http : ! www. insect. org. cn
doi ： 10.16380/L kcxb. 2021.01.008
1 月 Janua/
2021, 64(1)： 70-79
昆虫学报
ACTAENTOMOLOGICASINICA
张 显，周思聪，陈佳妮，庞 兰，张启超,
王莹，时敏，陈学新，黄健华"
(浙江大学昆虫科学研究所，农业部作物病虫分子生物学重点实验室，杭州310058)
摘要：【目的】调查寄生黑腹果蝇Drosophila melanogastes 的日本开臂反P 茧蜂AsoPara japonica 的生
物 ，明确其寄生对寄主生长发育及 的影响。【方法】运用解剖成像和 光定量PCR.
查分析了日本开臂反P 茧蜂的各发育 发育历期、形态特征，以及日本开臂反P 茧
蜂寄生黑腹果蝇2龄幼'后的寄生率、出蜂率及寄主化蛹时间和 路15个主要基因'ToT
通路中的 SPE , Tol l , Myd88 , Dp 和 Drosomycix , Imd 通路中的 PGRP-LE , PGRP-LC , iod , Relisp 和
Diptericin 及PO 通路中的Spn27A , MP2 , yellow-f2 , DoxP2和PPO1 )转录水平的变化$【结果"在
25 ±1f ，相对湿度50% ±1%和光周期16L ：8D 条件下，日本开臂反P 茧蜂的卵期平均为2.38 ± 0.01 d ,'期为5.36 ±0.07 d ，蛹期为8.30 ±0.04 d o 日本开臂反P 茧蜂寄生黑腹果蝇2龄幼
', 生率为94.9% ±4.0%，出蜂率为64. 3% ±7.1%$另外，日本开臂反P 茧蜂寄生使黑腹果
蝇幼'50%化蛹时的化蛹时间比未被寄生对照显著延缓约0.5 d ；寄生后黑腹果蝇抗菌肽基因
Drosomycix 和Di.pteri.ci.x 转录水平显著上调，而原酚氧化酶基因PPO1转录水平则显著下调$【结 论】
延缓 发育和抑制寄主的黑化 ，日本开臂反P 茧蜂能够在黑腹果蝇幼'上成
生。本研究的结果为进一步规模化扩繁日本开臂反P 茧蜂并进行田间生物防治应用提供了理论
$
关键词：日本开臂反P 茧蜂；黑腹果蝇；寄生；生长发育；免疫反应
中图分类号：Q966
文献标识码：A 文章编号：0454-6296(2021 )01-0070-10
Biological characteristics o# Asobara japonica ( Hymeeoptera ： Braconidae ) parasitizing Drosophila melanogastea and the effecis o# its parasitization on the host growth and immun
e responses
ZHANG Xian , ZHOUSi-Cong , CHENJia-Ni , PANG Lan , ZHANG Qi-Chao , WANG Ying , SHIMin , CHENXue-Xin , HUANG Jian-Hua " ( MinisteyotAgeicuatueeKeyLaboeatoeyotMoaecuaaeBioaogyot C/p Pathogens and Insecl Pests , Instituta of Insecl Sciences , Zhejiang University , Hangzhou 310058,
China )
Abstract : & AT ] This study Crns to investigate the bioPgicxl characte/sticr of the parasitoiV Asobara japonica parasitizing Drosophila melano 3X310 and to detemiina the effects of its parasitization on the host growth and Tnmune responses. & Methods ] The developmental duration and morphoPgicxl characterasticr ot A.Uaponcta atdi t eeentdeeeopmentaRstages , thepaeasitism eateand emeegenceeateot A.Uaponcta
a/ar parasitization on the 2nd instar la/aa of D. melanogaster , the changes of host pupation pTa and
基金项目：国家重点研发计划项目(2017YFD0200400)；浙江省自然科学基金项目(LR18C140001)
作者简介：张显，男，1996年4月生，安徽亳州人，硕士研究生，研究方向为害虫生物防治，E-mCi ：
* 通讯作者 Corresponding autPcs , E-mail : jhhuang@ zju. edu. cn
收稿日期 Received ： 2020-07-08 % 接受日期 Accepted ： 2020-07-00
1期张显等：寄生黑腹果蝇的日本开臂反顒茧蜂生物学特性及其寄生对寄主发育及免疫反应的影响71
transc/pponai levels of15important genvs of host in diCeent immune pathways(SPE,Tog,Myl88,Dp and Drosomycie invelved in Toll pathway,PGRP-LE,PGRP-LC,md,Relish and DiptericP invelved in Imd pathway and Spe27A,MP2,yePoo-',DoxA2and PP01involved in PO pathway)in thv parasitized 2nd instar laeav lanogaster were investigated and analyzed by anaWmicci im/ing and qRT-PCR Wchnology.&Results]Thv developmental duration of egg stagv,laeal stagv and pupal stagv of A.
japonica undvr thv conditions of25±1f,50%±1%relative humidity and photope/od of16L：8D was
2.38±0.01,5.36±0.07and8.30±0.04d,respectively.AOar parasitizing thv2nd instar laeav of
64.3%±7.1%,espectivviy.Moreovor,after being parasitized by A.japonie,thv pupation tito of D.
melanogaster with50%pupation nW was prolonged by0.5d,and thv transc/ptional levels of thv antibacte/ai peptido genvs Drosomycie and DiptePPa were up-regulated siyniqcynCy,whereas that of thv pephenoloxidasa genv PP01was down-regulated as compared to thv unparasitized control.&Conclusion]
A.japoaaa ccn successfully and Vectivviy lanogaster laeav through tugge/ng host
developmental delay and suppressing host melanization itmuno responses.Thv results pevido soma u@eeuaineoemation eoethema@ieeeeaea@epeogeam@oetheageicuatuea a y impoetantpaea@itoid@pecie@A.
japonica.
Key woris:AsoOara japonica%Drosophila melanogaster%parasitism%growth and development%itmuno ee@pon@e
化学农药在降低农业害虫危害、保障农产品高产和推动社会发展等方面发挥了极其重要的作用。但近些年来，由于农药不合理使用带来的许多弊端，比如环境污染、农药残留及害虫抗药性等问题，引起
了全社会的广泛性关注(Li et ah,2018)o生物防治是指利用天敌昆虫及病原微生物等自然资源去控制害虫发生的一种环境友好、生态安全的防控技术。它能有效避免农药滥用带来的一系列问题，符合我国发展绿农业的战略需求(古德祥等,2000%张俊杰等,2015%党英侨等，2018)。寄生蜂是一类重要的寄生性天敌昆虫，其数量众多，约占整个昆虫种类的10%-20%(Whitfield,2003)。通过大规模饲养和人工释放寄生蜂，可以有效地控制和降低害虫种数量，达到对害虫防治的目的。我国已经有许多应用寄生蜂进行害虫防治的成功案例，比如：应用赤眼蜂对玉米螟、二化螟Chip suppressalis(甘蔗螟虫等害虫进行防治(张海燕等，2019)；应用丽吗小蜂Eacarsia formosa减少温室害虫白粉虱的危害等等(李洪安等,2007)。 在自然界中，有一些果蝇属Drosophila昆虫，比如斑翅果蝇D.suzukii，是危害极大的浆果类水果害虫。与其他果蝇种类不同，斑翅果蝇雌虫具有锯齿状产卵器，所以它能够将卵产在即将成熟的果皮下，孵化后的斑翅果蝇幼虫通过取食果肉为生(Atallah et at2014)。斑翅果蝇原产于东南亚，近年来传入美洲和欧洲等许多国家和地区，对当地的水果产业造成了巨大的危害(Lev et ah,2011%Cini et ah, 2014)。在我国四川、云南、浙江等省份都发生过斑翅果蝇危害樱桃、蓝莓、葡萄等水果，严重影响了水果产量并造成巨大的经济损失(张成林等，2011%张开春等，2014)。为此，国内外生物防治领域相关研究人员一直致力于寻能够有效降低斑翅果蝇害虫种的寄生蜂，希望通过大量繁殖和释放技术实现对斑翅果蝇危害的持续控制。
目前，果蝇属寄生蜂的研究主要集中寄生果蝇幼虫的茧蜂科(Braconidao)寄生蜂和环腹瘻蜂科(Ftitidae)寄生蜂，以及寄生果蝇蛹期的锤角细蜂科(DiapVidav)寄生蜂和金小蜂科(Ptemmalidav)寄生蜂"Carton et ah,1986)。有研究表明，锤角细蜂科的毛锤角细蜂Trihopria drosophPae对斑翅果蝇有很高的寄生效率(ChabeV et ah,2012)。而绝大多数幼虫寄生蜂，像环腹瘻蜂科(Ftittae) Leptopiliaa属的异小环腹瘻蜂L.hferotoma布拉迪小环腹瘻蜂L.0x10101都不能成功寄生斑翅果蝇。本课题组于2018年在浙江省台州地区(28Z0'N, 120°34,E)诱捕到一种茧蜂科开臂反顎茧蜂属Asobaia的幼虫生日茧
Asobara japonie，发现其能成功寄生斑翅果蝇(Zhang et ah,2020)。更为重要的是，该寄生蜂种的生殖方式为产雌孤雌生殖，即后代均为雌性。
72昆虫学扌艮Acta Entomologica Sinica64卷
这些特性均显示日本开臂反顎茧蜂是一种潜在的、可用于生物防治斑翅果蝇的优势寄生蜂）
日本开臂反顎茧蜂是典型的单寄生蜂，其能寄生多种果蝇属的昆虫，这有助于我们选择一种适合的替代寄主进行工厂化大规模扩繁，并用以生物防治（Idea et ah,2008）。黑腹果蝇D.melanogaster是一种模式昆虫，它具有繁殖速度快、容易饲养等优点。因此，黑腹果蝇可能是日本开臂反顎茧蜂进行大规模繁殖的最佳替代寄主。本研究针对日本开臂反顎茧蜂-黑腹果蝇这一体系，来研究寄生蜂在寄主体内的形态特征、发育历期及寄生效率等生物学特征；研究寄生蜂寄生对寄主生长发育及免疫信号通路
相关基因转录水平的影响，以期能够提升日本开臂反顎茧蜂大量繁殖的能力，从而保证寄生蜂生防产品的产量和质量）
1材料与方法
1.1供试昆虫
黑腹果蝇品系［1118从美国印第安纳大学Bloomington果蝇中心购买，用5.5cmx5.5cm的果蝇瓶饲养。果蝇食物为常规的玉米粉配方，每6L 果蝇食物含：玉米粉318g，干酵母120g，琼脂粉57g，蛋白月东60g，红糖90g，葡萄糖180g，酵母提取物60g。日本开臂反顎茧蜂于2018年6月在浙江省台州地区用葡萄和香蕉等水果诱集，并一直饲养于本实验室。日本开臂反顎茧蜂为孤雌生殖品种，所有后代均为雌性。寄生蜂雌蜂饲养在苹果汁食物中，食物配方为：每1L含27g琼脂,33g红糖, 330mL苹果汁,20mL10%尼泊金甲酯。所有昆虫均在人工气候箱中进行饲养，黑腹果蝇饲养条件为温度25±1f，相对湿度50%±1%，光周期16L：8D；寄生蜂饲养条件为温度25±1f，相对湿度50%±1%，光周期16L：8D。
1.2日本开臂反"茧蜂发育历期及形态特征观测
挑取200头黑腹果蝇2龄幼虫放于含果蝇食物的果蝇瓶中，用羽化后4d的日本开臂反顎茧蜂寄生，使用
寄生蜂数与供试寄主幼虫数比为1：0，寄生3h后取出寄生蜂，将寄主放于25±1f恒温培养箱中培养并观察。寄生后每隔12h取被寄生的黑腹果蝇进行解剖，观察日本开臂反顎茧蜂在寄主体内的发育阶段，并用KEYENCE VHX-2000C成像系统进行拍照。依据预实验结果，初步判断寄生蜂幼虫期与蛹期分别为产卵后2-6d和7-16d。为了进一步精确计算日本开臂反顎茧蜂各发育阶段所需的时间，我们分别在寄生蜂产卵后1-5,2和2.5d 30，用计化；别在
6,78d30，用计幼虫化蛹数；分别在产卵后15,16和17d解剖30头寄主，用以统计蛹羽化数。卵期所需天数（d）=（1.5dx卵孵化数+2d x卵孵化数+2.5d x卵孵化数）/卵孵化总数；幼虫期所需天数（d）=*（6d x幼虫化蛹数+7dx幼虫化蛹数+8dx幼虫化蛹数）/总化蛹数］-卵期发育天数；蛹期所需时间（d）=［（15dx 蛹羽化数+16dx蛹羽化数+17dx蛹羽化数）/总羽化数+-幼虫期发育天数-卵期发育天数。实验重复3次。
1.3日本开臂反"茧蜂的寄生率及出蜂率测定
采用的实验方法同1-2节，实验重复4次，每次
均计内化蛹、幼虫
、羽化、生羽化及蛹,
计算生、出、幼虫蛹死亡率。寄生率=［1-寄主羽化数/供试寄主幼虫数］x100%；出蜂率=（寄生蜂羽化数/供试寄主幼虫数）x100%；寄主幼虫死亡率=（寄主幼虫死亡数/供试寄主幼虫数）x100%；寄主蛹死亡率=（寄主蛹死亡数/寄主化蛹数）x100%。
1.4日本开臂反"茧蜂寄生前后寄主黑腹果蝇发
历期测定
取50头交配后的雌性黑腹果蝇放于果蝇瓶中产卵3h左右，每次能产约200粒卵，待果蝇幼虫发育至2龄幼虫时，立即用羽化后4d的日本开臂反顎茧蜂寄生，使用寄生蜂数与供试寄主幼虫数比为1：20，寄生3h后取出寄生蜂，将寄主放于25±1f 恒温培养箱中培养。每隔12h统计每瓶化蛹数，根据每个时间点的累计化蛹数占最终化蛹数的百分比作图。实验重复4次，处理组为日本开臂反顎茧蜂寄生的黑腹果蝇，对照组为相近卵数且未被寄生的黑腹果蝇。
1.5qRT-PCR方法检测黑腹果蝇免疫通路相关基
的
本研究借鉴SchPnka等（2007）方法，在果蝇3个主要免疫通路，即Tol l通路、Imd通路和PO通路，各选取5个关键基因进行转录水平检测。其中, Tol l通路基因：SPE（FlyBase ID:FBgn0039102）, Toll
（FlyBase IN:FBgn0262473）,M；88（FlyBase IN：FBgn0033402）,Df（FlyBase IN：FBgn0011274）和Drosomycix（FlyBase IN:FBgn0283461）；Imd通
1期张显等：寄生黑腹果蝇的日本开臂反顒茧蜂生物学特性及其寄生对寄主发育及免疫反应的影响73
路基因：PGRP-LE(FlyBasa ID：FBgn0030695), PGRP-LC(FlyBasa ID:FBgn0035976),Pnd (FlyBasa ID:FBgn0013983),Relish(FlyBasa ID: FBgn0014018)和Diptericin(FlyBasa ID：FBgn0034407)；PO通路基因：Spn27A(FlyBasa ID：FBgn0028990), MP2(FlyBasa ID：FBgn0037515),yePow-je (FlyBasa ID：FBgn0038105),DoxA2(FlyBasa ID: FBgn0261396)和PPO1(FlyBasa ID：FB/0283437)。对被寄生后6与12h的黑腹果蝇幼虫整虫进行取样，使用QIDGEN RNexsy Mini Kit提取RNA, Vazyma HiScipt(Q RT SuperMio(Cat#Q223Y1, Vazyma，南京)进行反转录获得cDNA第1链，最终使用ChamQ SYBR qPCR Master Mio Kit(Cat#Q311-02,Vazyma，南京)在AiaMax实时荧光定量PCR (AgiantTAchnoaogis,CA,USA)进行 qRT
PCR分析。qRT-PCR反应体系(20iL):SYBR-Green Mio10iL，上下游引物(10imol/L)各0.4 iL,500ng/iL的cDNA模板0.2iL，灭菌水9iL 反应条件：95f预变性30s；95f变性10s,57f退火20s,72f延伸20s,40个循环；熔解曲线：95f 变性15s,60f退火1mV,95f变性15s。y49 (Flybasa ID:FBgn0002626)作为内参基因，使用2一方法计算目的基因相对表达丰度。qRT-PCR 引物详见表1)
表l qRIPCR的引物序列
Table l Primers for qRT-PCR in this stedy
引物PeimAes 引物序列(5-3E产物长度(bp) Peimeesequences Peoductsiae
SPE-F CATCATCCACGAGATGTATGCTCC
156 SPE-R ATGCCGTAGTCCACAAAGTTGTT
To-F To-R ATCTCAACGATAATCCCCTGGTCTG
273 TTACCAGTGCTTTGTCGTAGGTTCG
Myd88-F Myd88-R TCTGGATGCCTTTTCGATCTACTCC
119 TGACATCCTTGTCGTTGATCTGAAT
DiOC CAGAGTTCCAACCCACG
235 DiOR ATGAGACTGCGCTTTAGG
Drosomycin-F Drosomycin-R TACTTGTTCGCCCTCTTCGC
194 CATCCTTCGCACCAGCACTT
PGRP-BC-B TTTTGTAACTTTAACCTTCCTGCTG
131 PGRP-BC-R ACTCGGCTACTTTTAGGATCACC
PGRP-BE-C CGTAAGACTTATCCGTGACATGCAG
157 PGRP-BE-R CGAGATCCTGTTGTAACCCAGAGTG
imd-F imd-R CATGAACTTCTCGAATGCCAATAAT
110 ACTCCTCTGCGGTACTGGTGCT
RAaish-F RAaish-R AGCTCTAATAACTCGCTGGATCTGC
111 GCGTCCGAACTCCTCACTTATAGTC
Dip/icin-F Dip/ricin-R TTCTATTCATTGGACTGGCTTGTGC
200 GAGGCTCAGATCGAATCCTTGCTT
Spn27A-F Spn27A-R GACAAAGATGGGCGGAAAT
204 CGGAAGGGCACAAAGGTAT
MP2-F ATGTTGCGGCACAAGGAAG
101 MP2-R AGACTGCTGAATCACGGAAAG
DOXA2-C CCAGGCGGTGCTTATTAACTGT
146 DOXA2-R TCCGACCTAGATAGTACAGGAAACG
ye a o wf2-F ye a o wf2-R GGAGTATCCAAATAACCGCCAACAG
226 GTTTCGCAGGTGATAGACGTACAGG
PPO1-F GTGACCAATAATGGAGCCAGACG
145 PPO1-R CAGGCACCAAATCAACTGTGAACT
ep49-F ep49-R CACCGGATTCAAGAAGTTCC
124 GACAATCTCCTTGCGCTTCT
74昆虫学报 Acto Entomologie Sinico 64卷
1.6数据分析实验数据均在 Data Pecessixg System ( DPS )
Packaye Version 9. 5 ( Tang and Zhang , 2013 )中进行
分析，使用的分析方
非配对Studex-氏t 检验。
设定0.01 vP <0.05 为显著差异,0.001 vP <0.01
P < 0. 001 为
差异。 用 Gmphpad
Prism 8. 0. 2 ( GmphPad , San Diega , CA , United States )软件进行绘图。
2 结果
2.1日本开臂反"茧蜂的发育历期及形态特征
日 茧 一种幼虫二甬寄生蜂，成熟
的 生蜂将 在果蝇2龄幼虫体内，其
在3龄 幼虫体内孵化。待
育至蛹期时,
生蜂幼蜂通过大量取食蛹期 的 并完成自
身世代发育。日 茧蜂的发育
、幼
虫、蛹
虫4 。 计
，
在25±1f
的实验室饲养条件下，日 茧蜂的卵期发
育 2.38 ±0.01 d ，幼虫期 5.36 ±0.07 d ，蛹
期 8.30 ±0.04 d (
1 )o 由
实验所用的日茧蜂为孤雌生殖品种，因
实验数据
均为雌性日
茧蜂生长发育所需的时间。
u
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lEluQludo^AQa
-©1*^
图1日本开臂反顎茧蜂各发育阶段发育历期Fig. 1 Duration of vv/ous developmentcl stages
of Asoboro jopoxico
图中的数值为平均值土标准误)Data in the figure are mean ± SE.
过 ，我们同时获得了日
茧蜂在
内不同发育 的 (图2)。日
茧
呈香蕉形(图2: A )，在早期发育的
图2日本开臂反顎茧蜂各发育阶段的形态特征
Fig. 2 Momhologicct chaecte/stics of Asoboro joponPa ct diCeent developmentcl stages
A ：卵 Egg ；
B : 1 龄幼虫初期 Early stage of the 1st instar lame ；
C : 2 龄幼虫初期 Early stage of the 2nd instar lame ； ': 2 龄幼虫晚期 Late stage of the 2nd instar Aev ； E : 3 龄幼虫 3rd instar Aev ； F ：预蛹 Prepupo ； G ：早期蛹 Early stage of pupa ； H ：晚期蛹 Late stage of pupa.箭头示 1 龄幼蜂蜕
下的表皮。The arrow indicates the cuticle exuviated by the 1 st instar
Aev.
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