付翠翠;梁丽佳;齐国华;徐抒平;徐蔚青
【摘 要】Biomolecule-assisted surface-enhanced Raman scattering ( SERS ) sensing is a technique using biological molecules as sensitive components or detected objects, which is one of the most important tools in the studies of biological molecules. SERS biosensing is widely used in environmental monitoring, food-safety, clinical testing, disease diagnosis, and many other areas. This paper summarizes the progresses on the application of SERS technique in the fields of the analysis and diagnosis of cancer. The contents mainly consist of three parts:(1) SERS biosensing technology based the new coupling mechanisms, involving SPR-coupling, waveguide-coupling and LSPR-PSPR coenhancement; ( 2 ) preparation and application of highly sensitive SERS chips;and (3) new SERS technology for investigating cancer cells and bio tissues.%表面增强拉曼散射( SERS)生物传感技术是以生物成分为敏感元件或探测对象，研究生物分子间相互作用的重要工具之一，被广泛应用于环境监测、食品安全、临床检验及疾病诊断等众多领域。本文总结了耦合增强SERS生物传 感技术方面的进展及其在分析检测和癌症诊断方面的应用。主要包括基于耦合增强SERS 生物传感技术方法、高灵敏度的SERS传感芯片的制备及其应用和新型SERS技术研究癌细胞及组织。
【期刊名称】《高等学校化学学报》
【年(卷),期】2015(000)011
【总页数】14页(P2134-2147)
【关键词】表面增强拉曼散射;生物传感;SERS芯片;免疫反应;癌症
【作 者】付翠翠;梁丽佳;齐国华;徐抒平;徐蔚青
【作者单位】吉林大学理论化学研究所，超分子结构与材料国家重点实验室，长春130012;吉林大学理论化学研究所，超分子结构与材料国家重点实验室，长春130012;吉林大学理论化学研究所，超分子结构与材料国家重点实验室，长春130012;吉林大学理论化学研究所，超分子结构与材料国家重点实验室，长春130012;吉林大学理论化学研究所，超分子结构与材料国家重点实验室，长春130012
【正文语种】中 文
【中图分类】O657.37
生物传感技术是指由生物成分为敏感元件,以分子识别功能检测被测目标的某种物理或化学变化,并将生物材料的持续、有规律的信息以光学、电化学、电磁学等方式展示出来[1].根据分子识别元件不同,生物传感可分为免疫传感、酶传感、核酸传感和细胞传感等；根据信号转换方式的不同,生物传感可分为电化学传感、光学传感、表面等离激元传感和表面增强拉曼传感等.
拉曼光谱属于分子振动光谱,可以反映分子的特征结构.拉曼光谱分析法是基于印度科学家Raman所发现的拉曼散射效应[2],对于入射光频率产生频移的散射光谱进行分析,以得到分子振动、转动方面的信息,并应用于分子结构研究,是一种原位、实时检测的技术.拉曼光谱可用于水溶液体系,特别适合于生物样品的研究；谱峰清晰尖锐,有较高的能量分辨率,可以提供有关分子的结构、构象以及分子间相互作用等多方面的信息,更适合定性分析及具有不需要对样品进行前处理等优点.但由于拉曼散射的效率极低(散射截面极小),因此常规拉曼在应用上存在很大局限性.直到20世纪70年代,Fleischmann等[3]发现当吡啶分子吸附在粗糙的
银电极表面时会导致拉曼信号强度大幅增加的现象.随后,Van Duyne等[4]在电极表面获得的增强因子可达105～106.这种与粗糙表面相关的拉曼增强效应被称为表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman Scattering,SERS)效应.由此SERS光谱被广泛用于表面、吸附界面表面状态、生物分子的界面取向、构型、构象等研究及结构分析等.
SERS技术被广泛应用于生物传感检测领域,它以生物成分为敏感元件或探测对象,研究生物分子间相互作用.胡继明等[5]将SERS生物传感技术用于检测DNA；顾仁傲、姚建林等[6～9]也将该技术用于研究结构复杂的蛋白质以及多组分的免疫反应；任斌等[10,11]进一步将SERS生物传感研究扩展到了细胞和生命系统中.但该领域的研究还存在一定的问题和挑战[12].首先,由于生物分子结构复杂导致其光谱解析存在一定难度；另外,对于复杂的生命体,来自细胞内各部分(如细胞器,细胞骨架等)的弹性散射可能发生在所有方向上,因而在SERS检测上产生显著的背景信号；此外,SERS生物传感技术多与荧光标记法相结合,通过金属纳米材料来猝灭荧光,如果荧光染料不与SERS基底直接接触,便会导致荧光背景；最后,干扰物种以及非特异性结合也可能掩盖被测物的SERS信号.目前,随着SERS基底制备技术和组装方法的不断完善,SERS生物传感技术正在逐步走向成熟.
本文结合本研究组的工作,综述SERS生物传感技术及其应用方面的研究进展,主要包括:(1)耦合表面等离激元共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)增强SERS技术及其生物传感,包括“热点”结构增强SERS及其应用,光波导耦合金属纳米粒子局域表面等离激元共振(Localized Surface Plasmon Resonance,LSPR)以及SPR-SERS用于免疫识别检测.(2)高灵敏度的SERS传感芯片的制备及应用.包括以微流控与SERS技术结合的芯片传感技术和以SERS基底为芯片的葡萄糖传感器.(3)新型SERS技术研究癌细胞及生物组织切片.涉及药物作用机理分析、疾病诊断和等,研究肿瘤细胞在药物作用下的核内结构变化、生物组织切片的光谱用于癌症分型等,为SERS技术用于癌症早期诊断和药物药理研究提供科研基础.
1.1 耦合表面等离激元共振增强SERS的生物传感技术
表面等离激元共振(SPR)是通过检测目标分子对等离激元共振峰进行定性与定量检测,而表面增强光谱则是利用纳米结构的巨大表面电磁场增强效应来直接探测表面分子,并可确定分子的结构和取向.Otto等[13]将衰减全反射(Attenuated Total Reflection,ATR)方法应用于提高传统拉曼光谱的灵敏度,采用Otto装置,研究了ATR-SPP方法对于增强吸附在金、银、铜
金属表面的单分子层的拉曼信号.祁志美等[14]利用Kretschmann棱镜耦合结构和532 nm激光光源测试了金银合金薄膜的表面增强拉曼散射效应.Chen等[15]采用ATR方法,将纳米金嵌入介质传感薄膜,开发出一种将SPR和SERS集成的生物传感器.这种多功能的设备能有效地研究生物分子识别的机制.我们研究组设计和构建了SPRSERS显微拉曼光谱仪[16],既可以获得SPR谱图,又可以改变激发角度,在同一微区的暗背景下,同步观测与之相关的增强拉曼信号.由于可以方便地改变入射角度,因此在优化的入射角度下对被检测物进行激发,从而得到最强的SERS光谱信号,实现了SPR和SERS的双道检测.利用棱镜型SPR结构提高入射光收集效率,再进一步利用金属纳米粒子的LSPR耦合提高发射效率[17].该方法利用SPR结构在金属膜与纳米粒子的间隙处构成强局域电场,测量生物素/亲和素的识别反应,既可利用SPR谱证明生物分子层层组装的有效性,又可在暗背景下同时获得与之相关的SERS谱图[18].
图1显示了采用层层组装法(Layer-by-layer)进行亲和素/生物素识别体系的组装流程.通过SPR-SERS光谱探讨层层组装与SPR角度的变化关系[图2(A)].
由图2(A)可见,银溶胶的加入使SPR灵敏度提高了2.5倍.由于生物素自身的拉曼信号很弱,本
实验采用荧光染料标记的方法进行SERS检测.实验中所用的荧光染料为Atto610,最大吸收峰在614 nm处,发射峰在634 nm处,而实验中采用的激发波长为532 nm,能有效消除荧光干扰.同时,银纳米粒子的加入不仅能猝灭荧光,而且进一步增强了拉曼信号.图2(B)给出了银溶胶增强条件下SPR和SERS的关系.随着入射角度不断增大,SERS信号强度逐渐增大,当入射角度在SPR共振角附近时,Atto610的SERS强度最大.因此可以通过优化SPR角度,获得最佳的SERS信号.在该体系中,通过SPR耦合以及消失场下LSPR与PSPR(Propagating Surface Plasmon Resonance)耦合,不仅增强了SPR传感的灵敏度,而且增强了SERS的灵敏度,使其可以有效监测生物分子的识别过程.
此外,SPR-SERS技术可以进一步应用到对酶蛋白的检测中.利用自行搭建的SPR-SERS光谱装置[18]检测胰凝乳蛋白酶催化裂解小肽反应过程,检测胰凝乳蛋白酶活性及专一性(图3)[19].该方法的独特之处在于既能够实时地对胰凝乳蛋白酶及其底物识别过程进行检测,又可以同步获得增强的SERS信号,并且该方法可以扩展到其它的酶催化反应体系,对于检测酶活性具有重要的应用价值.
如图3所示,一段包含有SERS活性氨基酸和巯基末端小肽(SH-Lys-Thr-Val-Ser-Tyr-Gly-Cys)
通过巯基自组装到银膜上,经过胰凝乳蛋白酶的催化裂解反应后,小肽在特定的位置(Tyr的羧基处)处被切断,SERS活性部分脱离金属膜表面,导致SERS信号减弱甚至消失.
图4为经过不同浓度的酶催化反应之后,基底上检测到的小肽的SERS信号.当胰凝乳蛋白酶的浓度增大时,底物的信号逐渐减弱,胰凝乳蛋白酶的浓度最低可达0.4 nmol/L.因此,基于酶催化体系的SPR-SERS方法对胰凝乳蛋白酶的检测具有高度选择性,结果如图5所示.
1.2 金属纳米粒子与金属膜之间的“热点”增强SERS效应
“热点”即基底上产生非常强的增强因子的区域,在SERS信号的增强中占有主导地位.Fang等[20]报道了沉积在纳米球阵列上的银纳米粒子膜基底上的SERS“热点”出现的几率为0.0063%,而“热点”对SERS总体信号的贡献却可达24%.形成“热点”的方式一般有金属纳米粒子聚集体、金属纳米粒子与金属膜之间、金属针尖等[21～23].“热点”的形成与纳米结构间隙(Nanogap)大小有关[24],其纳米尺度的微小变化,就会引起SERS增强上的极大变化.此外,若将被测物置于间隙处,可以进一步提高SERS的增强效果[25].为了使这种Nanogap结构更具功能性,人们将一些生物分子(如抗原/抗体,生物素/亲和素,DNA等)用作桥连分子,研究其识别作用.其中,核酸适配体(Aptamer)具有独特的优势.核酸适配体是利用指数富集配体系统进
化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)技术从人工合成的寡核苷酸文库中筛选得到的寡核苷酸链.它能够与靶分子特异结合,并通过构象的互补作用、芳香化合物的堆砌作用、带电基团的静电及氢键等作用与靶分子形成稳定的复合物[26].核酸适配体的靶物质范围相当广泛,可以是低分子量的有机物和无机物,也可以是大分子物质如蛋白质等.
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