一种竹红菌指纹图谱及其建立方法与应用与流程

1.本发明属于中药材质量控制技术领域，具体的说，涉及一种竹红菌指纹图谱及其建立方法与应用。

背景技术：

2.竹红菌为肉座菌科植物竹生小肉座菌hypocrella bambusae(b.et br.)sacc.的干燥子座，是它的药用部位。竹红菌在滇西北的纳西族、白族、彝族等民族医药中应用广泛，竹红菌主要成分为竹红菌素，竹红菌素是一种苝醌类衍生物，主要包括竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素，另外竹红菌中还含有甘露醇、尿囊素等成分，其中以竹红菌甲素和甘露醇的含量较高。竹红菌素是一种典型的光敏活性物质，目前研究较多的是它的抗肿瘤作用，竹红菌乙醇提取物竹红菌素软膏在临床上用于外阴白病变、瘢痕疙瘩、外阴瘙痒及外阴炎等具有较好的疗效。
3.竹红菌标准收载于2005年版《云南省药材标准》中，标准号为（云ycbz0018-2005），标准中鉴别项仅对竹红菌粉末外观，子座切面显，乙醇提取液最大吸收波长的鉴别，没有对其化学成分相关的鉴别，鉴别精度较差，另外没有含量测定项，现行标准不能反映竹红菌素成分的比例和含量，竹红菌药材指纹图谱能全面反映药材所含内在化学成分的比例和含量，能全面有效的反映中药材质量。
4.为了解决竹红菌药材质量控制问题，中国专利申请，公开号为：cn102028717a，申请日为：2010.12.07，申请号为：cn201010575529.8的专利公开了竹红菌药材的薄层鉴别方法，分别以竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素为对照对竹红菌药材进行薄层谱鉴别，薄层谱仅能做到定性的鉴别，对各成分的比例、含量不能全面的反映出来，公开号：cn101710070a，申请日为：2009.12.07，申请号为：cn200910218284.0，的专利公开了竹红菌药材中竹红菌甲素的含量的测定方法，仅对竹红菌甲素进行含量测定，不能全面反映每个成分含量，存在一定的不足，竹红菌药材指纹图谱采用液相谱的方法，能准确全面地检测中药材质量。

技术实现要素：

5.为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种竹红菌指纹图谱及其建立方法与应用，具有能够较为全面评价竹红菌药材，保证产品质量的有益效果。
6.为实现上述目的，本发明提供：一种竹红菌指纹图谱的建立方法，包含以下步骤：s1，对照品溶液的制备：精密称取竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素对照品，以甲醇或乙醇为溶剂配成对照品溶液；s2，供试品溶液的制备：精密称取竹红菌药材粉末，精密加入乙醇水溶液，超声振荡，滤过，作为供试品溶液；s3，谱条件：乙腈溶液为流动相a，磷酸溶液为流动相b，谱柱以十八烷基硅烷
键合硅胶为填料，波长215-300nm，柱温10-35℃，采用梯度洗脱，条件设置为：0分钟时，流动相a为30%的乙腈溶液、流动相b为70%的0.1~0.5%的磷酸溶液；6分钟时，流动相a为60%的乙腈溶液、流动相b为40%的0.1~0.5%的磷酸溶液；30分钟时，流动相a为80%的乙腈溶液、流动相b为20%的0.1~0.5%的磷酸溶液；35分钟时，流动相a为30%的乙腈溶液、流动相b为70%的0.1~0.5%的磷酸溶液；40分钟时，流动相a为30%的乙腈溶液、流动相b为70%的0.1~0.5%的磷酸溶液；s4，测定：精密吸取步骤s1中的对照品溶液和步骤s2中的供试品溶液分别注入高效液相谱仪，照高效液相谱法测定，得到指纹图谱进一步的，所述步骤s2供试品溶液的制备具体包括：取过60目筛的竹红菌药材粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入75%的乙醇溶液50ml，称重，然后超声振荡40min，放冷，再称定重量，用75%乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm的滤膜过滤，作为供试品溶液。
7.本发明还提供一种通过一种竹红菌指纹图谱的建立方法获得的指纹图谱。
8.本发明还提供一种竹红菌指纹图谱的建立方法在竹红菌药材或其制剂质量检测中的应用。
9.本发明的有益效果：1、指纹图谱技术作为天然药物提取物及其制剂的质量控制方法已达成国际共识，基于指纹图谱鉴定中药材质量具有特征性、稳定性和重现性好的特点。本发明通过hplc技术构建了竹红菌指纹图谱，为竹红菌及其制剂提供了一种稳定可靠的质量控制检测方法；2、竹红菌药材质量控制现有技术仅对其中的成分进行薄层鉴别，或者只检测其中的个别成分含量，不能全面的反映竹红菌药材中各成分比列及含量，本发明克服现有技术的不足，采用高效液相谱(hplc)及“中药谱指纹图谱相似度评价系统的相关软件(版本2012)
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建立了竹红菌药材指纹图谱，对不同批次竹红菌药材的指纹图谱相似度进行分析比较。可全面地对竹红菌药材质量进行评价，保证药材质量的稳定性。与现有技术相比，本发明竹红菌药材指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，是建立在中药化学成分系统研究的基础上，用于评价竹红菌药材质量的真实性、优良性和稳定性，是一种对竹红菌药材整体质量控制的手段，具有开创性意义。
附图说明
10.图1是本发明实施例一中竹红菌甲素对照品谱峰图；图2是本发明实施例一中竹红菌乙素对照品谱峰图；图3是本发明实施例一中竹红菌丙素对照品谱峰图；图4是本发明实施例一中竹红菌药材指纹图谱；图5是本发明实施例一中10批竹红菌药材指纹图谱。
具体实施方式
11.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
12.实施例一、1.1、竹红菌药材指纹图谱方法的建立竹红菌药材指纹图谱的建立方法，具体包括如下步骤：
（1）、对照品溶液的制备：精密称取竹红菌甲素，竹红菌乙素，竹红菌丙素对照品，以甲醇、乙醇为溶剂配成对照品溶液；（2）、供试品溶液的制备：精密称取竹红菌药材粉末,精密加入乙醇水溶液，超声振荡，滤过，作为供试品溶液；（3）、谱条件：谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为乙腈-0.1%磷酸液组成梯度洗脱溶液。紫外检测波长为215nm，时间40min；其中，所述流动相为乙腈-0. 1 %磷酸组成的梯度洗脱液，柱温：10℃梯度洗脱包括以下具体步骤：0分钟时，流动相a为30%的乙腈溶液、流动相b为70%的0.1%的磷酸溶液；6分钟时，流动相a为60%的乙腈溶液、流动相b为40%的0.1%的磷酸溶液；30分钟时，流动相a为80%的乙腈溶液、流动相b为20%的0.1%的磷酸溶液；35分钟时，流动相a为30%的乙腈溶液、流动相b为70%的0.1%的磷酸溶液；40分钟时，流动相a为30%的乙腈溶液、流动相b为70%的0.1%的磷酸溶液；（4）、测定：精密吸取步骤(1)中的对照品溶液和步骤(2)中的供试品溶液分别注入高效液相谱仪，照高效液相谱法测定，得到指纹图谱。
13.1.2、竹红菌药材共有峰的确定取对照品竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素按实施例一条件进行图谱测定，取竹红菌药材按实施例一条件做竹红菌药材图谱测定，在竹红菌药材的指纹图谱中确定4个峰作为特征峰组成（见图4）。通过对照品图谱测定，根据对照品保留时间，确定了竹红菌药材中2号峰为竹红菌丙素（图3），3号峰为竹红菌甲素（图1），4号峰为竹红菌乙素（图 2）选取分离度好，峰形较为稳定的竹红菌甲素3号峰为参照峰。
14.1.3、竹红菌药材精密度测定取其中一批供试品溶液，按实施例一谱条件连续进样6次，每次10μl，记录所得到的谱指纹图谱，竹红菌药材共有谱峰峰面积见表1。考察共有峰的相对保留时间，以竹红菌甲素谱峰为参照，计算共有峰的相对峰面积rsd值，计算结果见表1、表2。
15.表1 竹红菌药材精密度实验各峰峰面积表表2 竹红菌药材精密度实验相对峰面积rsd值
结果表明，竹红菌药材共有峰相对峰面积rsd《3%，表明该方法精密度良好。
16.1.4、10批竹红菌药材进行指纹图谱相似度测定。
17.取10批竹红菌药材按实施例一条件进行检测，得到10批样品的hplc图谱。通过10批hplc图谱的比较，进行相似度评价并计算相似度，将10批竹红菌药材的谱图导入“中药谱指纹图谱相似度评价系统的相关软件（版本2012）”，选3号峰（竹红菌甲素）作为参照，经由软件的自动分析和多元统计功能对照谱图5，得竹红菌药材相似度。计算结果如下表1所示：表110批竹红菌药材谱图相似度表进行分析可发现，10批竹红菌药材样品和标准指纹图谱的相似度高于95%，表明，10批竹红菌药材样品相似性良好。
18.实施例二、1.1、竹红菌药材指纹图谱方法的建立竹红菌药材指纹图谱的建立方法，具体包括如下步骤：
（1）、对照品溶液的制备：精密称取竹红菌甲素，竹红菌乙素，竹红菌丙素对照品，以甲醇、乙醇为溶剂配成对照品溶液；（2）、供试品溶液的制备：精密称取竹红菌药材粉末,精密加入乙醇水溶液，超声振荡，滤过，作为供试品溶液；（3）、谱条件：谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为乙腈-0.3%磷酸液组成梯度洗脱溶液。紫外检测波长为265nm，时间40min；其中，所述流动相为乙腈-0. 3 %磷酸组成的梯度洗脱液，柱温：20℃梯度洗脱包括以下具体步骤：0分钟时，流动相a为30%的乙腈溶液、流动相b为70%的0.3%的磷酸溶液；6分钟时，流动相a为60%的乙腈溶液、流动相b为40%的0.3%的磷酸溶液；30分钟时，流动相a为80%的乙腈溶液、流动相b为20%的0.3%的磷酸溶液；35分钟时，流动相a为30%的乙腈溶液、流动相b为70%的0.3%的磷酸溶液；40分钟时，流动相a为30%的乙腈溶液、流动相b为70%的0.3%的磷酸溶液；（4）、测定：精密吸取步骤(1)中的对照品溶液和步骤(2)中的供试品溶液分别注入高效液相谱仪，照高效液相谱法测定，得到指纹图谱。
19.1.2、竹红菌药材共有峰的确定取对照品竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素按实施例一条件进行图谱测定，取竹红菌药材按实施例一条件做竹红菌药材图谱测定，在竹红菌药材的指纹图谱中确定4个峰作为特征峰组成。通过对照品图谱测定，根据对照品保留时间,确定了竹红菌药材中2号峰为竹红菌丙素，3号峰为竹红菌甲素，4号峰为竹红菌乙素选取分离度好，峰形较为稳定的竹红菌甲素3号峰为参照峰。
20.1.3、竹红菌药材精密度测定取其中一批供试品溶液，按实施例一谱条件连续进样6次，每次10μl，记录所得到的谱指纹图谱，竹红菌药材共有谱峰峰面积见表1。考察共有峰的相对保留时间，以竹红菌甲素谱峰为参照，计算共有峰的相对峰面积rsd值，计算结果见表1、表2。
21.表1 竹红菌药材精密度实验各峰峰面积表表2 竹红菌药材精密度实验相对峰面积rsd值
结果表明，竹红菌药材共有峰相对峰面积rsd《3%，表明该方法精密度良好。
22.1.4、10批竹红菌药材进行指纹图谱相似度测定。
23.取10批竹红菌药材按实施例一条件进行检测，得到10批样品的hplc图谱。通过10批hplc图谱的比较，进行相似度评价并计算相似度，将10批竹红菌药材的谱图导入“中药谱指纹图谱相似度评价系统的相关软件（版本2012）”，选3号峰（竹红菌甲素）作为参照，经由软件的自动分析和多元统计功能对照谱图，得竹红菌药材相似度。计算结果如下表1所示：表110批竹红菌药材谱图相似度表进行分析可发现，10批竹红菌药材样品和标准指纹图谱的相似度高于95%，表明，10批竹红菌药材样品相似性良好。
24.实施例三、1.1、竹红菌药材指纹图谱方法的建立竹红菌药材指纹图谱的建立方法，具体包括如下步骤：（1）、对照品溶液的制备：精密称取竹红菌甲素，竹红菌乙素，竹红菌丙素对照品，以甲醇、乙醇为溶剂配成对照品溶液；
（2）、供试品溶液的制备：精密称取竹红菌药材粉末,精密加入乙醇水溶液，超声振荡，滤过，作为供试品溶液；（3）、谱条件：谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为乙腈-0.5%磷酸液组成梯度洗脱溶液。紫外检测波长为300nm，时间40min；其中，所述流动相为乙腈-0. 5%磷酸组成的梯度洗脱液，柱温：35℃梯度洗脱包括以下具体步骤：0分钟时，流动相a为30%的乙腈溶液、流动相b为70%的0.5%的磷酸溶液；6分钟时，流动相a为60%的乙腈溶液、流动相b为40%的0.5%的磷酸溶液；30分钟时，流动相a为80%的乙腈溶液、流动相b为20%的0.5%的磷酸溶液；35分钟时，流动相a为30%的乙腈溶液、流动相b为70%的0.5%的磷酸溶液；40分钟时，流动相a为30%的乙腈溶液、流动相b为70%的0.5%的磷酸溶液；（5）、测定：精密吸取步骤(1)中的对照品溶液和步骤(2)中的供试品溶液分别注入高效液相谱仪，照高效液相谱法测定，得到指纹图谱。
25.1.2、竹红菌药材共有峰的确定取对照品竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素按实施例一条件进行图谱测定，取竹红菌药材按实施例一条件做竹红菌药材图谱测定，在竹红菌药材的指纹图谱中确定4个峰作为特征峰组成。通过对照品图谱测定，根据对照品保留时间,确定了竹红菌药材中2号峰为竹红菌丙素，3号峰为竹红菌甲素，4号峰为竹红菌乙素选取分离度好，峰形较为稳定的竹红菌甲素3号峰为参照峰。
26.1.3、竹红菌药材精密度测定取其中一批供试品溶液，按实施例一谱条件连续进样6次，每次10μl，记录所得到的谱指纹图谱，竹红菌药材共有谱峰峰面积见表1。考察共有峰的相对保留时间，以竹红菌甲素谱峰为参照，计算共有峰的相对峰面积rsd值，计算结果见表1、表2。
27.表1 竹红菌药材精密度实验各峰峰面积表表2 竹红菌药材精密度实验相对峰面积rsd值
结果表明，竹红菌药材共有峰相对峰面积rsd《3%，表明该方法精密度良好。
28.1.4、10批竹红菌药材进行指纹图谱相似度测定。
29.取10批竹红菌药材按实施例一条件进行检测，得到10批样品的hplc图谱。通过10批hplc图谱的比较，进行相似度评价并计算相似度，将10批竹红菌药材的谱图导入“中药谱指纹图谱相似度评价系统的相关软件（版本2012）”，选3号峰（竹红菌甲素）作为参照，经由软件的自动分析和多元统计功能对照谱图，得竹红菌药材相似度。计算结果如下表1所示：表110批竹红菌药材谱图相似度表进行分析可发现，10批竹红菌药材样品和标准指纹图谱的相似度高于90%，表明，10批竹红菌药材样品相似性良好。
30.相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明建立竹红菌药材指纹图谱，并对不同批次竹红菌药材的指纹图谱相似度进行分析比较。可全面地对竹红
菌药材质量进行评价，保证药材质量的稳定性。
31.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种竹红菌指纹图谱的建立方法，其特征在于，包含以下步骤：s1，对照品溶液的制备：精密称取竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素对照品，以甲醇或乙醇为溶剂配成对照品溶液；s2，供试品溶液的制备：精密称取竹红菌药材粉末，精密加入乙醇水溶液，超声振荡，滤过，作为供试品溶液；s3，谱条件：乙腈溶液为流动相a，磷酸溶液为流动相b，谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，波长215-300nm，柱温10-35℃，采用梯度洗脱，条件设置为：0分钟时，流动相a为30%的乙腈溶液、流动相b为70%的0.1~0.5%的磷酸溶液；6分钟时，流动相a为60%的乙腈溶液、流动相b为40%的0.1~0.5%的磷酸溶液；30分钟时，流动相a为80%的乙腈溶液、流动相b为20%的0.1~0.5%的磷酸溶液；35分钟时，流动相a为30%的乙腈溶液、流动相b为70%的0.1~0.5%的磷酸溶液；40分钟时，流动相a为30%的乙腈溶液、流动相b为70%的0.1~0.5%的磷酸溶液；s4，测定：精密吸取步骤s1中的对照品溶液和步骤s2中的供试品溶液分别注入高效液相谱仪，照高效液相谱法测定，得到指纹图谱。2.根据权利要求1所述的一种竹红菌指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述步骤s2供试品溶液的制备具体包括：取过60目筛的竹红菌药材粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入75 %的乙醇溶液50ml，称重，然后超声振荡40min，放冷，再称定重量，用75%乙醇补足减失的重量，摇匀，用 0.45 μm的滤膜过滤，作为供试品溶液。3.根据权利要求1或2任一项所述的一种竹红菌指纹图谱的建立方法获得的指纹图谱。4.根据权利要求1或2任一项所述的一种竹红菌指纹图谱的建立方法在竹红菌药材或其制剂质量检测中的应用。

技术总结

本发明公开了一种竹红菌指纹图谱及其建立方法与应用，本发明以乙腈溶液为流动相A，磷酸溶液为流动相B，谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，波长215-300nm，柱温10-35℃，采用梯度洗脱为谱条件，将对照品溶液和供试品溶液分别注入高效液相谱仪，照高效液相谱法测定，得到指纹图谱。指纹图谱技术作为天然药物提取物及其制剂的质量控制方法已达成国际共识，基于指纹图谱鉴定中药材质量具有特征性、稳定性和重现性好的特点。本发明通过HPLC技术构建了竹红菌指纹图谱，为竹红菌及其制剂提供了一种稳定可靠的质量控制检测方法。提供了一种稳定可靠的质量控制检测方法。提供了一种稳定可靠的质量控制检测方法。