+6T>A剪接10.64
2.2 河南省PKU患儿pah基因大片段缺失检测结果
在本研究中，通过MLPA技术共发现6例患者的pah基因出现大片段缺失型突变，缺失突变发生在其pah基因第1、4、5、6、7外显子及其基因上游的调控区域，其中3例患者(PKU033、PKU039、PKU055)检测到了发生在pah第4、5外显子上的大片段缺失(图1A、B、F)，其血浆Phe浓度分别为0.181、0.196 g/L和0.202 g/L(表3)；2例患者(PKU015、PKU027)检测到了发生在pah基因第1外显子的大片段缺失(图1D、E)，其血浆苯丙氨酸浓度分别为0.072、0.123 g/L(表3)；1例患者(PKU012)检测到了发生在pah基因第5、6、7外显子的大片段缺失(图1C)，其血浆Phe浓度分别为0.329 g/L(表3)。
A：PKU033患者在pah基因第4、5外显子区域发现大片段缺失；B：PKU039患者在pah基因第4、5外显子区域发现大片段缺失；C：PKU012患者在pah基因第5、6、7外显子区域发现大片段缺失；D：PKU015患者在pah基因第1外显子区域发现大片段缺失；E：PKU027患者在pah基因第1外显子区域；F：PKU055患者在pah基因第4、5外显子发现大片段缺失图1 多重连接探针扩增技术(MLPA)检测结果图
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