DOI:10.ki.11-1802/ts.025283
引用格式：孔凡华，徐佳佳，郭倩，等.高效液相谱法测定虾青素油中虾青素的含量[J].食品与发酵工业,2021,47(6):214-220.KONG Fanhua,XU Jiajia,GUO Qian,et al.Determination of astaxanthin in astaxanthin oil by high performance liquid chromatography[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(6):214-220. 孔凡华2，徐佳佳2，郭倩2，白沙沙2，李东2，方从容1，邱楠楠1∗，崔亚娟2∗
1(国家食品安全风险评估中心，国家卫生健康委员会食品安全风险评估重点实验室，北京,100021)
2(北京市营养源研究所，北京,100069)
摘㊀要㊀该研究建立了高效液相谱法测定虾青素油中虾青素含量的分析方法㊂利用单因素实验，对虾青素油中虾青素的提取试剂㊁酶解时间进行选择，确定最佳前处理条件为37ħ恒温水浴振荡酶解60min ，石油醚提取㊂谱条件:YMC TM C 30谱柱(250mm ˑ4.6mm ,5μm )，柱温30ħ，流动相为甲醇-甲基叔丁基醚梯度洗脱，流速 1mL /min ，检测波长472nm ㊂结果表明，全反式虾青素在0.10~4.00μg /mL 范围内与峰面积有良好线性关系，精密度的相对标准偏差(relative standard deviation ,RSD )为1.36%，表明精密度高，平均回收率为93.58%，回收率的RSD 为2.84%，表明添加回收率高，相对标准偏差小，实验建立方法测得虾青素油中虾青素的含量为92.9%，是碱性皂化测得结果的2.11倍，所建立的方法可以准确定量虾青素油中虾青素的含量㊂关键词㊀高效液相谱法；虾青素油；虾青素；全反式虾青素;9-顺-虾青素;13-顺-虾青素
第一作者：硕士，工程师(邱楠楠副研究员和崔亚娟研究员为通讯作者,E-mail:;)
㊀㊀基金项目：十三五国家重点研发计划(2016YFD0400600)
收稿日期:2020-08-05；改回日期:2020-10-05
㊀㊀虾青素为萜烯类不饱和化合物，化学名称是3,3ᶄ-二羟基-4,4ᶄ-二酮基-β,βᶄ-胡萝卜素，是一种具有超级抗氧化活性的类胡萝卜素[1]，其抗氧化性能是维生素E㊁维生素C㊁β-胡萝卜素㊁叶黄素和玉米黄质的几十倍甚至几百倍[2-4]㊂雨生红球藻㊁红法夫酵母㊁南极磷虾㊁一些浮游生物㊁藻类㊁螃蟹外壳㊁河螯虾外壳㊁牡蛎㊁三文鱼皮㊁鲑鱼等动物中含有虾青素㊂虾青素具有多种生物功能，它能终止生物系统中炎症的发生[5]㊁对抗自由基损伤以维持免疫系统防御[6]㊁降低心脏病发病的风险[7]㊁减轻神
经退行性疾病带来的影响[8]㊁抑制肿瘤发生和生长[9]及对抗紫外线引起的光氧化损伤[10]等㊂
虾青素具有较长的共轭双键链，结构复杂，化学性质不稳定，存在多种同分异构体，虾青素及其异构体的定性定量分析是结构解析和功能研究的基础㊂天然虾青素大多与脂肪酸结合，以酯化的形态存在，但由于缺乏虾青素酯标准品，且人工合成虾青素酯困难，限制了虾青素酯的定性定量研究㊂虾青素酯脱去脂肪酸链后可以形成游离的虾青素，包括全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素等，使虾青素的定量研究变得容易操作[11]㊂目前，虾青素脱脂的主要方法是碱性皂化和酶解方法，碱性皂化脱脂会产生副产物
并引起虾青素降解[12]，食品化学法典(FCC )
(2012)[13]采用来自假单胞杆菌的胆固醇酯酶(EC
3.1.1.13)进行虾青素酯的酶解，可以使虾青素酯水解完全㊂谱技术的发展在虾青素的定性定量分析上起了非常重要的作用，随着紫外可见光谱㊁质谱㊁核磁共振波谱法㊁红外光谱㊁拉曼光谱和圆二光谱的快速发展，虾青素的结构鉴定变得更为简单容易，考虑到设备的成本，样品制备的复杂程度和方法的局限性，虾青素的定量分析方法主要是分光光度法和高效液相谱法㊂分光光度法具有快速简单㊁适用范围
广㊁成本低等优点，但是只能对虾青素总量进行估算，无法对其中虾青素的存在形式进行准确的测定㊂高效液相谱法分离效果好㊁灵敏度高㊁选择性好成为目前测定虾青素的常用方法㊂我国测定虾青素的标准方法有‘红球藻中虾青素的测定液相谱法“(GB /T 31520 2015)[14]适用于雨生红球藻藻粉中虾青素含量的测定;‘水产品及其制品中虾青素含量的测定高效液相谱法“(SC /T 3053 2019)[15]适用于鱼类㊁甲壳类及虾粉㊁磷虾油等制品中虾青索含量的测定;‘进出口动物源性食品中角黄素㊁虾青素的检测方法“(SN /T 2327 2009)[16]适用于黄鱼㊁鳗鱼㊁鸡肉㊁鸡蛋㊁鸭肝㊁猪肾和牛奶中角黄素㊁虾青素的
测定与确证;‘植物提取物虾青素油“(T/CCCMHPIE 1.23 2016)[17]适用于以人工培养的红球藻属雨生红球藻为原料经提取精制后，得到的虾青素油中虾青素的测定㊂以上标准方法通过有机溶剂直接提取或者碱性皂化脱脂后提取虾青素，容易引起虾青素的降解[12]，导致测量结果不准确或对测定结果造成干扰；标准方法多采用三相洗脱系统分离虾青素及其异构体，对液相系统要求高㊂本文参照虾青素检测的标准方法[14-17]和文献方法[13,18-23]，设计单因素实验，对提取试剂㊁胆固醇酯酶酶解时间进行优化，以虾青素含量的高低作为评价指标，筛选最佳提取试剂和酶解条件；通过谱柱㊁流动相等高效液相谱条件，以全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素的分离度和峰形对称性作为评价指标，筛选最佳谱条件，实现虾青素油中虾青素的有效提取和高效分离㊂以虾青素油为研究对象，进行方法学验证，考察方法的科学性㊁准确性和适用性，并比较实验建立的酶解方法与文献中的
碱性皂化方法[18]对虾青素油中虾青素的提取效率，以期建立虾青素油中虾青素的精准分析检测技术㊂
1㊀材料与方法
1.1㊀材料与试剂
超临界二氧化碳萃取的雨生红球藻虾青素油，市购；全反式虾青素对照品(纯度96.9%),Dr.Ehren-storfer GmbH;9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素对照品(纯度ȡ95.0%),Sigma公司；胆固醇酯酶16.3U/mg，月旭科技股份有限公司㊂
甲醇㊁乙腈㊁甲基叔丁基醚㊁二氯甲烷㊁乙酸乙酯(均为谱纯)，美国Fisher公司；无水乙醇㊁无水硫酸钠㊁氢氧化钠㊁浓盐酸(分析纯)，北京化工厂；石油醚(分析纯)，福晨(天津)化学试剂有限公司；丙酮(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)(分析纯)，浙江联硕生物科技有限公司㊂
1.2㊀仪器与设备
BS224S分析天平，德国赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;METTLER TOLEDO pH计，梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司;QL-901斡旋振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司;ZHWY-110X30往复
式恒温水浴摇床，上海智诚分析仪器制造有限公司;KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超市仪器有限公司;HITACHI CF16RXII高速冷冻离心机，日本日立科技有限公司；安捷伦1260高效液相谱仪，配二极管阵列检测器和ChemStation for LC sys-tems谱工作站，美国Agilent公司;YMC TM C30谱柱,5μm,250mmˑ4.6mm(内径)㊂
1.3㊀方法
1.3.1㊀溶液的配制
㊀㊀(1)0.021mol/L氢氧化钠-甲醇溶液：称取0.084g 氢氧化钠，加入80mL甲醇溶解并定容到100mL㊂㊀㊀(2)0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=7)：准确称取3.0285g Tris，加入450mL去离子水溶解后，用0.5mol/L的盐酸调节pH至7.0，然后用去离子水定容至500mL㊂
㊀㊀(3)胆固醇酯酶溶液：称取6.2mg胆固醇酯酶于25mL容量瓶中，用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液定容至刻度，胆固醇酯酶溶液浓度约为4U/mL，现用现配㊂
㊀㊀(4)全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素标准储备液：分别准确称取全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素标准品1mg，分别置于25mL棕容量瓶中，加丙酮溶解并定容至刻度，摇匀，得到浓度为40μg/mL标准储备液，现用现配㊂
㊀㊀(5)全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素混合标准工作溶液：准确移取全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素标准储备溶液，用丙酮稀释成各浓度均为0.80μg/mL的标准工作溶液，用于定性，现用现配㊂
㊀㊀(6)全反式虾青素标准工作溶液：准确移取全反式虾青素标准储备溶液，用丙酮稀释成浓度分别为0.10㊁0.20㊁0.40㊁0.80㊁1.60㊁4.00μg/mL的标准工作溶液，现用现配㊂
1.3.2㊀谱条件的选择
孙伟红等[19]研究表明,C30谱柱对虾青素异构体的分离效果和响应值优于C18谱柱，更有利于定量结果的分析，所以本实验选择YMC TM C30谱柱㊂参考标准方法和文献方法，选择甲基叔丁基醚-乙腈(体积比95ʒ5)[20]㊁甲醇-甲基叔丁基醚-水(体积比83ʒ15ʒ2)[21]㊁水-甲醇-二氯甲烷-乙腈(体积比4.5ʒ28ʒ22ʒ45.5)[22]㊁水-甲醇-二氯甲烷-乙腈(5ʒ85ʒ5ʒ5)[23]和甲醇-甲基叔丁基醚[24]等流动相体系洗脱，以全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素的分离度作为评价指标，优化全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素分离的谱条件㊂
1.3.3㊀提取溶剂的选择
虾青素油用丙酮稀释500倍作为实验用虾青素油样品㊂实验参照食品化学法典FCC th(2012)[23]的方法，并加以改进㊂称取10mg虾青素油样品于15mL离心管中，样品称取15份，分别加入2mL Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L,pH=7)和1mL胆固醇酯酶(4U/mL)溶液振荡均匀后，在37ħ恒温水浴振荡器内振荡酶解60min，取出立即冷却至室温㊂向每份酶解液中分别加入2.0mL石油醚㊁二氯甲烷-甲醇(体积比1ʒ3)㊁丙酮㊁乙腈㊁甲醇-乙酸乙酯-石油醚(体积比1ʒ1ʒ1)，每种提取溶剂做3个平行，每份样品均加入1g无水硫酸钠后在涡旋振荡器上涡旋提取2min，静置分层后，分别将上层溶液转移至10mL容量瓶中，重复提取2次，合并提取液于容量瓶中，氮气吹干后，用甲醇定容至刻度，溶液过0.45μm有机系滤膜后，待测定㊂
1.3.4㊀酶解时间的选择
称取10mg虾青素油样品于15mL离心管中，分别加入2mL Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L,pH=7)和1.0mL胆固醇酯酶(4U/mL)溶液振荡均匀后，在37ħ恒温水浴振荡器内分别振荡酶解15㊁30㊁45㊁60㊁75㊁90㊁120min，取出立即冷却至室温，用石油醚提取，其他操作步骤同1.3.3㊂
1.3.5㊀方法验证
按照GB/T27404 2008‘实验室质量控制规范食品理化检测“[25]方法学要求，建立校准曲线及校准曲线的工作范围；逐步稀释样品上机测定,R(S/N) =3时的测定浓度作为检出限,R(S/N)=10时的测定浓度作
为定量限；称取虾青素油样品，按照实验优化的方法，平行测定6次，计算虾青素的含量，并计算相对标准偏差，考察方法的重现性；根据虾青素油样品中虾青素的含量，按本底值的0.5倍㊁1倍㊁1.5倍3个浓度水平，进行3水平6平行加标回收实验，以回收率的高低评价方法的准确度㊂
1.3.6㊀碱性皂化脱脂方法
参见YUAN等[18]和苏芳[26]的方法，称取10mg 虾青素油样品于15mL离心管中，加入5mL0.021 mol/L氢氧化钠-甲醇溶液,5ħ水浴中避光皂化60 min，加入2mL纯净水和2mL石油醚，在涡旋振荡器上振荡2min，静置分层后，将上层溶液转移至10mL容量瓶中，重复提取2次至石油醚层无，合并提取液于容量瓶中，氮气吹干后，用甲醇定容至刻度，溶液过0.45μm有机系滤膜后，测定㊂1.4㊀虾青素含量的计算
1.4.1㊀标准曲线的制作
将各浓度全反式虾青素标准品工作溶液,9-顺式虾青素和13-顺式虾青素标准品工作溶液按实验优化的谱条件进行液相谱分析，根据虾青素异构体组分的保留时间定性㊂选定峰面积相近的全反式虾青素的标准工作液多点校准定量，试样测定结果以3种虾青素同分异构体的总和计，外标法定量，同时，标准工作液和样液的响应值均应在仪器检测的线性范围内㊂
1.4.2㊀结果计算
试样中虾青素的含量X以质量分数计，按式(1)计算㊂
X=
(1.3ˑA13-cis+A tras+1.1ˑA9-cis)ˑC sˑVˑf
A sˑmˑ100
(1)式中:X，试样中虾青素的含量,%;1.3,13顺-虾青素对全反式虾青素的校正因子;A13-cis，试样溶液中13-顺-虾青素的峰面积;A tras，试样溶液中全反式虾青素的峰面积;1.1,9-顺-虾青素对全反式虾青素的校正因子;A9-cis，试样溶液中9-顺-虾青素的峰面积;C s，标准工作液中全反式虾青素的含量,μg/mL;V，试样溶液体积,mL;A s，标准工作液中全反式虾青素的峰面积;m，试样质量,mg;f，稀释倍数㊂
1.5㊀数据处理
通过与仪器配套的ChemStation for LC systems工作站软件完成数据的采集与处理㊂
数据的差异性分析在SPSS软件上进行,P<0.05时，说明差异水平显著㊂
2㊀结果与分析
2.1㊀谱条件的选择
不同流动相体系对全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素分离效果见表1㊂
目前，多采用三相洗脱系统[14-15,17,19,27]或者正相洗脱系统[26]分离虾青素及其异构体，对液相系统要求较高，且普适性较差㊂本实验通过优化液相谱条件，采用甲醇-甲基叔丁基醚两相梯度洗脱，可以实现3种虾青素异构体的有效分离，结果如图1所示，优化得到分离虾青素的谱条件为:
谱柱:YMC TM C30谱柱,5μm,250mmˑ4.6mm (内径)或相当者；柱温:30ħ；流动相：见表1；流速: 1.0mL/min；检测波长:472nm；进样量:20μL㊂
表1㊀谱条件的优化
Table1㊀Optimization of chromatographic conditions
流动相洗脱程序流速/(mL㊃min-1)柱温/ħ分离度1甲基叔丁基醚-乙腈(体积比95ʒ5)等度洗脱 1.030 1.12 2甲醇-甲基叔丁基醚-水(体积比83ʒ15ʒ2)等度洗脱 1.030 1.33 3水-甲醇-二氯甲烷-乙腈(体积比4.5ʒ28ʒ25ʒ45.5)等度洗脱 1.030 1.21 4水-甲醇-二氯甲烷-乙腈(体积比5ʒ85ʒ5ʒ5)等度洗脱 1.030<0
0-12.0min,A相85%-70%;
12.0-20.0min,A相70%-20%;
5A-甲醇;B-甲基叔丁基醚20.0-22.0min,A相20%; 1.030ʎC 2.19
22.0-22.1min,A相20%-85%;
22.1-25.0min,A相85%;
㊀㊀注：所有进样体积均为20μL，谱柱为YMC TM C30,5μm,4.6mmˑ250mm谱柱；检测波长是472
nm(ref=off)；分离度是指13-顺式虾青
素和全反式虾青素的分离度(全反式虾青素和9-顺式虾青素的分离度均大于2.0)㊂
图1㊀全反式虾青素㊁9-顺式虾青素㊁13-顺式虾青素
标准溶液液相谱图
Fig.1㊀Chromatograms of all trans astaxanthin,
9-cis-astaxanthin,13-cis-astaxanthin
2.2㊀提取溶剂的选择
室温条件下，虾青素在丙酮㊁二氯甲烷㊁二甲亚砜㊁乙醇及其他非极性溶剂中的溶解性较好[28]㊂本试验根据前人研究基础，选取5种不同提取溶剂，比较不同提取溶剂对虾青素油中虾青素的提取得率，结果显示，石油醚对虾青素的提取效果最佳，显著高于其他提取溶剂(P<0.05)，结果见表2，虾青素油中虾青素异构体的HPLC谱图见图2㊂
表2㊀不同提取溶剂的提取结果(n=3)
Table2㊀Results of different extraction solvents(n=3)
提取溶剂虾青素含量/%
石油醚92.9ʃ3.38二氯甲烷-甲醇(体积比1ʒ3)80.3ʃ2.53
丙酮85.2ʃ1.58
乙腈70.5ʃ1.99甲醇-乙酸乙酯-石油醚(体积比1ʒ1ʒ1)72.1ʃ3.
01
2.3㊀酶解时间的选择
胆固醇酯酶的酶解时间影响虾青素酯的酶解效果，酶解时间不足，会导致酶解不完全，酶解时间过长，会造成虾青素的降解，不同酶解时间提取结果见表3㊂
图2㊀虾青素油脂中全反式虾青素㊁9-顺式虾青素㊁
13-顺式虾青素液相谱图
Fig.2㊀Chromatograms of all trans astaxanthin,9-cis-astaxanthin, 13-cis-astaxanthin in astaxanthin oil
表3㊀不同酶解时间的提取结果(n=3) Table1㊀Results of different enzymolysis time(n=3)
酶解时间/min虾青素含量/%
1581.9ʃ5.30
3086.7ʃ6.33
4584.4ʃ4.22
6092.9ʃ3.38
7590.6ʃ1.97
9091.0ʃ7.21
12084.4ʃ1.54
由表3知，在37ħ条件下，随着酶解时间的延长，虾青素的含量增加,60min时酶解完全，虾青素含量为92.9%，继续酶解到75min和90min，虾青素含量分别为90.6%和91.0%，与60min时没有显著性差异(P> 0.05)，酶解120min，虾青素含量明显降低(P<0.05)，其原因可能是温度对虾青素的降解破坏作用导致，因此酶解时间需要严格控制，以避免虾青素的损失，以4U/mL胆固醇酯酶37ħ条件下酶解60min最佳㊂2.4㊀方法验证
2.4.1㊀线性关系、检出限及定量限
按照1.3.3操作，在2.1谱条件下进行HPLC
分析，得到全反式虾青素为0.10~4.00μg/mL，浓度与峰面积有良好的线性关系，虾青素的检出限为0.1 mg/g，定量限为0.3mg/g㊂
2.4.2㊀方法精密度实验
按实验优化的前处理方法和谱条件，平行测定6次，虾青素油中虾青素含量的相对标准偏差(rela-tive standard deviation,RSD)为1.36%，表明精密度高，适合虾青素的定量分析，结果见表4㊂
表4㊀方法精密度结果(n=6)
Table4㊀Results of precision(n=6)
测定组分
测定结果/%
123456均值SD RSD/%
虾青素92.893.991.690.391.491.792.0 1.25 1.36 2.4.3㊀方法准确度实验
准确度为分析方法测定的平均值与真值相符的程度㊂稳定样品中加入不同水平已知量的标准物质(将标
准物质的量作为真值)称加标样品；同时测定虾青素油和虾青素油加标样品；加标样品扣除样品值后与标准物质的误差即为该方法的准确度，按公式(2)计算㊂
P/%=X1-X0
mˑ100(2)
式中:P，加入的标准物质的回收率;m，加入的标准物质的质量,μg;X1，加标试样的测定值,μg;X0，未加标试样的测定值,μg㊂采用样品加标试验进行本方法准确度验证，结果见表5㊂
表5㊀加标回收率实验结果(n=6)
Table5㊀Results of recovery rate of ginger(n=6)
加标量/
μg编号虾青素本底值/
μg虾青素测定值/
μg回收率/%平均回收率/
%RSD/ %
jb1-114.81022.30093.59
jb1-214.73022.13092.45
8jb1-314.50021.77090.89
jb1-414.44021.70090.79
jb1-514.42021.65090.39
jb1-614.39021.66090.91
jb2-113.47027.96090.61
jb2-213.15027.86091.93
16jb2-312.95027.94093.6893.58 2.84 jb2-413.02028.03093.81
jb2-513.08027.69091.32
jb2-613.04028.08094.00
jb3-114.38537.62396.83
jb3-213.94437.57898.48
24jb3-314.64337.48595.17
jb3-414.44037.17594.73
jb3-513.96237.12296.50
jb3-613.72337.32698.35
由表5可知，虾青素油中虾青素的回收率为90.39%~98.48%，平均回收率为93.58%,RSD为2.84%，表明方法添加回收率高，相对标准偏差小，适
合虾青素含量的测定㊂
2.5㊀不同脱脂方法测得虾青素的含量
比较实验建立的胆固醇酯酶酶解方法㊁碱性皂化方法对虾青素油中虾青素的提取效率，结果见表6㊂表6㊀不同脱脂方法测定结果(n=3)
Table6㊀Results of different degreasing methods(n=3)脱脂方法虾青素含量/%
胆固醇酯酶酶解92.9ʃ3.38
碱性皂化方法㊀44.1ʃ1.06
由表6可知，胆固醇酯酶酶解所得虾青素含量是92.9%，显著高于苗凤萍[29]报道的72.04%和ZHAO 等[12]报道的63.2%，与苏芳[26]报道的92.95%结果相近㊂酶解所得虾青素含量是碱性皂化得率的2.11倍，这可能是因为碱不仅对脂肪酸有破坏作用，对虾青素也有很大的降解作用，而胆固醇酯酶对脂肪酸有特异性，可以减少对虾青素的降解㊂张丽瑶等[30]研究表明虾青素溶液经超声处理后，全反式异构体的浓度大幅度降低,9-顺式和13-顺式异构体浓度均有所增加，超声处理使虾青素降解为其他成分㊂对比虾青素的得率，可见，酶解法对虾青素的含量影响较小，先酶解再进行高效液相谱分析是对含虾青素酯样品的含量及几何异构体测定的可靠方法，可以准确定量样品中虾青素的含量㊂
3㊀结论
本实验在前人研究的基础上，设计单因素实验，对提取试剂㊁胆固醇酯酶酶解时间进行优化，以虾青
素得率高低作为评价指标，得到虾青素油中虾青素的最佳提取条件为37ħ恒温水浴振荡酶解60min，石油醚提取，该方法对虾青素油中虾青素的提取得率为92.9%，是碱性皂化得率的2.11倍㊂通过谱柱㊁流动相等高效液相谱条件，以全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素的分离度和峰形对称性作为评价指标，筛选最佳谱条件为YMC TM C30谱柱，甲醇-甲基叔丁基醚两相梯度洗脱，可以实现3种虾青素异构体的有效分离，相比于目前常用的三相洗脱程序和正相洗脱系统，要求的液相系统简单㊂选择虾青素油进行方法学验证，结果表明，全反式虾青素在0.10~4.00μg/mL的浓度范围内与峰面积有良好的线性关系；虾青素的检出限为0.1mg/g，定量限
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