qRT-PCR实验及数据分析
qRT-PCR实验原理
RT-qPCR由普通PCR技术发展⽽来，它是在传统PCR反应体系中加⼊荧光化学物质（荧光染料或者荧光探针），根据各⾃不同的发光机制实时检测PCR退⽕、延伸过程中荧光信号变化来计算PCR每个循环中产物的变化量，⽬前最常见的⽅法为荧光染料法和探针法。 荧光染料法：
⼀些荧光染料如SYBR Green Ⅰ，PicoGreen，BEBO等，它们本⾝不发光，但结合于dsDNA的⼩沟后会发出荧光。所以当PCR反应刚开始时机器并不能检测到荧光信号，当反应进⾏到退⽕-延伸（⼆步法）或者延伸阶段（三步法），此时双链打开，在DNA聚合酶的作⽤下新链合成，荧光分⼦就结合于dsDNA的⼩沟中并发出荧光，随着PCR循环数的增加越来越多的染料与dsDNA结合，荧光信号也不断的增强。以SYBR Green Ⅰ为例。
探针法：
Taqman探针是最为常⽤的⼀种⽔解探针，在探针的5’端存在⼀个荧光基团，通常为FAM，探针本⾝则为⼀段与⽬的基因互补的序列，在探针的3’端有⼀个荧光猝灭基团，根据荧光共振能量转移原理(Förster re
sonance energy transfer， FRET)，当报告荧光基团（供体荧光分⼦）和猝灭荧光基团（受体荧光分⼦）激发光谱重叠且距离很近时（7-10nm），供体分⼦的激发可以诱发受体分⼦发荧光，⽽⾃⾝荧光减弱。所以PCR 反应开始，探针游离于体系中完整存在时，报告荧光基团并不会发出荧光，当退⽕时，引物和探针结合于模板，在延伸阶段，聚合酶不断的合成新链，由于DNA聚合酶具有5’-3’核酸外切酶活性，到达探针时，DNA聚合酶就会将探针从模板上⽔解下来，报告荧光基团和猝灭荧光基团分开，释放荧光信号。由于探针和模板存在⼀对⼀的关系，所以在试验的精度和灵敏度上，探针法都要优于染料法。 Fig 1 qRT-PCR原理
原则：
引物应⽤核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好⽤cDNA序列，mRNA序列也可，如果没有则出DNA序列的cds区域设计。做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp
引物长度⼀般在17-25碱基之间，上下游引物不能相差太⼤。
G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。
TM值在58-62度之间。
尽量避免引物⼆聚体和⾃⼆聚体，（不要出现超过4对连续互补的碱基）发卡结构，如果不可避免，使ΔG<4.5kJ/mol*
如果不能确保反转录过程中gDNA已经除⼲净，最好设计出夸内含⼦的引物*
3′端不可修饰，⽽且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）
引物与⾮特异性扩增序列的同源性最好⼩于70％或者有8个互补碱基同源。 数据库：
CottonFGD search by keywords
引物设计：
IDT-qPCR primer design
Fig2 IDT在线引物设计⼯具页⾯
Fig3 结果页⾯展⽰
nc R N A引物设计：
lncRNA：
lncRNA： 和mRNA的步骤⼀致。
miRNA：
miRNA：参考这个⽅法：茎环法miRNA引物设计-丁⾹园 茎环法原理：由于miRNA全部为23nt左右的短序列，⽆法进⾏直接PCR检测，所以使⽤了茎环序列这个⼯具，茎环序列是⼀段50nt左右单链DNA，可以⾃⾝形成发卡结构，3’末端可以设计成与miRNA部分⽚段互补的序列，那么
在反转录时就可以将⽬的miRNA连接到茎环序列上，那么总长度就达到70bp，就符合qPCR确定的扩增产物的长度。加尾法miRNA引物设计。
天根反转录引物设计
扩增特异性检测：
Online blast database：CottonFGD blast by sequence similarity
Local blast：参照我之前写的⽤Blast+做本地blast，linux和macos可以直接建⽴本地数据库，win10系统需要安装ubuntu bash后也可以做。本地blast数据库建⽴及本地blast；win10开启ubuntu bash。
Notice：陆地棉海岛棉为四倍体作物，所以blast结果往往会是两个或多个匹配，以往经验以NAU的cds作为database进⾏blast很可能到两个只有⼏个SNP差异的同源基因，通常通过引物设计是分不开这两个同源基因的，所以就将他们当做同⼀个来做，如果有明显的indel，通常把引物设计在indel上，但这样就可能导致引物的⼆级结构的⾃由能变⾼，导致扩增效率的下降，但这是不可避免的。
引物⼆级结构的检测：
步骤: 打开oligo 7→输⼊模版序列→关闭⼦窗⼝→保存→将引物定位到模版上，按ctrl+D设定引物长度→分析各种⼆级结构，例如⾃⼆聚体，异⼆聚体，发卡，错配等。图4中最后两张图⽚为引物测试结果，前引物结果较好，没有明显的⼆聚体和发卡结构，没有连续的互补碱基，且⾃由能绝对值也⼩于4.5，⽽后引物则出现了连续6碱基互补，⾃由能为8.8；另外在3’端也出现了较为严重的⼆聚体话，出现了连续4碱基的⼆聚体，虽然⾃由能不⾼，但3’的⼆聚体化可以严重的影响扩增特异性和扩增效率。此外还需要对发卡及异⼆聚体，错配进⾏检查。
Fig3 oligo7 检测结果
扩增效率检测：
PCR反应的扩增效率严重的影响到PCR的结果，同样在qRT-PCR中，扩增效率对定量的结果尤为重要，除去反应液（reaction buffer）中其他物质及机器和protocol带来的影响，引物的质量对于qRT-PCR的扩增效率影响也⾮常⼤，为了保证结果的准确性，⽆论是相对荧光定量还是绝对荧光定量均需要对引物的扩增效率进⾏检测，⽽公认的有效的qRT-PCR的扩增效率为85%-115%之间有两种⽅法：
1.标准曲线法:
a.将cDNA混合
b.梯度稀释
c.qPCR
d.线性回归⽅程计算扩增效率
2.LinRegPCR
LinRegPCR is a program for the analysis of real time RT-PCR Data,also called quantitative PCR(qP
CR)data based on SYBR Green or similar chemistry. The program uses non-baseline corrected data,performs a baseline correction on each sample separately,determines a window-of-linearity and then uses linear regression analysis to fit a straight line through the PCR data set. From the slope of this line the PCR efficiency of each individual sample is calculated. The mean PCR efficiency per amplicon and the Ct value per sample are used to calculate a starting concentration per sample,expressed in arbitrary fluorescence units. Data input and output are through an Excel spreadsheet.
只需要混样，不需要做梯度
步骤:
步骤: (以伯乐CFX96为例，不太清楚ABI的机器)
实验：为标准qPCR实验。
实验：
qPCR 数据输出 : LinRegPCR 可以识别两种形式的输出⽂件形式：RDML或者quantification Amplification result.实际上就是机器对循环数qPCR 数据输出 :
和荧光信号的实时检测值，通过对线性区段的荧光变化值分析得出扩增效率。
数据选择
数据选择：理论上RDML值应该是可以⽤的，估计是我电脑的问题软件并不能识别RDML，所以我已excel输出值作为原始数据，建议先对数据进⾏粗筛选，例如加样失败的等造成的点可以在输出的数据中删掉（当然不删也可以，LinRegPCR后期会对这些点进⾏忽略）
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